黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達的影響*

焦俊霞， 高維娟， 李玉明， 錢 濤， 周曉春， 朱炎杰， 董雅潔

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000;2河北省化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，3河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050026)

黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達的影響*

焦俊霞1， 高維娟2△， 李玉明1， 錢 濤3， 周曉春1， 朱炎杰1， 董雅潔1

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000;2河北省化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，3河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050026)

目的： 觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表達的影響。方法取原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元,隨機分為4組：正常對照組、模型組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組)、溶劑對照組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖+黃芪注射液溶劑處理組)和黃芪注射液處理組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖+黃芪注射液處理組)。除正常對照組外，各組均進行缺糖缺氧0.5 h，再分別于復(fù)氧復(fù)糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h采用Western blotting法檢測海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白的表達，RT-PCR法檢測海馬神經(jīng)元bcl-2和bax mRNA的表達。結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示:與正常對照組比，模型組Bcl-2和Bax蛋白表達明顯升高，而Bcl-2/Bax比值下調(diào)(Plt;0.05)；與模型組比，黃芪注射液處理組Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高(Plt;0.05)，而溶劑對照組Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值則無顯著變化(Pgt;0.05)。bcl-2 mRNA、bax mRNA表達趨勢同蛋白。結(jié)論黃芪注射液可提高缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值，抑制Bax表達，從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡。

缺氧缺糖/復(fù)氧； 黃芪注射液； Bcl-2; Bax； 海馬神經(jīng)元； 細胞凋亡。

缺血性腦血管病是目前神經(jīng)內(nèi)科最常見的一種疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康,致殘率非常高,病理機制也十分復(fù)雜,因此對其病理過程中基因表達變化和藥物干預(yù)作用的研究倍受人們關(guān)注。對這種疾病的治療一般是以疏通堵塞的血管改善病變部位的血液供應(yīng)為主，而當(dāng)缺血部位的血液供應(yīng)好轉(zhuǎn)以后就容易發(fā)生更加嚴(yán)重的再灌注損傷，其中細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。黃芪注射液為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細胞凋亡的發(fā)生[1]。本研究通過觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-assaciated X protein,Bax)表達的影響，探討黃芪注射液抑制神經(jīng)細胞凋亡的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 1-2 d SPF級SD大鼠,雌雄兼有,由天津山川紅實驗動物科技有限公司提供,許可證號為SCXK(津)2009-001。

1.2試劑和儀器 兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體購于武漢博士德公司；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購于Chemicon；小鼠抗大鼠Bax單克隆抗體購于Santa Cruz；BCA蛋白定量試劑盒購于上海申能博彩生物公司;bax和bcl-2引物是由上海生物工程有限公司設(shè)計；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司;多聚賴氨酸和阿糖胞苷購自Sigma;胎牛血清和馬血清由Hyclone生產(chǎn);谷氨酰胺和胰蛋白酶購自華美生物工程公司;DMEM/F12培養(yǎng)基和B27由Gibco生產(chǎn);SP免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn);其它試劑為國產(chǎn)分析純。主要儀器: HERA cell 150型CO2培養(yǎng)箱由Heraeus生產(chǎn);Leica DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡由Wetzlar GmbH生產(chǎn);TDL-40B離心機由上海安亭科學(xué)儀器制造廠生產(chǎn);DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠;MK3型酶標(biāo)儀購自上海雷勃公司。

2方法

2.1海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 取新生24 h的乳鼠放進冰浴的75％乙醇內(nèi)浸泡1 min消毒并窒息，用眼科顯微鑷夾取海馬組織，在解剖顯微鏡下去除含有血管的軟腦膜(以上操作均在冰上進行)，沉淀后吸去上層D-Hanks液，放入0.125％胰蛋白酶消化10-15 min，同時用眼科剪剪切海馬組織至1 mm×1 mm×1 mm大小，用馬血清(0.125％胰蛋白酶量的10％)終止消化，把組織塊混合液移入離心管，1 000 r/min離心5 min×3次，去上清后加DMEM/F12溶液5 mL，吹打離散組織，制成細胞懸液，200目濾網(wǎng)過濾。取10 μL細胞懸液加在計數(shù)板上，倒置顯微鏡下計算活細胞數(shù)，以5×108cells/L密度接種在培養(yǎng)瓶，提取蛋白用于Western blotting; 以5×108cells/L密度接種在直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，提取總mRNA,用于RT-PCR。種植液成分為80％DMEM/F12、10％胎牛血清、10％馬血清、1％谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素各1％。將培養(yǎng)皿放入37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2 d用無血清培養(yǎng)液代替種植液，培養(yǎng)液成分為95％DMEM/F12、2％B27、1％谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素各1％。第4 d把一半培養(yǎng)液換成新鮮無血清培養(yǎng)液，并按全液量添加0.5％阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細胞生長，24 h后替換成新鮮無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 d后建立海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞模型，并檢測指標(biāo)。

2.2海馬神經(jīng)元純度鑒定 細胞免疫化學(xué)檢測海馬神經(jīng)元純度：采用SP法檢測NSE表達,具體操作均按試劑盒說明書進行。兔抗大鼠NSE多克隆抗體按1∶50稀釋；PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。陽性細胞胞漿和突起呈棕黃色，胞核有少許黃色顆粒。陽性細胞計數(shù)方法：高倍鏡下計數(shù)5個非連續(xù)視野陽性細胞數(shù)之和，每組重復(fù)5次。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對免疫組化陽性結(jié)果進行定量分析。

2.3缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞模型的建立與實驗分組 把原代培養(yǎng)8 d 的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為4 組:正常對照組、模型組、黃芪注射液處理組和溶劑對照組。除正常對照組外均參照Bossenmeyer等[2]的方法建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞模型:用無糖Earle’s液代替培養(yǎng)液，隨即把培養(yǎng)皿(瓶)置于37 ℃、CO2溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮氣5 min，再使氣體勻速緩慢連續(xù)排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無血清培養(yǎng)液繼續(xù)在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。黃芪注射液處理組于缺氧缺糖時加入黃芪注射液[0.5 g(生藥)·L-1][3]，直至培養(yǎng)結(jié)束；溶劑對照組處理方法與黃芪注射液處理組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4 的等量無菌去離子水；模型組在缺氧缺糖時加入與正常培養(yǎng)液等量的Earle′s液，缺氧缺糖后正常培養(yǎng)。各組在復(fù)氧復(fù)糖后0、0.5、2、6、24、72 和120 h觀察Bcl-2、Bax蛋白及其mRNA的表達。

2.4蛋白免疫印跡法檢測細胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達 收集細胞，提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取70 μg樣品，加入蛋白體積1/4的loading buffer混勻，在100 ℃沸水中煮10 min，以12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5％奶粉封閉過夜后加入用封閉液稀釋的兔抗Bcl-2多克隆抗體(1∶1 500稀釋)和小鼠抗Bax單克隆抗體(1∶300稀釋)，4 ℃過夜。用生物素標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000稀釋) 孵育1 h，洗膜液洗后用化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。以β-actin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)5次。用Quantity One軟件對各時點蛋白條帶平均吸光度值進行分析。

2.5RT-PCR法檢測細胞內(nèi)bcl-2和bax mRNA的表達 收集細胞，用Trizol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV) 說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照β-actin上游引物5’-CAT CCTGCGTCTGGACCT-3’,下游引物5’-TCAGGAGGAGCA ATGATCTTG-3’,擴增片段長度為480 bp。按照PCR amplification kit 說明進行反應(yīng)，擴增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min，循環(huán)35次，目的條帶在480 bp。bcl-2上游引物5’-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3’,下游引物5’-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3’，擴增片段長度為328 bp;按照PCR amplification kit 說明進行反應(yīng)，擴增條件:95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min，72 ℃延伸3 min，循環(huán)35次，目的條帶在328 bp。bax cDNA上游引物5’-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3’,下游引物5’-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC-3’，按照PCR amplification kit 說明進行反應(yīng)，擴增條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 4min，循環(huán)35次;最后于72 ℃延伸3 min，目的條帶在357 bp。用2％ 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實驗重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity One進行定量分析，并計算目的基因/β-actin吸光度(A)的比值。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)純度鑒定

細胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示:無血清培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突起明顯,突起末端分支形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，相互支持生長，神經(jīng)膠質(zhì)細胞少見，5個400倍視野中陽性神經(jīng)細胞的數(shù)目為775個，純度為(92.35±0.72)％，見圖1。

Figure 1.The expression of NSE protein in cultured rat hippocampal neurons.A:negative;B:NSE.

2黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Western bloting實驗結(jié)果顯示: 與正常對照組比，模型組120 h Bcl-2和Bax蛋白表達無明顯差別，余各時點Bcl-2蛋白表達明顯升高(Plt;0.05)，復(fù)氧復(fù)糖0.5 h開始升高、2 h達高峰、之后逐漸下降，仍高于正常組。與模型組比，黃芪注射液處理組除外120 h，余各時點Bcl-2蛋白表達均明顯增高(Plt;0.05)。與正常對照組比，模型組120 h Bax蛋白表達無明顯差別，余各時點Bax蛋白表達明顯升高(Plt;0.05)，復(fù)氧復(fù)糖0.5 h開始升高、6 h達高峰、之后逐漸下降，仍高于正常(Plt;0.05)。與模型組比，黃芪注射液處理組120 h Bax蛋白表達無明顯差別，而余各時點Bax蛋白表達均明顯降低(Plt;0.05)。溶劑對照組Bcl-2和Bax蛋白變化趨勢與模型組變化相一致(Pgt;0.05)。與正常對照組比，模型組Bcl-2/Bax比值明顯下調(diào)(Plt;0.05)；與模型組比，黃芪注射液處理組Bcl-2/Bax比值明顯升高(Plt;0.05)，而溶劑對照組無明顯差別，見圖2-4。

3黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元bcl-2和baxmRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示,bcl-2和bax mRNA表達趨勢同蛋白表達趨勢相一致，見圖6-8。

Figure 2.The effect of Astragalus injection on expression of Bcl-2 and Bax protein after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.A:normal control group;B:model group;C:vehicle control group; D:Astragalus injection treatment group.

Figure 3.The effect of Astragalus injection on the expression of Bcl-2 protein after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 4.The effect of Astragalus injection on expression of Bax protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 5.The effect of Astragalus injection on the ratio of Bcl-2/Bax after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle group.

討 論

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病,其致死率、致殘率均高,缺血造成腦組織損傷,再灌注使可逆性缺血損傷加重,并通過各種反應(yīng)將可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。大腦是對缺血缺氧十分敏感的組織，而海馬則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺氧耐受相對較差的部位。研究表明[3],神經(jīng)細胞缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后常常發(fā)生細胞凋亡。海馬神經(jīng)細胞凋亡是受各種基因調(diào)控的程序化死亡過程，其病理生理機制非常復(fù)雜，其中,線粒體通路是最普遍的凋亡機制和細胞凋亡核心。另外，研究表明[4]，線粒體通路主要受bcl-2基因家族調(diào)控，其中bcl-2和bax是一對在功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因，腦缺血再灌注損傷與凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax密切相關(guān)。bcl-2是抗凋亡基因,可阻止許多因素所誘導(dǎo)的細胞凋亡，而bax是促凋亡基因，二者的比例是決定細胞是否發(fā)生凋亡的重要調(diào)控因素[5]。Bax蛋白不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促進細胞凋亡的功能。實驗表明，Bcl-2家族成員通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性起重要調(diào)控作用[6]。Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調(diào)控凋亡誘導(dǎo)蛋白的釋放和線粒體功能，兩者間的平衡影響凋亡的發(fā)生[5]。定位于線粒體外膜的Bcl-2可能是線粒體PT孔道的組成成份,能調(diào)節(jié)線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性。線粒體外膜上的Bax能允許一些離子和小分子物質(zhì)(細胞色素C等)穿過線粒體膜,進入細胞質(zhì)，從而引起細胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護細胞免于凋亡；Bcl-2還能將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用。在細胞中Bcl-2和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在，阻止Bax插入線粒體外膜，保護線粒體電勢梯度，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)來抑制凋亡。如果Bcl-2和Bax的表達量相互平衡，形成的Bcl-2/Bax異二聚體占優(yōu)勢，則細胞的存活期正常；如果Bcl-2過表達而Bax的表達不相應(yīng)增多，使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚體占優(yōu)勢，則細胞的存活期延長；如Bax過表達而Bcl-2不相應(yīng)增多，使形成的Bax/Bax同二聚體占優(yōu)勢,則發(fā)生細胞凋亡[7]。

Figure 6.The effect of Astragalus injection on expression of bcl-2 and bax mRNA after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.A:model group;B: vehicle control group;C:Astragalus injection treatment group.

Figure 7.The effect of Astragalus injection on expression of bcl-2 mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 8.The effect of Astragalus injection on expression of bax mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 9.The effect of Astragalus injection on the ratio of bcl-2/bax after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle group.

中醫(yī)藥對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡干預(yù)作用的研究倍受人們關(guān)注。其中，黃芪具有補氣生陽、益氣固表、抗毒生肌之功能。藥理學(xué)研究表明，黃芪成分復(fù)雜，生理活性多種多樣。黃芪能明顯提高腦缺血/再灌注鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶和一氧化氮含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注，從而有效對抗腦缺血/再灌注損傷[8]。以黃芪的提取液為主要成分的現(xiàn)代中藥制劑黃芪注射液，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕之功。黃芪注射液每1 mL相當(dāng)于生藥2 g，葉冬青等[9]的研究證明黃芪注射液對體外培養(yǎng)的缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞有保護作用。張雅麗等[3]黃芪注射液可以抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡,提高細胞的活性,對缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞有保護作用。

本實驗以大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過對培養(yǎng)細胞施加缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖因素來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程，建立腦缺血/再灌注的細胞模型，觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達的影響。研究證實，模型組和黃芪注射液溶劑對照組海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2和Bax的表達顯著高于正常組，且Bcl-2在復(fù)氧復(fù)糖后2 h表達達高峰，而Bax在復(fù)氧復(fù)糖后6 h表達達高峰；與模型組比，黃芪注射液組各時點Bcl-2表達顯著增加，而Bax表達顯著降低。本實驗表明，海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖Bcl-2隨細胞凋亡信號的啟動而開始升高,與Bax結(jié)合成Bcl-2/Bax異二聚體，抑制細胞凋亡；而腦缺血再灌注損傷后Bax在細胞接受凋亡信號后表達增加,發(fā)揮進一步凋亡信號傳遞過程，故在模型組顯著升高。黃芪注射液顯著上調(diào)Bcl-2的表達，發(fā)揮明顯的抗神經(jīng)細胞凋亡的作用。本實驗觀察到缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后120 h Bcl-2和Bax的表達與正常組相比差異無顯著，推測可能是與磷酸化的Bcl-2和Bax半衰期密切相關(guān)[10]，復(fù)氧復(fù)糖72 h后高表達的Bcl-2和Bax蛋白開始大量降解，復(fù)氧復(fù)糖后120 h表達趨近正常，與文獻報道一致。

本實驗結(jié)果證明，大鼠海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后有明顯的神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象，而黃芪注射液有明顯的抗凋亡作用，其作用機制可能與下調(diào)促凋亡基因bax水平，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

[1]劉廣義，付志新，郝娟芝，等.大鼠腦缺血再灌流后Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平表達與大腦皮層及紋狀體區(qū)炎性細胞浸潤的影響[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2004,4(4):252-525.

[2]Bossenmeyer C，Chihab R,Muller S,et al.Hypoxia/reoxygenation induces apoptosis through biphasic induction of protein synthesis in cultured rat brain neurons[J].Brain Res,1998,787(1):107-116.

[3]張雅麗，高維娟,閆鳳霞,等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29(7):793-796.

[4]吳有志,徐善水.細胞凋亡及其基因調(diào)控與腦血管痙攣[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2006,6(1):61- 64.

[5]Burguillos MA,Hajji N,Englund E,et al.Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus:evidence in Parkinson’s disease patients[J].Neurobiol Dis,2011,41(1):177-188.

[6]Lin HH,Chen JH,Huang CC,et al.Apoptotic effect of 3,4-dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38MAPK signaling activation[J].Int J Cancer,2007,120(11): 2306-2316.

[7]Tomasin R,Cintra Gomes-Marcondes MC.Oral administration ofAloeveraand honey reduces walker tumour growth by decreasing cell proliferation and increasing apoptosis in tumour tissue[J].Phytother Res,2011,25(4):619-623.

[8]陳曉春，薛 茜.大鼠腦缺血再灌注損傷及黃芪對腦細胞保護作用的實驗研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2004，33(11):974-976.

[9]葉冬青,高維娟，閆鳳霞，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3 mRNA的表達[J].中國病理生理雜志,2009,25 (9) : 1756-1761.

[10]Papucci L,Witort E,Bevilacqua AM,et al.Impact of targeting the adenine- and uracil-rich element ofbcl-2 mRNA with oligoribonucleotides on apoptosis,cell cycle,and neuronal differentiation in SHSY-5Y cells[J].Mol Pharmacol,2008,73(2):498-508.

AstragalusinjectionaffectsexpressionofBcl-2andBaxafterhypoxia/hypoglycemiaandreoxygenationinrathippocampalneurons

JIAO Jun-xia1,GAO Wei-juan2,LI Yu-ming1,QIAN Tao3,ZHOU Xiao-chun1,ZHU Yan-jie1,DONG Ya-jie1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiChemicalamp;PharmaceuticalCollege,3HebeiProvincialHospital,Shijiazhuang050026,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragalusinjection on the expression of Bcl-2 and Bax after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in rat hippocampal neurons.METHODSThe hippocampal neurons cultured for 8 days were divided into 4 groups: normal control group,model group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation group),vehicle control group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation+Astragalusvehicles control group),andAstragalusinjection treatment group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation+Astragalusinjection treatment group).The rats in model group,Astragalusinjection treatment group and vehicle control group were deprived of oxygen and glucose for 30 min.The methods of Western blotting and RT-PCR were used to measure the expression of Bcl-2 and Bax at mRNA and protein levels after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation for 0 h,0.5 h,2 h,6 h,24 h,72 h and 120 h.RESULTSCompared to normal control group,the protein expression of Bcl-2 and Bax increased obviously and the ratio of Bcl-2/Bax decreased in model group (Plt;0.05).Compared to model group,the protein expression of Bcl-2 and Bax at each time point in vehicle control group had no obvious change (Pgt;0.05).However,the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax increased obviously,but the protein expression of Bax decreased obviously (Plt;0.05) inAstragalusinjection treatment group.The expression of bcl-2 and bax mRNA showed the same tendency as the proteins changed.CONCLUSIONAstragalusinjection inhibits the expression of Bax and increases the expression of Bcl-2,thus regulating the ratio of Bcl-2/Bax after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation and inhibiting the process of apoptosis in hippocampal neurons.

Hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation;Astragalusinjection; Bcl-2; Bax; Hippocampal neurons; Apoptosis

1000-4718(2011)05-0905-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.014

2010-10-18

2011-03-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81072923)

△通訊作者 Tel:0311-85110168;E-mail:gwj6088@163.com