miR-210對血管內(nèi)皮細胞VEGF-Notch信號通路的調(diào)控*

婁遠蕾， 劉 芬， 高法梁， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 鄧志鋒△， 汪 泱△

(南昌大學1第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，2第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

miR-210對血管內(nèi)皮細胞VEGF-Notch信號通路的調(diào)控*

婁遠蕾1▲， 劉 芬1▲， 高法梁2， 阮瓊芳1， 崔蘇萍1， 鄧志鋒2△， 汪 泱1△

(南昌大學1第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，2第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

目的： 觀察過表達miR-210對血管內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-Notch信號通路相關分子表達的影響，探討miR-210調(diào)控血管新生的分子機制。方法采用常規(guī)方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVE-12)。通過轉(zhuǎn)染LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體上調(diào)內(nèi)皮細胞miR-210表達，實驗分為miR-210過表達組(LV- miR-210-GFP)和對照組(LV-GFP)。采用real-time PCR檢測miR-210的表達變化，流式細胞術檢測ephrin-A3的表達，采用real-time PCR、Western blotting、免疫熒光細胞化學染色法分別檢測VEGF-Notch信號通路相關分子VEGF、VEGF 2(VEGFR 2)、Notch1的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-210過表達組miR-210表達水平上調(diào)了(32.10±1.26)倍；流式細胞術結(jié)果顯示，miR-210過表達組陽性細胞率[(73.22±1.45)％]較對照組[(12.52±0.67)％]明顯增加(Plt;0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-210過表達組 VEGF、VEGFR2、Notch1 mRNA分別較對照組上調(diào)了(7.40±0.67)、(2.50±0.10)、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05；免疫熒光結(jié)果顯示，miR-210過表達組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號均顯著強于對照組(Plt;0.05)。Western blotting 結(jié)果顯示，miR-210過表達組血管內(nèi)皮細胞中Notch1的蛋白表達量(4.22±0.60)較對照組明顯升高(Plt;0.05)。結(jié)論miR-210過表達可顯著上調(diào)VEGF-Notch信號通路分子的表達水平。

miR-210； 血管內(nèi)皮細胞； 血管內(nèi)皮生長因子； Notch1

缺血性損傷是器官衰竭的主要誘因，盡快促進血管新生、恢復有效血供是修復損傷的關鍵。血管新生受多種細胞因子的調(diào)控，主要是一些促血管生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族、肝細胞生長因子、血管生成素、內(nèi)皮素-1、轉(zhuǎn)化生長因子-α等，其中VEGF是重要的調(diào)控因子[1-3]。研究表明，VEGF可誘導動脈內(nèi)皮細胞上Notch1 的表達，參與新生血管的形成[4]。但VEGF-Notch信號通路的上游調(diào)控因子仍所知甚少。微小RNA(microRNA,miRNA)對血管新生亦有重要的調(diào)控作用。研究報道，miR-210是缺氧誘導miRNA，在缺氧條件下，miR-210在內(nèi)皮細胞的表達上調(diào)，并能促進毛細血管樣結(jié)構形成及細胞遷移[5]。生物學軟件預測miR-210可調(diào)控VEGF[6]，然而miR-210對血管新生可能的調(diào)控途徑及機制尚不清楚。

為進一步探討miR-210調(diào)控血管新生的機制，本研究通過過表達血管內(nèi)皮細胞miR-210，觀察VEGF-Notch信號通路相關分子的變化，以明確miR-210對VEGF-Notch信號通路的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVE-12)購自長沙贏潤生物技術有限公司。

1.2主要試劑 Trizol reagent(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；PE標記Ⅱ抗(Abcam)；VEGF抗體、血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)抗體、Notch1抗體、ephrin-A3抗體和羅丹明標記Ⅱ抗均購自Santa Cruz。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) 以1×109/L HUVE-12細胞接種于培養(yǎng)瓶中，在含15％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中置于37 ℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。細胞貼壁生長呈鵝卵石樣；細胞增殖至約80％融合時，0.25％EDTA胰蛋白酶消化傳代。

2.2重組慢病毒的構建及轉(zhuǎn)染 針對目標序列，設計合適的PCR引物；將合成的2條引物，進行退火，將目標載體與引物退火產(chǎn)物分別進行雙酶切。將純化回收的酶切產(chǎn)物進行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，其上、下游引物都設計在載體上，PCR鑒定為陽性克隆，證明目的片段已經(jīng)定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構建成功的質(zhì)粒載體。

轉(zhuǎn)染前24 h以3.0×108/L密度將內(nèi)皮細胞種至6孔板。以感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為10加入0.75 μL病毒原液(終濃度為3.0×109cell/L)，每孔中加入Polybrene，終濃度為5 mg/L。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，估算細胞轉(zhuǎn)染效率。實驗分為miR-210過表達組(LV- miR-210-GFP轉(zhuǎn)染組)與對照組(LV-GFP轉(zhuǎn)染組)。

2.3實時定量PCR法檢測miR-210及VEGF、VEGFR2、Notch1基因的表達變化 轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測定儀測A260/A280，要求在1.8-2.0之間，同時1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。參考文獻[7]，采用stem-loop引物進行miR-210逆轉(zhuǎn)錄，反應條件如下：16 ℃ 30 min,30 ℃,30 s,42 ℃,30 s,50 ℃,1 s,共60個循環(huán)；70 ℃ 15 min。以U6為內(nèi)參照。普通基因表達檢測以GAPDH為內(nèi)參照。采用SYBR Green I qPCR方法進行擴增，檢測系統(tǒng)為ABI 7500 real-time PCR system，反應條件如下：95℃,10 min,95 ℃,15 s,60 ℃,30 s，40個循環(huán)。最后行融解曲線分析。每個樣本設3個重復管，同時設無模板陰性對照。基因表達的相對變化以2-ΔΔCt表示。

2.4流式細胞學檢測ephrin-A3表達變化 消化細胞，調(diào)整密度為2.5×105cells/50 μL的PBS細胞懸液，加入多聚甲醛固定，加入Ⅰ抗2.5 μL，加入PE標記的Ⅱ抗1 μL，避光保存待上機檢測。

2.5免疫熒光染色法檢測VEGF和VEGFR2的表達變化 將細胞種植在蓋玻片上，約生長密度在60％取出。以1％牛血清白蛋白封閉，加Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，加Ⅱ抗(1∶200)，37 ℃下避光反應50 min，DAPI染色5 min，50％甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每張蓋玻片選取5個不重疊的視野于同一曝光度下拍照，采用Image J軟件半定量比較兩組紅色熒光吸光度平均值。

2.6Western blotting檢測Notch1的表達變化 收集內(nèi)皮細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白并進行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣，PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜2 h，5％脫脂奶粉室溫封閉1 h。加Ⅰ抗(1∶1 000大鼠抗人Notch1)，37 ℃孵育2 h，TBST緩沖液洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，BST緩沖液洗膜，ECL試劑顯影。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后miR-210表達水平明顯上調(diào)

重組慢病毒轉(zhuǎn)染至HUVE-12后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，GFP陽性率在80％以上。Real-time PCR 結(jié)果顯示，LV- miR-210-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后，與對照組比較，miR-210上調(diào)了(32.10±1.26)倍,Plt;0.05,見圖1。這表明LV- miR-210-GFP的重組慢病毒轉(zhuǎn)染可過表達miR-210。

2miR-210可抑制內(nèi)皮細胞ephrin-A3的表達

流式細胞學結(jié)果顯示，miR-210過表達組和對照組ephrin-A3陽性細胞率分別為(12.52±0.67)％和(73.22±1.45)％，miR-210轉(zhuǎn)染后ephrin-A3陽性細胞明顯減少，Plt;0.05,見圖2。這表明miR-210的上調(diào)可抑制其靶基因ephrin-A3的蛋白表達。

Figure 1.MiR-210 overexpression in HUVE-12 cells.miR-210 expression was significantly up-regulated after LV-miR-210-GFP transfection±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 2.The expression of ephrin-A3 protein after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Flow cytometry analysis showed that ephrin-A3 protein was down-regulated compared to LV-GFP group;A:LV-GFP group;B: LV- miR-210-GFP group; C：percentage of ephrin-A3-positive cells .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

3miR-210可促進血管內(nèi)皮細胞VEGF、VEGFR2、Notch1mRNA的表達

Real-time PCR 結(jié)果顯示，miR-210過表達后， VEGF、VEGFR2、Notch1較對照組分別上調(diào)了(7.40±0.67)倍、(2.50±0.10)倍、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05,見圖3。表明miR-210可上調(diào)血管內(nèi)皮細胞VEGF-Notch信號通路相關分子的mRNA表達水平。

4miR-210可促進血管內(nèi)皮細胞VEGF、VEGFR2、Notch1蛋白的表達

免疫細胞化學熒光染色結(jié)果顯示，VEGF、VEGFR2陽性紅色熒光信號位于細胞胞漿和胞膜，與對照組比較，miR-210過表達組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號均顯著增強，通過Image J軟件半定量分析，VEGF和VEGFR2熒光吸光度值明顯增加(Plt;0.05)，見圖4。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-210過表達組血管內(nèi)皮細胞中Notch1的蛋白表達條帶信號增強，通過Image J軟件半定量分析，miR-210過表達組蛋白表達量為4.22±0.60，對照組蛋白表達量為1，兩組比較有顯著差異(Plt;0.05),見圖5。

Figure 3.The expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 mRNA after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.RT-PCR showed that mRNA expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 was all up-regulated compared to LV-GFP group .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 4.The protein expression of VEGF and VEGFR2 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.The result of immunofluorescence showed the protein expression of VEGF and VEGFR2 was up-regulated compared to LV+GFP group.A:VEGF (LV-GFP group);B: VEGF(LV- miR-210 -GFP group);C: VEGFR2(LV-GFP group);D: VEGFR2 (LV- miR-210 -GFP group).Bar=50um.E：VEGF and VEGFR2 protein fold change±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

Figure 5.The expression of Notch1 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Western blotting showed that Notch1 was up-regulated compared to LV+GFP group±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

討 論

近年研究表明，miRNA對血管新生具有重要的調(diào)控作用[8]。眾所周知，臟器缺血可誘發(fā)反應性血管新生(angiogenesis)，即在原有血管的基礎上，內(nèi)皮細胞增殖、遷移和重塑形成新血管[9]。通過促血管新生來修復缺血性損傷已成為國內(nèi)外新的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，miR-210是缺氧誘導miRNA。缺氧時，miR-210在內(nèi)皮細胞中的表達上調(diào)，并促進毛細血管樣結(jié)構形成及細胞遷移，而抑制miR-210能阻斷血管新生[5]。我們的前期研究表明，腦缺血后皮質(zhì)區(qū)miR-210表達穩(wěn)定上調(diào)[10]；小鼠腎缺血后miR-210亦表達上調(diào)，其靶基因ephrin-A3蛋白顯著下調(diào)[11]，但miR-210對缺血/缺氧后血管新生可能的調(diào)控機制尚不清楚。故本研究通過在血管內(nèi)皮細胞過表達miR-210，探討其對血管新生相關信號分子的影響。

在血管生成過程中，VEGF是最重要的調(diào)控因子。研究表明，VEGF作為Notch信號的上游調(diào)控因子，可誘導動脈內(nèi)皮細胞上Notch1和DLL4(Notch配體)的表達，從而促進血管的發(fā)育[4]。miR-210能否對VEGF-Notch信號通路起調(diào)控作用，對于闡明缺血后血管新生的機制具有重要意義。

通過生物學軟件預測，miR-210可調(diào)控VEGF[6]。有研究證實miR-210可影響內(nèi)皮細胞對VEGF的敏感性[5]。但miR-210對Notch信號分子的影響尚未見報道。本研究過表達血管內(nèi)皮細胞的miR-210，觀察VEGF-Notch信號通路相關分子表達的變化。研究結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-210過表達組miR-210顯著上調(diào)，其靶基因ephrin-A3的陽性細胞數(shù)明顯減少，證實LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體可介導穩(wěn)定過表達miR-210； VEGF、VEGFR2、Notch1基因及蛋白表達水平較對照組顯著上調(diào)，說明miR-210過表達可顯著上調(diào)VEGF-Notch信號通路相關分子的表達水平。提示miR-210可通過VEGF-Notch信號通路參與血管新生的調(diào)控過程，為闡明miR-210調(diào)控血管新生的分子機制提供了實驗依據(jù)。

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控制人類誘導多能干細胞多能性和決定早期細胞命運的信號通路

胚胎源性人類多能干細胞和重編程的(reprogrammed)體細胞來源的人類多能干細胞的共同特征包括無限增殖和持久、廣泛地向各種類型細胞分化的潛能。但是在維持細胞多能性和調(diào)控細胞分化方面，這兩種來源的細胞是否依賴相似的機制仍然存在爭議，而在這些機制中出現(xiàn)任何一點差異都將會導致經(jīng)重編程的成纖維細胞產(chǎn)生的多能誘導干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的多能性發(fā)生異常改變。在此情況下，目前用于促使人類胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)擴增和分化的方法可能并不能直接適用于人類iPSCs的擴增和分化。歐洲科學家發(fā)現(xiàn)，人類iPSCs依賴activin/nodal/TGFβ信號通路，控制同源蛋白轉(zhuǎn)錄因子Nanog表達，從而維持其多能性(人類ESCs也同樣依賴該信號通路)。由此可見，人類iPSCs維持自身多能性的機制與人類ESCs的機制相似。同時，他們還證實，在人類ESCs特異地分化為胚外組織、神經(jīng)外胚層及中胚層的過程中，充足的生長因子是其必要條件，而這些生長因子同樣可以促使人類iPSCs分化為以上各組織。以上實驗為了避免可能出現(xiàn)的干擾發(fā)育機制分析的因素，是在純粹的化學合成的培養(yǎng)基中進行的，而且實驗獲得的某些組織與今后臨床應用需要的并不完全相同。綜上所述，人類iPSCs維持自身多能性和調(diào)控自身分化所依賴的機制與人類ESCs的機制相似，也可以說這些不同類型的多能細胞在功能方面是等同的。

Stem Cells,2009,27(11):2655-2666(李麗娜)

RegulatoryeffectofmiR-210overexpressiononVEGF-Notchsignalingpathway

LOU Yuan-lei1,LIU Fen1,GAO Fa-liang2,RUAN Qiong-fang1,CUI Su-ping1,DENG Zhi-feng2,WANG Yang1

(1InstituteofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofNeurosurgery,TheSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wangy63cn@sina.com)

AIM: To explore the potential mechanism of angiogenesis by investigating the regulatory effect of miR-210 overexpression on vascular endothelial growth factor(VEGF)-Notch signaling pathway.METHODSMiR-210 overexpression was induced in human umbilical vein endothelial(HUVE-12) cells by lentivirus transfection.The HUVE-12 cells were divided into 2 groups: miR-210 overexpression group (LV-miR-210-GFP) and control group (LV-GFP).The change of ephrin-A3 protein was detected by flow cytometry analysis.The mRNA and protein levels of VEGF-Notch signaling molecules,VEGF,VEGF receptor 2(VEGFR 2)and Notch 1,were determined by the methods of real-time PCR,immunofluorescence and Western blotting.RESULTSCompared to the control cells,significant down-regulation of ephrin-A3 protein was observed in HUVE-12 cells with miR-210 overexpression,while both mRNA and protein levels of VEGF,VEGFR2 and Notch1 were up-regulated.CONCLUSIONmiR-210 may be involved in VEGF-Notch signaling pathway to regulate angiogenesis.

miR-210; Vascular endothelial cells; Vascular endothelial growth factors; Notch1

1000-4718(2011)05-0923-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.017

2010-11-24

2011-03-09

國家自然科學基金資助項目(No.30960396；No.81060059)

△通訊作者 鄧志鋒 Tel：0791-6282662;E-mail:dengzf@126.com； 汪泱 Tel:0791-8692527；E-mail:wangy63cn@sina.com

▲并列第1作者