U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制、凋亡及誘導(dǎo)分化作用*

陳 琰， 肖若芝△， 王立琳， 何程明， 阮星星， 熊慕珺， 林東軍

(中山大學(xué) 1附屬第三醫(yī)院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制、凋亡及誘導(dǎo)分化作用*

陳 琰1，2， 肖若芝1，2△， 王立琳1，2， 何程明1， 阮星星1， 熊慕珺1，2， 林東軍1，2

(中山大學(xué)1附屬第三醫(yī)院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

目的： 觀察索拉非尼、索拉非尼聯(lián)合MEK激酶抑制劑U0126對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株增殖、凋亡及分化的影響，并初步探討其機(jī)制。方法CCK-8法觀察索拉非尼、U0126單用及不同濃度索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活力變化；PI單染法及Hoechst 33342染色法觀察索拉非尼、U0126單用及索拉非尼聯(lián)合U0126對(duì)K562細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用；細(xì)胞周期分析及聯(lián)苯胺染色觀察索拉非尼、U0126單用及低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126是否誘導(dǎo)K562細(xì)胞株向紅系分化；采用免疫印跡法檢測(cè)c-Myc蛋白表達(dá)。結(jié)果MEK抑制劑U0126增強(qiáng)了索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制、促凋亡及誘導(dǎo)分化作用。兩藥聯(lián)用顯著下調(diào)K562細(xì)胞c-Myc蛋白水平。結(jié)論MEK抑制劑U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制、凋亡及誘導(dǎo)分化作用,這可能與其協(xié)同下調(diào)c-Myc蛋白有關(guān)。

索拉非尼； U0126； K562細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； c-Myc

慢性粒細(xì)胞白血病特征性的分子生物學(xué)異常為BCR-ABL融合基因，其編碼的BCR-ABL蛋白可持續(xù)活化多條同細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)通路分子。盡管伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病療效顯著，但是還有部分病人出現(xiàn)伊馬替尼耐藥，尤其是在慢性粒細(xì)胞白血病加速期。因此，克服伊馬替尼耐藥成為亟待解決的問(wèn)題。阻斷BCR-ABL活化的下游信號(hào)為當(dāng)前克服伊馬替尼耐藥的熱點(diǎn)研究之一。索拉非尼(sorafeinb) 為多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，最初設(shè)計(jì)為Raf(絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者)激酶抑制劑，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其能同時(shí)抑制其它多種酪氨酸激酶,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子、受體酪氨酸激酶c-Kit、Fms樣酪氨酸激酶等多種受體酪氨酸激酶[1]。U0126為MEK激酶抑制劑，特異性抑制MEKK1激活，抑制MAPKs級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究以U0126聯(lián)合索拉非尼作用于體外培養(yǎng)的BCR-ABL陽(yáng)性人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株，探討U0126是否增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制、凋亡及分化誘導(dǎo)作用。

材 料 和 方 法

1材料

索拉非尼購(gòu)于拜耳醫(yī)藥公司；U0126購(gòu)于Alexis；小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas；Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基、CCK-8細(xì)胞毒力和細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)于南京凱基生物發(fā)展有限公司；Hoechst 33342購(gòu)于Sigma；鼠抗GAPDH和兔抗c-Myc單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) K562、U937細(xì)胞株為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保留。使用添加10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5％CO2孵育箱內(nèi)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2PCR法檢測(cè)b3a2BCR-ABL融合基因 對(duì)K562細(xì)胞BCR-ABL融合基因進(jìn)行檢測(cè)，并以U937細(xì)胞株作為陰性對(duì)照。應(yīng)用Trizol試劑提取K562和U937細(xì)胞總RNA，核酸蛋白分析儀檢測(cè)含量。0.5 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。b3a2BCR-ABL上游引物5’-GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3’，下游引物5’-TCAGACCCTGAGGCCCTGAGGCTCAAAGTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為200bp。β-actin上游引物5’- TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游引物5’- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為294 bp。PCR擴(kuò)增條件：PCR熱循環(huán)儀中，94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2.3CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，1×104cells/well接種于96孔板，每孔體積100 μL。置于37 ℃、5％CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，空白對(duì)照組以不含索拉非尼的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組以含不同濃度的索拉非尼、U0126及不同濃度索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、5％CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸其光(A值)，增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100％。

2.4PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡 K562細(xì)胞以 1×106cells/well，每孔體積2 mL接種于12孔板，實(shí)驗(yàn)組以含不同濃度的索拉非尼或是聯(lián)合10 μmol/L U0126的培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，緩慢滴入1 mL 70％預(yù)冷的乙醇固定過(guò)夜，第2 d檢測(cè)前離心除去乙醇，500 μL PBS重懸，加入RNase至終濃度為100 mg/L,37 ℃水浴30 min，加入PI染液至終濃度為50 mg/L,4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm的紅色熒光，結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件進(jìn)行分析，記錄亞二倍體峰，即凋亡細(xì)胞峰sub-G1期、G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5Hoechst 33342染色觀察K562細(xì)胞凋亡形態(tài) K562細(xì)胞以1×106cells/well，每孔體積3 mL接種于6孔板，分別用5 μmol/L索拉非尼、10 μmol/L U0126及5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照，48 h后加入Hoechst 33342，使其終濃度為10 mg/L,培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30 min后收集細(xì)胞，避光。PBS洗滌后以甲醛固定，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×109cells/L，將細(xì)胞懸液滴于載玻片，加蓋蓋玻片，稍干燥后用有紫外光的熒光顯微鏡觀察,正?；罴?xì)胞體積較大、形態(tài)完整、染色均一、藍(lán)色熒光相對(duì)較弱，凋亡細(xì)胞體積變小、核固縮、核裂解、形狀不規(guī)則、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)出凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6聯(lián)苯胺染色檢測(cè)K562細(xì)胞向紅系方向分化 K562細(xì)胞以1×109cells/L，每孔體積5 mL接種于6孔板，分別用5 μmol/L索拉非尼、10 μmol/L U0126及5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×109cells/L，取出50 μL。0.5 mol/L冰乙酸配置的0.2％(W/V)聯(lián)苯胺液0.5 mL加入30 μL H2O2混勻后取出10 μL加入到細(xì)胞中，2 min后加入5％(W/V)亞硝基鐵氰化鈉1 μL搖勻，室溫避光放置10 min，5 min內(nèi)顯微鏡拍攝觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，染為藍(lán)色的即是聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞，提示藥物誘導(dǎo)K562細(xì)胞合成血紅蛋白，向紅系分化，未染色的為陰性細(xì)胞，求聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Western blotting法檢測(cè)c-Myc蛋白 K562細(xì)胞以1×109cells/L，每孔體積2 mL接種于6孔板，以含不同濃度索拉非尼或聯(lián)合10 μmoL/L的U0126的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并設(shè)空白對(duì)照。48 h后收集細(xì)胞，冰上裂解，靜置10 min后以12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線后測(cè)定樣品蛋白實(shí)際濃度，置于-80 ℃。固定好電泳裝置，灌制分離膠及濃縮膠，凝固后，將電泳裝置放入裝有電泳液的槽中，取40 μg的樣品加入6×SDS上樣緩沖液后沸煮5 min，冷卻后于上樣孔加樣。加樣完畢后，電泳至溴酚藍(lán)線到達(dá)濃縮膠最下緣結(jié)束。根據(jù)蛋白分子量切取合適大小的分離膠及PV膜于轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，室溫下以5％牛血清蛋白封閉1 h。膜與Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光，X膠片顯影，掃描后用Quantity One軟件分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1K562細(xì)胞BCR-ABL融合基因的鑒定

PCR法顯示K562細(xì)胞為b3a2BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞株，BCR-ABL有多連接方式，最常見的為b3a2型，該基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后翻譯成相對(duì)分子量為210 kD的蛋白質(zhì)，即P210BCR-ABL。對(duì)照組U937細(xì)胞則不表達(dá)BCR-ABL融合基因,見圖1。

Figure 1.Detection of b3a2 BCR-ABL in K562 cell line by PCR.

2U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞株的增殖抑制作用

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示索拉非尼單藥對(duì)K562細(xì)胞具有增殖抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，48 h索拉非尼作用于K562細(xì)胞的IC50濃度為14.02 μmol/L，U0126單用增殖抑制趨勢(shì)不明顯。索拉非尼5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L聯(lián)合10 μmol/L的U0126后，K562細(xì)胞增殖抑制率明顯高于索拉非尼單用(Plt;0.01)，見圖2。

3U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡作用

選擇小于IC50濃度的索拉非尼觀察單用及聯(lián)合U0126作用K562細(xì)胞的效果。PI單染法測(cè)定藥物作用后Sub-G1細(xì)胞比例，即凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果顯示10 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率明顯高于索拉非尼、U0126單用(Plt;0.01)，見圖3。Hoechst 33342染色法觀察10 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細(xì)胞48 h后，核固縮和核碎裂陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于索拉非尼、U0126單用(Plt;0.01)，見圖4，從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了U0126增強(qiáng)了索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

Figure 2.Growth inhibitory effect of sorafenib,U0126 or sorafenib combined 10 μmol/L U0126 on K562 cells for 48 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs sorafenib.

Figure 3.The apoptotic rate of K562 cells was determined with PI staining after exposure to indicated drugs for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(10 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(10 μmol/L).±s.n=3.**Plt;0.01 vs control;##Plt;0.01 vs U0126;△△Plt;0.01 vs sorafenib.

Figure 4.K562 cells were stained with Hoechst 33342 to identify condensed apoptotic nuclei after exposure to indicated drugs for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(10 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(10 μmol/L).±s.n=3.**Plt;0.01 vs control;##Plt;0.01 vs U0126;△△Plt;0.01 vs sorafenib.

4U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞株的周期及誘導(dǎo)分化影響

索拉非尼5 μmol/L、U0126 10 μmol/L單用及聯(lián)合作用K562細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示：5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126組G0/G1期細(xì)胞比例(62.22％±2.88％)高于對(duì)照(46.14％±2.38％)、索拉非尼(47.20％±1.15％)及U0126(42.00％±1.84％)單用，而兩藥聯(lián)合S期細(xì)胞比例(37.38％±2.75％)低于對(duì)照(47.27％±2.63％)、索拉非尼(48.29％±0.92％)及U0126(55.85％±1.86％)單用(Plt;0.05)，見表1，提示兩藥聯(lián)合較單藥引起更明顯的G0/G1期阻滯，K562細(xì)胞分裂及增殖活性降低，在G0/G1檢測(cè)點(diǎn)聚集最終走向分化或者凋亡。而5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126未導(dǎo)致明顯凋亡，說(shuō)明低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126主要以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為主。聯(lián)苯胺染色證實(shí)U0126聯(lián)合低濃度索拉非尼更明顯地促進(jìn)K562細(xì)胞產(chǎn)生血紅蛋白并向紅系方向分化，聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率上升(Plt;0.05)，見圖5。

Figure 5.K562 cells were stained with benzidine after exposured to lower concentrations of sorafenib,U0126 or combination of both for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(5 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(5 μmol/L).*Plt;0.05 vs control;#Plt;0.05 vs U0126;△Plt;0.05 vs sorafenib.

5索拉非尼聯(lián)合U0126顯著下調(diào)c-Myc蛋白水平

Western blotting法顯示索拉非尼聯(lián)用U0126作用48 h后，c-Myc蛋白水平較之索拉非尼、U0126單用明顯降低(Plt;0.05)，見圖6，提示U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制、凋亡及分化誘導(dǎo)作用可能與其協(xié)同下調(diào)c-Myc蛋白有關(guān)。

表1 索拉非尼、U0126單藥及聯(lián)合作用于K562細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布

Figure 6.Western blotting analysis of c-Myc protein expression in K562 cells treated with sorafenib,U0126 or combination of both for 48 h.*Plt;0.05 vs control;#Plt;0.05 vs U0126;△Plt;0.05 vs sorafenib.

討 論

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)起源于造血干細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)變，其標(biāo)志性的遺傳學(xué)異常為t(9;22)(q34;q11)染色體易位，此易位形成了BCR-ABL融合基因，編碼BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL融合蛋白具有組成性酪氨酸激酶活性，可活化一系列胞內(nèi)信號(hào)通路并激活RAS、PI3K、AKT、JNK、SRC家族激酶及各自的下游靶點(diǎn)，如轉(zhuǎn)錄因子STATs、NF-κB、Myc等[2]。伊馬替尼可有效抑制P210 BCR-ABL融合蛋白，誘導(dǎo)95％慢性期CML患者血液學(xué)的完全緩解，盡管如此，患者骨髓中仍持續(xù)產(chǎn)生BCR-ABL基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。另外，還有部分病人出現(xiàn)伊馬替尼耐藥，尤其是在慢性粒細(xì)胞白血病加速期。伊馬替尼耐藥最主要的原因?yàn)锳BL激酶區(qū)域的點(diǎn)突變改變了ATP口袋結(jié)構(gòu)構(gòu)象，影響了藥物同其靶點(diǎn)結(jié)合[3]。當(dāng)前，克服伊馬替尼耐藥的治療策略包括運(yùn)用第二代激酶抑制劑、造血干細(xì)胞移植及靶向BCR-ABL依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。異基因造血干細(xì)胞移植是唯一治愈CML的手段，但是大多數(shù)病人不適宜采用此種療法，主要原因在于患者年齡過(guò)大難以耐受治療帶來(lái)的副反應(yīng)或是缺乏合適的干細(xì)胞供者。第二代酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼及尼諾替尼雖然能抑制大部分不同形式突變后的激酶活性，但其對(duì)T315I突變無(wú)效。因此，開發(fā)及研究以BCR-ABL活化的下游信號(hào)為靶點(diǎn)的藥物具有潛在的前景，尤其是對(duì)T315I突變所致的耐藥。

目前，較多研究證明多激酶抑制劑索拉非尼可在體外誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞株凋亡，包括BCR-ABL陽(yáng)性的白血病細(xì)胞[4]，抑制生存及增殖的機(jī)制包括阻斷Raf/MEK/ERK通路，下調(diào)Mcl-1表達(dá)以及誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4-6]。U0126為高效MEK激酶抑制劑，直接抑制ERK1/2上游激活物MEK蛋白的活性而抑制ERK磷酸化。有研究顯示U0126聯(lián)合伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞株凋亡[7]。另外，其聯(lián)合雷帕霉素、Bcl-2抑制劑GX15070可在體外誘導(dǎo)伊馬替尼耐藥細(xì)胞株凋亡[8]。

本實(shí)驗(yàn)中，U0126增強(qiáng)索拉非尼對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用，低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126促進(jìn)K562細(xì)胞向分化方向發(fā)展，而高濃度索拉非尼聯(lián)合U0126誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。索拉非尼、U0126聯(lián)用后c-Myc蛋白明顯下調(diào)，提示U0126增強(qiáng)索拉非尼增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及分化的機(jī)制可能在于兩藥協(xié)同下調(diào)c-Myc蛋白。c-myc為細(xì)胞增殖調(diào)控的早期反應(yīng)基因，其編碼的c-Myc蛋白為一種轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞向分化方向發(fā)展時(shí)，c-Myc表達(dá)下調(diào)。染色體異位、點(diǎn)突變及上游調(diào)節(jié)因子缺乏可過(guò)度活化c-Myc導(dǎo)致細(xì)胞致癌性轉(zhuǎn)變，促進(jìn)白血病及一些實(shí)體腫瘤形成。慢性粒細(xì)胞白血病患者急性變時(shí)，常有c-Myc過(guò)表達(dá)[9]。BCR-ABL可通過(guò)其組成性活化胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)c-Myc過(guò)表達(dá)。索拉非尼可能通過(guò)抑制多種細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)激酶阻斷BCR-ABL活化的生存信號(hào)下調(diào)c-myc基因表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)c-Myc蛋白。U0126通過(guò)抑制MEK蛋白減少活性形式的ERK蛋白產(chǎn)生，進(jìn)而減少ERK磷酸化其下游靶點(diǎn)c-Myc，弱化其活化轉(zhuǎn)錄能力。兩者聯(lián)用協(xié)同下調(diào)了具有轉(zhuǎn)錄活性的c-Myc蛋白水平。另外，Myc蛋白可與Miz-1蛋白相互作用抑制P21的表達(dá)從而阻斷P53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯[10,11]，索拉非尼可能通過(guò)下調(diào)c-Myc而穩(wěn)定P21導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，而U0126則剛好強(qiáng)化了此作用，促進(jìn)K562向紅系方向分化。因此，索拉非尼聯(lián)合U0126則可能成為治療伊馬替尼耐藥的CML的可行方案。

[1]肖若芝，何程明，王立琳，等.索拉非尼聯(lián)合柔紅霉素對(duì)白血病K562細(xì)胞抑制作用[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26 (7): 1356-1361.

[2]Ren R.Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia[J].Nat Rev Cancer,2005,5(3):172-183.

[3]Azam M,Latek RR,Daley GQ.Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis ofBCR-ABL[J].Cell,2003，112(6):831-843.

[4]Rahmani M,Nguyen TK,Dent P,et al.The multikinase inhibitor sorafenib induces apoptosis in highly imatinib mesylate-resistant Bcr/Abl+human leukemia cells in association with signal transducer and activator of transcription 5 inhibition and myeloid cell leukemia-1 down-regulation[J].Mol Pharmacol,2007,72(3):788-795.

[5]Wilhelm S,Carter C,Lynch M,et al.Discovery and development of sorafenib:a multikinase inhibitor for treating cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(3):835-844.

[6]Zhang W,Konopleva M,Ruvolo VR,et al.Sorafenib induces apoptosis of AML cells via Bim-mediated activation of the intrinsic apoptotic pathway[J].Leukemia,2008,22(4):808-818.

[7]Yu C,Krystal G,Varticovksi L,et al.Pharmacologic mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase/mitogen-activated protein kinase inhibitors interact synergistically with STI571 to induce apoptosis in Bcr/Abl-expressing human leukemia cells[J].Cancer Res,2002,62(1):188-199.

[8]Dong S,Kang S,Lonial S,et al.Targeting 14-3-3 sensitizes native and mutant BCR-ABL to inhibition with U0126,rapamycin and Bcl-2 inhibitor GX15-070[J].Leukemia,2008,22(3):572-577.

[9]Advani AS,Pendergast AM.Bcr-Ablvariants: biological and clinical aspects[J].Leuk Res,2002,26(8):713-720.

[10]Seoane J,Le HV,Massagué J.Myc suppression of the p21Cip1Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage[J].Nature,2002,419 (6908):729-734.

[11]Wu S,Cetinkaya C,Munoz-Alonso MJ,et al.Myc represses differentiation -inducedp21CIP1 expression via Miz-1-dependent interaction with thep21 core promoter[J].Oncogene,2003,22(3):351-360.

U0126enhancessorafenib-inducedproliferationinhibition,apoptosisanddifferentiationinK562cells

CHEN Yan1,2,XIAO Ruo-zhi1,2,WANG Li-lin1,2,HE Cheng-ming1,RUAN Xing-xing1,XIONG Mu-jun1,2,LIN Dong-jun1,2

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,2InstituteofHematology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:E-mail:ruozhi_xiao@yahoo.com)

AIM: To observe the effects of sorafenib and sorafenib combined with an MEK kinase inhibitor U0126 on the proliferation,apoptosis and differentiation in human chronic myelogenous leukemia cell line K562.METHODSK562 cells were treated with different concentrations of sorafenib and U0126 or 10 μmol/L U0126 combined with different concentrations of sorafenib for 48 h.Cell inhibitory rate was determined by CCK-8 assay.Apoptosis analysis was conducted by Hoechst 33342 and PI staining.Cell cycle analysis and benzidine staining were used to confirm K562 cells towards erythroid differentiation.The protein expression of c-Myc was detected by Western blotting.RESULTSU0126 enhanced sorafenib-induced proliferation inhibition,apoptosis and differentiation in K562 cells.Sorafenib combined with U0126 remarkably reduced the protein level of c-Myc.CONCLUSIONU0126 synergistically enhances sorafenib-induced proliferation inhibition,apoptosis and differentiation in K562 cells through reducing c-Myc protein level.

Sorafenib; U0126; K562 cells; Apoptosis; c-Myc

1000-4718(2011)05-0859-06

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.006

2010-11-30

2011-03-21

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目 (No.2006B35501008)

△通訊作者Tel: 020-85252227; E-mail: ruozhi_xiao@yahoo.com