α7煙堿樣乙酰膽堿受體拮抗劑減輕淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的機制研究*

汪志剛， 戚仁斌， 李 衛(wèi)， 朱麗紅， 沈文娟， 張 晶， 趙彥儒， 陸大祥△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院危重病醫(yī)學(xué)科，3附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

α7煙堿樣乙酰膽堿受體拮抗劑減輕淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的機制研究*

汪志剛1,2， 戚仁斌2， 李 衛(wèi)3， 朱麗紅2， 沈文娟2， 張 晶2， 趙彥儒2， 陸大祥2△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院危重病醫(yī)學(xué)科，3附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

目的： 探討長時間應(yīng)用α7煙堿樣乙酰膽堿受體(α7 nAchR)拮抗劑對淀粉樣β蛋白(Aβ)處理的PC12細(xì)胞的影響及其作用機制。方法采用高分化的PC12細(xì)胞作為研究對象，用Aβ25-35復(fù)制細(xì)胞損傷模型；以α7 nAchR拮抗劑(甲基牛扁亭堿，methyllycaconitine)和nAchR激動劑(尼古丁，nicotine)預(yù)處理PC12細(xì)胞。實驗分4組：空白對照組、Aβ25-35組、尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+ Aβ25-35組。用JC-1熒光分子探針通過線粒體膜電位檢測PC12細(xì)胞的凋亡，用Western blotting檢測α7 nAChR和凋亡調(diào)節(jié)蛋白(Bcl-2/Bax)的表達(dá)。結(jié)果在藥物作用36 h后，與空白對照組比較，Aβ25-35組的凋亡率增高，Bcl-2/Bax和Bax的表達(dá)無明顯差異，α7 nAChR表達(dá)增加；與Aβ25-35組比較，尼古丁+ Aβ25-35組細(xì)胞凋亡率降低，但是Bcl-2/Bax表達(dá)也無明顯差異，而α7 nAChR和Bax表達(dá)均降低；與Aβ25-35組比較，甲基牛扁亭堿+ Aβ25-35組凋亡率雖然無明顯差異，但是Bcl-2/Bax表達(dá)顯著升高，同時α7 nAChR和Bax表達(dá)均明顯降低；與尼古丁+ Aβ25-35組比較，此時甲基牛扁亭堿+ Aβ25-35組的凋亡率較高，Bcl-2/Bax顯著升高，α7 nAChR和Bax表達(dá)均顯著降低；除空白對照組外，α7 nAChR和Bax表達(dá)呈明顯正相關(guān)。在藥物作用84 h后，與空白對照組比較，Aβ25-35組的凋亡率仍然是增高的，Bcl-2/Bax表達(dá)仍然無明顯差異，α7 nAChR表達(dá)降低，Bax表達(dá)明顯增高；與Aβ25-35組比較，尼古丁+ Aβ25-35組細(xì)胞凋亡率和Bcl-2/Bax表達(dá)無明顯差異，α7 nAChR和Bax表達(dá)仍然較低；與Aβ25-35組比較，甲基牛扁亭堿+ Aβ25-35組凋亡率有所降低，而且Bcl-2/Bax表達(dá)仍然顯著升高，α7 nAChR和Bax表達(dá)仍然明顯降低；與尼古丁+ Aβ25-35組比較，甲基牛扁亭堿+ Aβ25-35組的凋亡率較低，Bcl-2/Bax仍然顯著升高，α7nAChR和Bax表達(dá)仍然顯著降低；除空白對照組外，α7 nAChR和Bax表達(dá)呈明顯正相關(guān)。結(jié)論隨著作用時間的延長，尼古丁的保護(hù)作用逐漸消失，而甲基牛扁亭堿的保護(hù)作用逐漸顯現(xiàn)。甲基牛扁亭堿可能是通過下調(diào)α7 nAChR并阻斷Aβ25-35的損傷作用，顯著持續(xù)升高Bcl-2/Bax，從而可能產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的作用。所以，nAcR激動劑也許并不適合長時間治療阿爾茨海默病，而拮抗劑可能會為治療提供一個新的方向。

淀粉樣β蛋白； PC12細(xì)胞； 煙堿拮抗劑； 煙堿激動劑； 細(xì)胞凋亡； 線粒體膜電位

α7型煙堿樣乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAchR)在海馬表達(dá)較為豐富[1,2]，與認(rèn)知和記憶密切相關(guān)。阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)突出的臨床癥狀是認(rèn)知和記憶障礙，其重要病理特征是突觸前神經(jīng)元的丟失及其煙堿受體的減少，其中淀粉樣β蛋白(Aβ)在疾病過程中具有關(guān)鍵作用。

目前的研究多傾向于認(rèn)為nAchR激動劑對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[3,4]，而拮抗劑不但無保護(hù)作用，而且能夠阻斷激動劑的保護(hù)作用[3,5]。但是，現(xiàn)實情況是，包括治療AD最常用的藥物膽堿酯酶抑制劑(增加激動劑乙酰膽堿)，nAchR激動劑長期應(yīng)用后其效果逐漸喪失[6-10]。而學(xué)界對nAchR拮抗劑的長期應(yīng)用缺乏關(guān)注。同樣作為受體，在治療慢性心功能不全時，β受體激動劑短期應(yīng)用具有改善癥狀，長期應(yīng)用癥狀惡化，甚至增加死亡率；而β受體阻滯劑，短期內(nèi)應(yīng)用可能會加重癥狀，但是長期應(yīng)用不但可以改善癥狀，而且降低死亡率。

在AD中，凋亡是神經(jīng)元丟失的重要原因，Aβ蛋白可以引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡[11]，而鈣離子超載與線粒體途徑凋亡有密切關(guān)系。線粒體凋亡途徑涉及到Bcl-2和Bax的表達(dá)，Bcl-2/Bax[12,13]是決定細(xì)胞存活或者凋亡的重要指標(biāo)。

因此，本研究提出nAchR拮抗劑長時間應(yīng)用可能具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的工作假說，并從α7 nAChR和凋亡調(diào)節(jié)蛋白的改變探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

采用高分化的PC12細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的RPMI-1640，其中加入青霉素和鏈霉素(濃度均為1×105U/L)。于37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2主要試劑和儀器

主要試劑：Aβ25-35和甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine)購自Sigma，尼古丁(nicotine)購自日本和光純藥株式會社；培養(yǎng)基RPMI-1640購自ScienCell，胎牛血清購自Hyclone；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax和Bcl-2抗體購自Cell Signaling Technology，α7 nAChR抗體購自Santa Cruz，Ⅱ抗兔抗鼠IgG和羊抗兔IgG 購自Southern Biotech,內(nèi)參照抗體為HRP標(biāo)記的GAPDH，購自上?？党缮锕?。主要儀器：IX51熒光顯微鏡(Olympus)，Western blotting蛋白印跡電泳儀和Western blotting蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)。

3方法

3.1藥物和試劑制備 Aβ25-35母液濃度為1 000 μmol/L，使用前置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3-7d老化，作用濃度為10 μmol/L。尼古丁母液濃度2 000 μmol/L，作用濃度100 μmol/L；甲基牛扁亭堿母液濃度200 μmol/L，作用濃度10 μmol/L；二者加入到培養(yǎng)液中的體積相等。

3.2實驗分組和藥物處理 實驗分4組：空白對照組、Aβ25-35組、尼古丁+Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組。用24孔培養(yǎng)板接種PC12細(xì)胞，36 h實驗細(xì)胞密度為2×104cells/well，84 h實驗細(xì)胞密度為1×103cells/well。接種24 h后各組用蒸餾水或相應(yīng)藥物預(yù)處理，12 h后全部換液加入Aβ25-35和相應(yīng)藥物。分別于第1次加藥后36 h和84 h進(jìn)行相關(guān)檢測。每24或36 h半量換液并補充Aβ25-35、蒸餾水或相應(yīng)藥物。

3.3JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位 (1)將JC-1原液稀釋200倍，混勻后為JC-1 染色工作液。(2)將細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。(3)37 ℃孵育結(jié)束后，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察。檢測JC-1 單體時把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測JC-1 聚合物時，把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期；出現(xiàn)黃色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。(4)計算凋亡率：各實驗組隨機逐一選取5 個視野，拍照保存，計算每個視野照片的凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比率，乘以100％，即為凋亡率。

3.4Western blotting檢測Bcl-2/Bax和nAchR的表達(dá) 收集PC12細(xì)胞，抽提總蛋白，BCA 法測量蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育(Bax、Bcl-2和α7 nAChRⅠ抗稀釋比例分別是1∶200、1∶200和1∶800)，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，用專用軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1通過線粒體膜電位檢測藥物作用36和84h后對PC12細(xì)胞凋亡的影響

圖1、2和表1結(jié)果顯示：藥物作用細(xì)胞36和84 h后，Aβ25-35組的凋亡率明顯高于空白對照組(Plt;0.01)，說明Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞的模型是成功的。

Figure 1.Apoptosis of PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay (the PC12 cells with yellow color are normal，and with green color are in pristine apoptosis,× 200 ) .A: blank control group;B: Aβ25-35 group ; C: Nicotine+ Aβ25-35 group; D: methyllycaconitine + Aβ25-35 group.

Figure 2.Apoptosis of PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay (the PC12 cells with yellow color are normal，and with green color are in pristine apoptosis,× 200).A: blank control group; B: Aβ25-35 group ; C: nicotine+ Aβ25-35 group; D: methyllycaconitine + Aβ25-35 group.

表1 甲基牛扁亭堿或尼古丁+ Aβ25-35作用36和84 h后各組PC12細(xì)胞凋亡的比較

在36 h，尼古丁+ Aβ25-35組的凋亡率低于Aβ25-35組(Plt;0.01)，說明尼古丁在短期內(nèi)應(yīng)用可抑制Aβ蛋白引起的細(xì)胞凋亡，具有細(xì)胞保護(hù)作用；甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組和Aβ25-35組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明甲基牛扁亭堿短期內(nèi)應(yīng)用未表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)作用；尼古丁+ Aβ25-35組的凋亡率低于甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組(Plt;0.05)，說明在短期內(nèi)尼古丁對細(xì)胞的保護(hù)作用是優(yōu)于甲基牛扁亭堿的。在84 h，尼古丁+ Aβ25-35組的凋亡率與Aβ25-35組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明隨著藥物作用時間的延長，尼古丁對細(xì)胞的保護(hù)作用已經(jīng)喪失；甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的凋亡率雖然低于Aβ25-35，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但是，此時甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的凋亡率明顯低于尼古丁+ Aβ25-35組(Plt;0.01)，說明此時甲基牛扁亭堿對細(xì)胞的保護(hù)作用可能優(yōu)于尼古丁。

2藥物作用36和84h對PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

2.1甲基牛扁亭堿或尼古丁+Aβ25-35作用36 h后，對PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 在36 h，Aβ25-35組Bcl-2/Bax的表達(dá)與空白對照組的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因還不明確。尼古丁+ Aβ25-35組Bcl-2/Bax的表達(dá)與Aβ25-35組的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，說明尼古丁此階段在基因表達(dá)水平對PC12細(xì)胞的凋亡無抑制作用。甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組Bcl-2/Bax的表達(dá)明顯高于各組，說明甲基牛扁亭堿已經(jīng)在基因表達(dá)水平具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,見圖3。

2.2甲基牛扁亭堿或尼古丁+ Aβ25-35作用84 h后，對PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 在84 h，情況仍然與36 h類似，見圖4。尼古丁在基因表達(dá)水平對PC12細(xì)胞的凋亡仍然無抑制作用，而甲基牛扁亭堿持續(xù)在基因表達(dá)水平具有抑制凋亡的作用。

Figure 3.Bcl-2/Bax ratio in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h.±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：Methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

Figure 4.Bcl-2/Bax ratio in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h .±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：mMethyllycaconitine +Aβ25-35 group.

Figure 5.The protein expression of α7 nAChR and Bax in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 36 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups; ##Plt;0.01 vs Aβ25-35 group; △△ Plt;0.01 vs blank control group.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：Methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

3α7nAChR蛋白表達(dá)及其與Bax的關(guān)系

3.136 h α7煙堿受體表達(dá)及其與Bax的相關(guān)性分析 在36 h，Aβ25-35組的α7 nAChR蛋白表達(dá)高于空白對照組(Plt;0.01)，說明Aβ促進(jìn)了PC12細(xì)胞α7 nAChR的表達(dá)；而Bax與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因尚不明確。尼古丁+ Aβ25-35組的α7 nAChR和Bax蛋白表達(dá)均低于Aβ25-35組(Plt;0.01)，說明尼古丁引起α7 nAChR和Bax的下調(diào)。甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的α7 nAChR和Bax蛋白表達(dá)均低于其它各組(Plt;0.01)，說明甲基牛扁亭堿引起α7 nAChR和Bax的下調(diào)較尼古丁更加明顯，見圖5。

同時，除空白對照組外，各組的Bax與α7 nAChR的表達(dá)具有一致性，故對其進(jìn)行相關(guān)性分析。在Aβ25-35存在的條件下，藥物作用36 h后，Aβ25-35組、尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的Bax和α7 nAChR呈顯著正相關(guān)(r=0.862，Plt;0.01)。

Figure 6.The protein expression of α7 nAChR and Bax in PC12 cells treated with methyllycaconitine or nicotine and Aβ25-35 for 84 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs other groups; ##Plt;0.01 vs Aβ25-35 group;△△ Plt;0.01 vs blank control group.1：blank control group; 2：Aβ25-35 group; 3：nicotine+ Aβ25-35 group; 4：methyllycaconitine +Aβ25-35 group.

3.284 h α7煙堿受體表達(dá)及其與Bax的相關(guān)性分析 在84 h，Aβ25-35組的α7 nAChR蛋白表達(dá)低于空白對照組(Plt;0.01)，說明Aβ最終導(dǎo)致了α7 nAChR的損傷和減少；而Bax明顯高于空白對照組，說明Aβ25-35在基因表達(dá)水平誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。尼古丁+ Aβ25-35組的α7 nAChR和Bax蛋白表達(dá)均低于Aβ25-35組(Plt;0.01)，說明尼古丁在此階段仍然可以引起α7 nAChR和Bax的下調(diào)。甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的α7 nAChR和Bax蛋白表達(dá)仍然均低于其它各組(Plt;0.01)，說明甲基牛扁亭堿引起α7 nAChR和Bax的下調(diào)，并且最為顯著，見圖6。

同樣，除空白對照組外，各組的Bax與α7 nAChR的表達(dá)具有一致性，對其進(jìn)行相關(guān)性分析。在Aβ25-35存在的條件下，藥物作用84 h后，Aβ25-35組、尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的Bax和α7 nAChR顯著正相關(guān)(r=0.980，Plt;0.01)。

結(jié)合相關(guān)和回歸分析，發(fā)現(xiàn)在Aβ25-35存在的基礎(chǔ)上，α7 nAchR和Bax密切相關(guān)，提示α7 nAchR可能介導(dǎo)了Aβ25-35對PC12細(xì)胞的損傷作用。

討 論

Aβ蛋白可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在AD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[14]。實驗發(fā)現(xiàn)Aβ25-35持續(xù)作用引起PC12細(xì)胞的凋亡，為實驗成功復(fù)制了Aβ蛋白的損傷模型。相對于對照組，Aβ25-35組Bcl-2/Bax的表達(dá)與其無明顯差異，機制尚不明確?？赡艿脑蚴?，對照組無損傷因素，故其Bcl-2和Bax均在低水平表達(dá)，而Aβ蛋白損傷引起B(yǎng)ax增高的同時，也引起B(yǎng)cl-2反應(yīng)性升高[15]。也有可能是檢測時點的問題，如在Aβ25-35刺激后12 h左右Bcl-2/Bax是否會有所下降，尚需進(jìn)一步驗證。Aβ25-35組的α7 nAChR在早期表達(dá)明顯高于空白對照組組，有研究發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白具有上調(diào)煙堿受體的作用[16]；但是在較長時間后，其α7 nAChR表達(dá)又明顯低于對照組，這可能是Aβ蛋白最終導(dǎo)致煙堿受體的損傷和減少有關(guān)，這與AD的發(fā)病機制是一致的。

在實驗早期(36 h)，尼古丁具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[5]，體現(xiàn)了細(xì)胞保護(hù)作用。有人認(rèn)為尼古丁通過激活蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(Janus kinase 2，JAK2)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[17]。甲基牛扁亭堿早期未表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為其無細(xì)胞保護(hù)作用，甚至阻斷激動劑的保護(hù)作用[5]。隨著尼古丁作用時間的延長(84 h)，尼古丁的保護(hù)作用逐漸喪失。有人發(fā)現(xiàn)，較長時間的尼古丁作用可以引起神經(jīng)元的凋亡[6]，但是也有相反的觀點[4,18]。在本研究中，隨著時間的延長，甲基牛扁亭堿的保護(hù)作用逐漸顯現(xiàn)，其凋亡率明顯低于尼古丁組。有人認(rèn)為Aβ蛋白早期(6-9 d)僅僅影響神經(jīng)元突起的生長，用α7受體激動劑和拮抗劑預(yù)處理大鼠神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)均可以抑制Aβ的毒性作用[19]。還有人發(fā)現(xiàn)，α4β2煙堿受體拮抗劑刺桐定和α7煙堿受體拮抗劑甲基牛扁亭堿作用大鼠神經(jīng)元2 d，均具有保護(hù)作用[20]。但是關(guān)于拮抗劑的研究較少，其保護(hù)作用并不是非常明確。

誘導(dǎo)凋亡是通過改變凋亡調(diào)節(jié)蛋白起作用的。本實驗結(jié)果顯示，無論在短時間或者長時間內(nèi)，尼古丁均未升高Bcl-2/Bax的表達(dá)；雖然其在早期具有抑制凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用，但是其內(nèi)在的改變，即Bcl-2/Bax的表達(dá)已經(jīng)不具有抑制凋亡的趨勢，而其早期抑制凋亡的作用是否是通過其它凋亡調(diào)節(jié)通路尚不清楚。而甲基牛扁亭堿的Bcl-2/Bax表達(dá)一直保持在高水平，其重要原因是Bax表達(dá)一直維持很低的水平；雖然其早期并未表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)作用，但是其內(nèi)在的改變，即Bcl-2/Bax的表達(dá)已經(jīng)具有抑制凋亡的趨勢，為其最終產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用提供了潛在條件。

尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的α7 nAChR和Bax均明顯低于Aβ25-35組，而以后者更為明顯。盡管有研究認(rèn)為激動劑具有上調(diào)煙堿受體的作用[21]，而對于拮抗劑多認(rèn)為無上調(diào)受體的作用[22]，但是對不同受體其作用并不一致，如有研究發(fā)現(xiàn)激動劑和拮抗劑都可以上調(diào)α4β2 nAChR及其mRNA的表達(dá)，但是對α7 nAChR及其mRNA無影響[23]。在受體下調(diào)的同時，尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的Bax表達(dá)也明顯比Aβ25-35組低，提示二者均有減輕Aβ?lián)p傷作用，但是甲基牛扁亭堿的作用更為突出。

Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)與損傷性因素是一致的；在本實驗中損傷因素是Aβ25-35，故二者應(yīng)該存在因果關(guān)系。Aβ蛋白與α7 nAChR具有高度親和力[24]，但Aβ蛋白是否通過α7 nAChR損傷神經(jīng)細(xì)胞還不清楚。實驗發(fā)現(xiàn)，除外空白對照組(無Aβ蛋白的損傷作用)，Aβ25-35組、尼古丁+ Aβ25-35組和甲基牛扁亭堿+Aβ25-35組的Bax和α7 nAChR表達(dá)均依次降低， Bax和α7 nAChR表達(dá)呈現(xiàn)高度正相關(guān)，提示Aβ蛋白可能是通過α7 nAChR介導(dǎo)對PC12細(xì)胞的損傷。甲基牛扁亭堿可能通過下調(diào)α7 nAChR的表達(dá)，并阻斷Aβ25-35與受體結(jié)合，從2個方面減輕Aβ蛋白的損傷作用。而尼古丁也下調(diào)α7 nAChR，故這也可能是其抑制Aβ?lián)p傷作用的一個原因。

綜上所述，Aβ蛋白通過與α7 nAChR結(jié)合，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，引起PC12細(xì)胞Bax表達(dá)增高，導(dǎo)致Bcl-2/Bax失衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；甲基牛扁亭堿通過下調(diào)α7 nAChR和阻斷Aβ蛋白與受體結(jié)合，阻止了Bax的上升，使Bcl-2/Bax明顯升高，為最終抑制細(xì)胞的凋亡提供了可能性；尼古丁也通過下調(diào)α7nAChR減少了Bax的上升，但是遠(yuǎn)不如甲基牛扁亭堿明顯，故其未明顯升高Bcl-2/Bax，可能是其對凋亡抑制作用逐漸喪失的原因。

因此，長期使用煙堿受體激動劑其細(xì)胞保護(hù)作用可能逐漸消失，而長期應(yīng)用α7煙堿受體拮抗劑可能具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞保護(hù)作用，可能為AD的治療研究提供新的思路。

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Antagonistofα7nAChRrelievesinjuryofPC12cellsinducedbyamyloidβ-protein

WANG Zhi-gang1,2,QI Ren-bin2,LI Wei3,ZHU Li-hong2,SHEN Wen-juan2,ZHANG Jing2,ZHAO Yan-ru2,LU Da-xiang2

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,3DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of long-term exposure to α7 nicotinic acetylcholine receptor(α7 nAChR) antagonist on PC12 cell injury induced by amyloid β-protein(Aβ).METHODSThe well-differentiated PC12 cells were used in the study.The injury model of PC12 cells was established by treating the cells with Aβ25-35.The interventions of nicotine and methyllycaconitine were carried out.The cells were divided into blank control group,Aβ25-35group,nicotine+Aβ25-35group and methyllycaconitine +Aβ25-35group.The apoptosis of PC12 cells was detected by fluor molecular probe JC-1 through mitochondrial membrane potential assay,and the levels of Bcl-2/Bax and α7 nAChR were detected by Western blotting.RESULTSAfter treated with the related reagents for 36 h,the apoptotic rate of PC12 cells and the expression of α7 nAChR in Aβ25-35group were higher than those in blank control group.No difference of Bcl-2/Bax and Bax between the two groups was observed.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate and expression of α7 nAChR and Bax in nicotine+Aβ25-35group were decreased,and no difference of Bcl-2/Bax between the two groups was detected.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate in methyllycaconitine+Aβ25-35group was unchanged; however,Bcl-2/Bax was obviously increased,and the expression of α7 nAChR and Bax was decreased.The apoptotic rate of PC12 cells in methyllycaconitine+Aβ25-35group was higher than that in nicotine+Aβ25-35group.The levels of Bcl-2/Bax,α7 nAChR and Bax in methyllycaconitine +Aβ25-35group were lower than those in nicotine+Aβ25-35group.Except blank control group,there was positive correlation between α7 nAChR and Bax.After treated with the related reagents for 84 h,the apoptotic rate and the expression of Bax in Aβ25-35group were higher,and the expression of α7 nAChR was lower in Aβ25-35group than those in blank control group.Compared with Aβ25-35group,the apoptotic rate and Bcl-2/Bax in nicotine+Aβ25-35group was unchanged,and the expression of α7 nAChR and Bax was decreased.The apoptotic rate in methyllycaconitine+Aβ25-35group was unchanged;however,Bcl-2/Bax was increased persistently,and α7 nAChR and Bax remained decreasing.Compared with nicotine+Aβ25-35group,the apoptotic rate,α7 nAChR and Bax in methyllycaconitine+Aβ25-35group were decreased,and there was also an obvious decrease in Bcl-2/Bax.CONCLUSIONThe protective effect of nicotine disappears with the time of exposure.However,methyllycaconitine shows a tendency of the protective effect.Methyllycaconitine probably suppresses apoptosis of PC12 cells by increasing Bcl-2/Bax through down-regulation of α7 nAChR and blocking the injury induced by Aβ25-35.Consequently,nicotinic agonist may not be suitable for the chronic treatment of Alzheimer disease,and nicotinic antagonist may provide a new direction.

Amyloid beta-protein; PC12 cells; Nicotinic antagonist; Nicotinic agonist; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential

1000-4718(2011)05-0916-07

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.016

2011-04-01

2011-05-03

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.845106320100363)；暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金前瞻性與基礎(chǔ)研究資助項目(中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助，No.21609425)

△通訊作者 Tel:020-85220004；E-mail: ldx@jnu.edu.cn