戊四氮致癇大鼠腦神經(jīng)型鈣黏附素和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4表達的變化及靈芝孢子粉的干預(yù)作用*

王芳芳, 王淑秋， 邵 帥, 劉 蕾, 劉君星, 馬小茹, 梁衍鋒, 王淑湘, 張建華

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2附屬第二醫(yī)院，3小兒神經(jīng)康復(fù)實驗室,黑龍江 佳木斯 154007)

戊四氮致癇大鼠腦神經(jīng)型鈣黏附素和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4表達的變化及靈芝孢子粉的干預(yù)作用*

王芳芳1,3, 王淑秋1△， 邵 帥2, 劉 蕾1, 劉君星1, 馬小茹1, 梁衍鋒1, 王淑湘1, 張建華1

(佳木斯大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2附屬第二醫(yī)院，3小兒神經(jīng)康復(fù)實驗室,黑龍江 佳木斯 154007)

目的： 觀察戊四氮致癇大鼠腦神經(jīng)型鈣黏附素(N-cadherin)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4)表達的變化及靈芝孢子粉的干預(yù)治療作用，研究癲癇的發(fā)病機制及靈芝孢子粉的作用機制。方法健康雄性Wistar實驗大鼠30只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉治療組，每組10只。模型組和治療組均用致癇亞驚厥劑量的戊四氮(PTZ)腹腔注射制作Wistar大鼠慢性點燃模型。在低溫條件下迅速取腦，通過免疫組化和Western blotting檢測皮質(zhì)和海馬區(qū)N-cadherin和NT-4的變化。結(jié)果實驗性癲癇大鼠模型制作成功，靈芝孢子粉組和癲癇模型組實驗動物均達到點燃標準，與癲癇模型組動物相比，靈芝孢子粉組大鼠潛伏期明顯延長,但持續(xù)時間無顯著差異。免疫組化和Western blotting檢測實驗結(jié)果表明：癲癇模型組實驗大鼠腦海馬和皮質(zhì)N-cadherin含量比正常對照組增高(Plt;0.01)；靈芝孢子粉組N-cadherins含量比癲癇模型組下降(Plt;0.01)。同時癲癇模型組大腦海馬和皮質(zhì)NT-4含量比正常對照組增加(Plt;0.05)；靈芝孢子粉組NT-4含量比癲癇模型組增加(Plt;0.01)。結(jié)論靈芝孢子粉能夠降低N-cadherin的表達，調(diào)整病變神經(jīng)元興奮性，起到抗癲癇作用，還能增強NT-4的表達從而減輕癲癇發(fā)作對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

癲癇； 戊四氮； 神經(jīng)型鈣黏素； 神經(jīng)營養(yǎng)因子-4； 靈芝孢子粉

癲癇(epilepsy,EP)是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥，具有長期性、反復(fù)發(fā)作性和難治性的特點，嚴重危害人類的健康。癲癇發(fā)生機制是由于大腦皮層神經(jīng)細胞過度興奮和(或)過度同步化引起的一系列短暫腦功能失常，是種慢性腦部疾病，具有反復(fù)發(fā)作、突然發(fā)生、突然終止、臨床癥狀表現(xiàn)多樣等特點。目前癲癇的治療仍以藥物為主，但是抗癲癇藥發(fā)展非常緩慢。神經(jīng)型鈣黏附素(N-cadherin)是鈣黏附素家族中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)的成員，是介導(dǎo)Ca2+依賴性細胞與細胞間黏附作用的一種跨膜蛋白，N-cadherin與神經(jīng)再生和突觸重建有直接關(guān)系。林華[1]的研究還發(fā)現(xiàn)，海馬齒狀回內(nèi)分子層N-cadherin可能參與了癲癇后苔蘚纖維出芽的過程。神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(neurotrophin-4,NT-4)是1991年在蜂蛇和非洲蟾蛛中發(fā)現(xiàn)的低分子量堿性蛋白，以二聚體形式存在。研究證實NT-4在促進神經(jīng)元的生長、分化與成熟，維持神經(jīng)元的存活及促進神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生方面發(fā)揮著重要的作用[2]。對NT-4的研究發(fā)現(xiàn)NT-4不但能減輕缺氧缺血性腦損傷,還能維持神經(jīng)元的生長存活及保護神經(jīng)元。這說明N-cadherin及NT-4與癲癇有密切的關(guān)系。靈芝孢子粉(Ganodermalucidumspore powder,GLSP)是靈芝的精髓，作為一種珍貴的中藥材含有大量的氨基酸和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，具有提高免疫調(diào)節(jié)、促進清除自由基、增強機體耐缺氧能力、保護神經(jīng)系統(tǒng)等功能。本文即探討靈芝孢子粉干預(yù)戊四氮致癇大鼠腦組織N-cadherins和NT-4的含量變化,進一步研究癲癇的發(fā)病機制及靈芝孢子粉的作用機制，并為臨床上尋求癲癇腦保護劑和低毒高效治療癲癇的藥物提供新的思路和依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要試劑與儀器

戊四氮(pentetrazol,PTZ)購自Sigma；靈芝孢子粉購自佳木斯市野生靈芝種植基地；兔抗大鼠N-cadherins、堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG抗體、DAB顯色劑、PBS及枸櫞酸鈉緩沖液、β-actin、組織細胞裂解液、BCIP-NBT顯色液、牛血清白蛋白均購自武漢博士德，預(yù)染蛋白marker購自MBI。JA型電子精密天平購自上海衡平科學(xué)儀器有限公司；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購自成都泰盟生物科技公司。高速低溫離心機購自Sigma；EPS-100電泳儀購自上海天能科技有限公司。

2方法

2.1模型制備及動物的處理 健康雄性Wistar大鼠30只，體重180-220 g，由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。大鼠隨機分為3組：正常對照組、癲癇模型組(PTZ)和靈芝孢子粉給藥組(PTZ+GLSP)，每組10 只。參看Morgan等[6]的方法并略加變動。PTZ用前以生理鹽水新鮮配制成溶液(10 g/L)。靈芝孢子粉給藥組和癲癇模型組給予PTZ亞驚厥劑量(35 mg/kg)腹腔注射，每天1次，持續(xù)28 d；正常對照組用等容生理鹽水代替PTZ腹腔注射。靈芝孢子粉給藥組腹腔注射PTZ的同時再經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉(150 mg/kg)(灌胃前禁食6 h)，每天1次，持續(xù)28 d；癲癇模型組和正常對照組同時經(jīng)灌胃給予同體積生理鹽水。停藥1周，再用相同劑量的PTZ測試。

2.2觀察大鼠的行為變化 大鼠癲癇發(fā)作評分標準[5],0級:行為上沒有發(fā)作反應(yīng)；Ⅰ級:節(jié)律性點頭或頭面部抽動；Ⅱ級:點頭甩尾或陣攣性咀嚼；Ⅲ級:頭部顫搐伴隨前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級:袋鼠姿勢和/或多肢抽動；Ⅴ級:全面性持續(xù)強直-陣攣性發(fā)作。每天對每只大鼠在PTZ注射后監(jiān)測30-60 min，并記錄癲癇發(fā)作的級別、發(fā)作潛伏期(s)(即注射PTZ到首次癲癇發(fā)作所需要的時間)及發(fā)作持續(xù)時間(s)，凡出現(xiàn)連續(xù)5 dⅡ級以上癇性發(fā)作的大鼠均為達到點燃模型標準。

2.3免疫組織化學(xué)檢測 動物麻醉后斷頭處死，在低溫條件下迅速取腦，甲醛固定用于免疫組化SABC法檢測皮質(zhì)和海馬區(qū)N-cadherin及NT-4的免疫反應(yīng)性；空白實驗不用Ⅰ抗，以PBS代替，孵育切片。光鏡下觀察，胞質(zhì)和核膜顯示棕黃色顆粒者為N-cadherins免疫反應(yīng)陽性細胞，胞核顯示棕黃色顆粒者為NT-4免疫反應(yīng)陽性細胞。Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件系統(tǒng)分析。

2.4Western blotting檢測 低溫取材海馬組織，稱重，勻漿。4℃條件裂解30min。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清。測定樣品蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。4℃轉(zhuǎn)膜1 h。TBST漂洗3次。平緩搖床，室溫封閉孵育1 h。TBST漂洗3次。Ⅰ抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次。Ⅱ抗37℃平緩搖動孵育1 h。TBST漂洗2次，TBS漂洗1次。BCIP-NBT顯色劑顯色。GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1行為學(xué)觀察

癲癇組和靈芝孢子粉組實驗動物在實驗過程中發(fā)現(xiàn)均有連續(xù)多次 Ⅱ- Ⅴ級驚厥發(fā)作，全部達到點燃標準。癲癇組實驗動物在注射戊四氮后 2 - 6 min內(nèi)即開始發(fā)作，最先出現(xiàn)瞼肌陣攣、點頭運動、尾巴翹起，嚴重者繼之雙前肢抬起陣攣,隨后出現(xiàn)四肢抽搐，部分動物出現(xiàn)翻滾、跳躍 ，每次發(fā)作持續(xù) 1-30 min不等，常反復(fù)發(fā)作。靈芝孢子粉組初期動物發(fā)作與癲癇組相仿,但潛伏期較癲癇組稍長 3 min左右，實驗后期，用藥組發(fā)作時間明顯縮短，發(fā)作級別降低，少有大發(fā)作。

2各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)N-cadherin含量免疫組化染色變化

測定實驗大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)N-cadherin積分吸光度變化，實驗結(jié)果表明，正常對照組：海馬和皮質(zhì)區(qū)均有少量N-cadherins分布，但分布不均衡，海馬區(qū)表達高于皮質(zhì)；癲癇模型組：與空白組比較，差異顯著(Plt;0.01);靈芝孢子粉組：海馬和皮質(zhì)區(qū)N-cadherin蛋白表達明顯下降，與模型對照組相比，差異顯著(Plt;0.01)，見圖1、表1。

Figure 1.Immunohistochemical staining (×200) of N-cadherin in brain hippocampus(A,B,C) and cortex (D,E,F).A,D：control group; B,E:PTZ group; C,F: PTZ+GLSP group.

表1 各組大鼠腦組織中N-cadherin積分吸光度變化

3腦組織NT-4含量變化

測定實驗大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)NT-4積分吸光度變化，實驗結(jié)果表明，癲癇模型組明顯高于正常對照組，差異顯著(Plt;0.01)，靈芝孢子粉治療組高于癲癇模型組，差異顯著(Plt;0.01)，見圖2、表2。

4Westernblotting檢測大鼠腦組織N-cadherin和NT-4蛋白含量的變化

Western blotting檢測顯示，癲癇后N-cadherin表達明顯高于對照組，差異顯著(Plt;0.01) ；用靈芝孢子粉干預(yù)后，N-cadherin的表達明顯下降，差異顯著(Plt;0.01)，見圖3、4。癲癇后NT-4表達明顯高于對照組，差異顯著 (Plt;0.05) ；用靈芝孢子粉干預(yù)后，NT-4表達較癲癇組明顯升高，差異顯著(Plt;0.01)。

Figure 2.Immunohistochemical staining(×200) of NT-4 in brain cortex (A,B,C) and hippocampus(D,E,F).A,D:control group; B,E:PTZ group;C,F: PTZ+GLSP group.

表2 各組大鼠腦組織NT-4積分吸光度變化

討 論

N-cadherin在神經(jīng)元是有選擇性的分布，正常時在海馬和皮層表達相對較高而在紋狀體表達較低。Fujita等[7]在海人藻酸(kainic acid,KA)誘導(dǎo)的驚厥模型中發(fā)現(xiàn)注射KA后12-24 h，N-cadherin mRNA的表達隨著神經(jīng)元的減少而減少，而在48 h至7 d，mRNA的表達部分恢復(fù)；而免疫組化染色顯示KA注射后48 h，N-cadherin蛋白在存活神經(jīng)元中的表達明顯增高。我們的實驗結(jié)果與其相符，PTZ點燃癲癇發(fā)作后N-cadherin的表達高于正常對照組，說明N-cadherin在癲癇后與海馬內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽和突觸重塑有密切關(guān)系。

NT-4對神經(jīng)元有促進存活、生長和分化作用，對保護海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元抵抗興奮毒素和代謝損傷起著重要作用，對此，Royo等[8]在大鼠外傷性腦損傷的治療實驗中獲得證實，長期應(yīng)用NT-4能抑制50％海馬神經(jīng)元的死亡。因此它對癲癇和創(chuàng)傷性腦損傷等有神經(jīng)變性的常見疾病起著至關(guān)重要的作用。在本實驗癲癇模型組中，戊四氮誘導(dǎo)大鼠癲癇后NT-4的表達高于正常對照組，我們認為NT-4在癲癇后對神經(jīng)起到保護作用。

靈芝孢子粉具有提高免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強機體耐缺氧能力等功能，并且對神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護作用，因此可能通過調(diào)節(jié)機體的免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)作用于受損傷的神經(jīng)元、激活機體內(nèi)在的抗損傷機制。國內(nèi)外有關(guān)靈芝孢子抗癲癇作用機制實驗研究報道甚少,本科室已做了相關(guān)這方面的研究并取得了良好效果[9,10]。本實驗中靈芝孢子粉干預(yù)組的實驗動物癲癇發(fā)作級別和時間較癲癇模型組均有所下降,說明靈芝孢子粉對癲癇有一定的治療效果。實驗結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作后應(yīng)用靈芝孢子粉能抑制N-cadherin的升高，促進NT-4的表達。所以推測靈芝孢子粉對癲癇既有預(yù)防作用，又有治療作用。其可以提高神經(jīng)細胞的存活，確保腦內(nèi)微環(huán)境持續(xù)穩(wěn)態(tài)而起到良好的抗癲癇作用，同時又減緩因癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，增強內(nèi)源性神經(jīng)保護機能,促進受損神經(jīng)元恢復(fù)，從而發(fā)揮對腦的保護作用。但是靈芝孢子粉抑制N-cadherin增加、促進NT-4表達的具體機制尚需進一步的研究。由于靈芝孢子粉的成份非常復(fù)雜,而且是口服給藥，因此繼續(xù)深入探索靈芝孢子粉治療癲癇的藥效機制，完善其藥用價值必將對臨床和科研有重大意義和價值。

Figure 3.Expression of NT-4 and N-cadherin proteins in cortex (Western blotting).±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs PTZ group.Lane 1: PTZ+GLSP group;Lane 2: control group;Lane 3: PTZ group.

Figure 4.Expression of NT-4 and N-cadherin proteins in hippocampus (Western blotting).±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs PTZ group.Lane 1:PTZ+GLSP group;Lane 2: control group;Lane 3: PTZ group.

[1]林 華.海馬苔蘚纖維出芽及突觸重組與癲癇發(fā)生的相關(guān)性研究[D]．西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2005．

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EffectsofGanodermalucidumsporepoweronexpressionofN-cadherinandneurotrophin-4inthebrainsofepilepticrats

WANG Fang-fang1,WANG Shu-qiu1,SHAO Shuai2,LIU Lei1,LIU Jun-xing1,MA Xiao-ru1,LIANG Yan-feng1,WANG Shu-xiang1,ZHANG Jian-hua1

(1DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicine,2TheSecondAffiliatedHospital,3LaboratoryofPediatricNeurologyRehabilitation,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China.E-mail:wang_shuq@163.com)

AIM: To observe the effects ofGanodermalucidumspore powder (GLSP) on the content of N-cadherin and neurotrophin-4(NT-4) in the brains of rats with epilepsy induced by pentetrazole (PTZ).METHODSThirty male Wistar rats were divided into 3 groups: GLSP group,epilepsy model group and control group (with 10 rats in every group).The epilepsy igniting model was induced by intraperitoneal injection of PTZ in the rats.The rats were killed and the brains were quickly collected at low temperature.The content of N-cadherin and NT-4 in cerebral cortex and hippocampus was measured with immunohistochemical staining and Western blotting.RESULTSThe rats in GLSP group and epilepsy model group all reached the “igniting” standard.Compared with epilepsy model group,the latent period in GLSP group extended obviously,but the duration was not obviously changed.Compared with control group,the content of N-cadherin and NT-4 in cortex and hippocampus increased obviously in epileptic model group.The content of N-cadherin was lower and the content of NT-4 was higher in GLSP group than those in epileptic model group (Plt;0.01).CONCLUSIONGanodermalucidumspore powder attenuates the noxious injury by overexpression of N-cadherin and regulation of neuronal excitability in central nervous system in the rats,thus preventing the neural cells from the damages of epilepsy.Ganodermalucidumspore powder also increases the expression of NT-4 to relieve seizure.

Epilepsy; Pentetrazole; N-cadherins; Neurotrophin-4; Ganoderma lucidum spores

1000-4718(2011)05-1003-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.033

2010-10-13

2011-03-16

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(No.D200803)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81041116)

△通訊作者Tel：0454-8618518；E-mail：wang_shuq@163.com