siRNA 沉默MIF基因抑制大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖*

侯俊娜, 羅益鋒, 王杜娟, 楊惠玲， 郭禹標(biāo)△

(中山大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 2中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

siRNA 沉默MIF基因抑制大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖*

侯俊娜1, 羅益鋒1, 王杜娟2, 楊惠玲2， 郭禹標(biāo)1△

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 研究小干擾RNA(siRNA)阻斷巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)基因表達(dá)對(duì)大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)并探討其抑瘤機(jī)制。方法在體外培養(yǎng)的H460細(xì)胞中，采用免疫熒光法觀測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測(cè)MIF蛋白的表達(dá)，MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè) MIF siRNA對(duì)H460細(xì)胞活性和增殖的抑制作用，Hoechst染色出現(xiàn)后熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀觀測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果與陰性對(duì)照組相比，siRNA能有效阻斷MIF蛋白的表達(dá)，顯著抑制H460細(xì)胞活性及增殖能力(Plt;0.05)；Hoechst染色可見(jiàn)轉(zhuǎn)染MIF siRNA后的H460細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MIF siRNA1和MIF siRNA2后細(xì)胞凋亡較陰性對(duì)照組顯著增加[ (18.09±0.41)％ 和(23.38±2.67)％vs(5.87±1.05)％，Plt;0.05]。結(jié)論MIF在大細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，siRNA阻斷MIF蛋白表達(dá)，可抑制H460細(xì)胞增殖，提示其極有可能成為肺癌的新治療靶點(diǎn)。

巨噬細(xì)胞抑制因子； 小干擾RNA； 肺腫瘤

肺癌為當(dāng)前世界各地最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，半個(gè)世紀(jì)以來(lái)世界各國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高的趨勢(shì)。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中NSCLC占80％以上。NSCLC早期侵犯血管，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且多數(shù)NSCLC對(duì)放化療并不敏感，尋找新的診療方法迫在眉睫[1,2]。在多數(shù)腫瘤可見(jiàn)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)或功能異常，設(shè)法拮抗異常的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、提高負(fù)調(diào)控因子或沉默正調(diào)控因子，使其達(dá)到新的平衡，是治療肺癌的新策略[3]。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種獨(dú)特的促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生的細(xì)胞因子。MIF不僅作為重要的炎癥細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，而且和細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及腫瘤血管生成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)密切相關(guān)[4-7]。還有研究證明，靶向沉默MIF基因后，肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲與遷移能力下降90％，若MIF過(guò)表達(dá)，則可觀察到相反現(xiàn)象[7]。在NSCLC其它類型如大細(xì)胞肺癌中是否存在MIF表達(dá)及相關(guān)的作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)阻斷MIF蛋白的表達(dá)，觀察其對(duì)人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖的影響并探討其可能機(jī)制,為研發(fā)NSCLC的新治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

H460細(xì)胞株由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen。MIF的siRNA序列由Invitrogen合成，MIF siRNA1: 正義鏈5′-AUAGUUGAUGUAGACCCUGUCCGGG-3′,反義鏈5′-CCCGGACAGGGUCUACAUCAACUAU-3′; MIF siRNA2:正義鏈5′- UUGGUGUUUACGAUGAACAUCGGCA-3′,反義鏈5′-UGCCGAUGUUCAUCGUAAACACCAA-3′; Opti-MEM培養(yǎng)基、BLOCK-iT Alexa Fluor Red Oligo和Stealth RNAi Negative Control Hi GC Kit均購(gòu)自Invitrogen。MIF鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Abcam，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Ⅱ抗)購(gòu)自Cell Signaling Technology。噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-y1)-3,5-diphenyltetrazoliumromide,MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為Sigma產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。Leica DMI4000B 智能型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Leica。Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物；ECL發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) H460細(xì)胞株采用含10％小牛血清、無(wú)抗生素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置37 ℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24 h消化細(xì)胞，傳代于6孔板，第2 d按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作。分別用Opti-MEM稀釋siRNA及脂質(zhì)體，室溫靜置5 min后混和，室溫孵育20 min，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染negative control siRNA，NC siRNA)和實(shí)驗(yàn)組(分別轉(zhuǎn)染MIF siRNA1和MIF siRNA2)。

2.2免疫熒光法觀測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前24 h 消化細(xì)胞，傳代于6孔板，第2 d按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作，按照濃度梯度加入熒光標(biāo)記的siRNA,熒光siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞，6 h后PBS沖洗1次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3Western blotting法測(cè)定目的蛋白MIF的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，收集全細(xì)胞蛋白標(biāo)本，常規(guī)BCA方法蛋白定量。制備15％聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(2-3 h)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(50 min)，室溫5％BSA封閉1 h，加MIF Ⅰ 抗(1∶750)孵育PVDF膜4 ℃過(guò)夜，后TBST洗膜3次,加HRP偶聯(lián)的Ⅱ 抗(1∶2 000)，孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色曝光,Qantity One 軟件分析結(jié)果。

2.4MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×103細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染siRNA，使液體終體積100 μL/well，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，6 h后每孔加入含20％小牛血清、無(wú)抗生素RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL/well，孵育0、24、48、72 h后，棄去培養(yǎng)液，加入MTT溶液(20 μL/well)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μL/well)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)490 nm處測(cè)量其吸光度值(A值)。

2.5平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，胰酶消化細(xì)胞，以200 cells/well接種于6孔板，加全培養(yǎng)基2 mL/well繼續(xù)培養(yǎng)10 d,常規(guī)固定染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，以≥50個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)集落，并計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％

2.6Hoechst染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 胰酶消化細(xì)胞，按1.5×105cells/well接種于6孔板，第2 d轉(zhuǎn)染，6 h后換液，48 h后棄上清，PBS洗滌2次，常規(guī)固定，Hoechst 33342染色(0.3 mL/well)，染色10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h后棄上清，無(wú)EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，用膜聯(lián)蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)(Annexin V/PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1免疫熒光法觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率

免疫熒光結(jié)果表明，siRNA的成功轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70％以上，但是在siRNA濃度≥50 nmol/L后，隨著siRNA濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率沒(méi)有表現(xiàn)出相應(yīng)的劑量依賴關(guān)系，因此我們選擇50 nmol/L的濃度做后續(xù)功能研究實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖1。

Figure 1.The transfection efficiency of siRNA directed against MIF was assessed by immunofluorescence technique.A: 50 nmol/L siRNA; B: 100 nmol/L siRNA.

2Westernblotting檢測(cè)靶向沉默MIF基因后，H460細(xì)胞中MIF蛋白的表達(dá)

與NC siRNA組相比，MIF siRNA1和MIF siRNA2均能有效阻斷MIF蛋白的表達(dá),見(jiàn)圖2。

3靶向沉默MIF基因?qū)460細(xì)胞活性及增殖的影響

MTT結(jié)果表明，H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，與NC siRNA組相比，MIF siRNA能顯著抑制H460細(xì)胞的活性，差異顯著(Plt;0.05)，見(jiàn)表1。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIF siRNA1和MIF siRNA2組細(xì)胞克隆形成率分別為(32.00±4.44)％、(22.00±3.46)％，顯著低于NC組細(xì)胞克隆形成率(66.67±2.56)％，差異顯著(Plt;0.05),見(jiàn)圖3。

4MIFsiRNA對(duì)H460細(xì)胞凋亡的影響

4.1電鏡形態(tài)學(xué)觀察 Hoechest 33342染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，與NC組細(xì)胞相比，可見(jiàn)MIF siRNA1組和MIF siRNA2組細(xì)胞數(shù)減少，并且可見(jiàn)染色質(zhì)濃縮、碎裂和邊集，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變,見(jiàn)圖4。

4.2細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后H460細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，NC組凋亡率為5.87％，MIFsiRNA1和MIFsiRNA2組凋亡率分別為18.09％、23.38％。差異顯著(Plt;0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 2.Expression of MIF protein detected by Western blotting in H460 cells after knockdown of MIF gene by siRNA.NC: negative control±s.n=3.*P lt;0.05 vs NC group.

表1 MTT法檢測(cè)MIF siRNA對(duì)H460細(xì)胞活性影響

Figure 3.The proliferation of H460 cell induced by MIF siRNA.A: negative control group; B: MIF siRNA1 group ；C: MIF siRNA2 group.

Figure 4.The morphological character of apoptosis in H460 cell induced by MIF-siRNA was detected by Hoechst 33342.A: negative control group;B: MIF siRNA1 group;C:MIF siRNA2 group.

Figure 5.The apoptosis of H460 cell line after treatment with MIF siRNA for 48 h.±s.n=3.A: negative control group(5.87±1.05)％; B: MIF siRNA1 group(18.09±0.41)％*；C: MIF siRNA2 group(23.38±2.67)％*#.*Plt;0.05 vs negative control group;#Plt;0.05 vs MIF siRNA1 group.

討 論

MIF是一個(gè)相對(duì)分子量為12.5 kD的非糖基化蛋白，最初它作為激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種可溶性淋巴因子被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為其有抑制巨噬細(xì)胞遷移作用。后來(lái)進(jìn)一步研究表明，它在炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子是一種獨(dú)特的促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生的細(xì)胞因子。MIF在多種腫瘤如肝癌﹑結(jié)腸癌、肺腺癌﹑乳腺癌﹑膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及慢性粒細(xì)胞白血病等腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)[4-11]。

已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了肺癌特別是NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，Khan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC病人的血清MIF和血清淀粉樣蛋白-A(SAA)水平明顯增高，提示MIF可作為腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)早期肺癌；Kamimura等[12]通過(guò)免疫組化/原位雜交發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌病人的肺組織MIF過(guò)度表達(dá)且與預(yù)后明確相關(guān)；White 等[13]研究表明：NSCLC肺癌組織標(biāo)本高表達(dá)MIF與血中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和肺癌組織CXC趨化因子(CXC chemokine)表達(dá)升高呈正相關(guān)，特別是與腫瘤組織微血管密度(mierovascular density,MVD)呈顯著正相關(guān)。McClelland等[14]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織標(biāo)本中特異的MIF受體-CD74表達(dá)同樣顯著增高且誘導(dǎo)體內(nèi)外促血管新生的CXC趨化因子表達(dá)升高;MIF這種誘導(dǎo)血管新生效應(yīng)可被CD74抗體所拮抗。上述結(jié)果均提示MIF與NSCLC血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。至于肺癌細(xì)胞自分泌或旁分泌MIF究竟如何參與控制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及促進(jìn)血管生成，其信號(hào)通道與分子機(jī)制目前尚不清楚，我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次用siRNA阻斷或減少M(fèi)IF蛋白表達(dá)，探討研究其抑瘤作用，對(duì)尋求治療肺癌的新途徑和新治療靶點(diǎn)具有重要意義。

大量研究表明，MIF通過(guò)抑制抑癌基因p53的功能、持續(xù)激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/ 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)/前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)激活、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及分化等獨(dú)特的生物學(xué)作用多層次促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖及侵襲[15]；并且在低分化腫瘤中，MIF表達(dá)與預(yù)后相關(guān)[16]，提示MIF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，但具體的分子機(jī)制尚未完全闡明。Jung 等[9]研究表明，MIF阻止P53從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，并且可抑制P53的活性，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。Binsky等[10]在慢性淋巴細(xì)胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，MIF表達(dá)明顯升高，通過(guò)激活I(lǐng)L-8，繼而B(niǎo)cl-2表達(dá)增加，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Arenberg 等[17]發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6小鼠肺損傷急性期，MIF表達(dá)增加，抑制在急性期注入小鼠體內(nèi)的Louis癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖，而在敲除MIF基因的小鼠中則無(wú)此現(xiàn)象。

我們的研究結(jié)果表明：大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞株高表達(dá)MIF蛋白，體外應(yīng)用siRNA靶向沉默MIF基因后，H460細(xì)胞的活性、增殖能力下降；繼而用Annexin V - FITC/ PI 雙染色凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MIF siRNA部分阻斷MIF表達(dá)后，H460細(xì)胞凋亡率顯著增加，與之前Jung等[9]的研究結(jié)果相似，為MIF在人類惡性腫瘤特別是NSCLC中發(fā)揮著重要作用提供了更豐富的證據(jù)。

我們的研究首次證實(shí)在大細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)、進(jìn)展過(guò)程中，MIF可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這也為研發(fā)大細(xì)胞肺癌新的治療靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且研究過(guò)程中所用的MIF siRNA也可能成為有效的抗癌藥物。但是，目前關(guān)于MIF siRNA 促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的具體信號(hào)通道與分子生物學(xué)機(jī)制尚不明了，基于之前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究，我們審慎地推測(cè):MIF作為一種促炎、促癌的細(xì)胞因子，廣泛參與非小細(xì)胞肺癌的各種細(xì)胞生物學(xué)行為，介導(dǎo)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的交互對(duì)話(crosstalk)，從而協(xié)同促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)然這尚需要更完善的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。通過(guò)特異的MIF siRNA阻斷MIF表達(dá)，檢測(cè)凋亡和增殖相關(guān)的上、下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，進(jìn)一步探討其可能的體內(nèi)外抑癌機(jī)制，本課題組正在進(jìn)行深入研究。

[1]閻春紅，范小航，楊惠玲.等.2-甲氧雌二醇對(duì)人肺癌細(xì)胞的放射增敏作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(1)：137-141.

[2]張淑香，謝燦茂，高橋和久.毒蕈堿膽堿能受體3在小細(xì)胞肺癌增殖和遷移中的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(9)：1679-1683.

[3]Lee MH,Yang HY.Regulators of G1 cyclin-dependent kinases and cancers[J].Cancer Metastasis Rev,2003，22(4): 435-449.

[4]Takahashi N,Nishihira J,Sato Y,et al.Involvement of macrophage migration inhibitory factor(MIF) in the mechanism of tumor cell growth[J].Mol Med,1998,4(11):707-714.

[5]Hira E,Ono T,Dhar DK,et al.Overexpression of macrophage migration inhibitory factor induces angiogenesis and deteriorates prognosis after radical resection for hepatocellular carcinoma[J].Cancer,2005,103(3): 588-598.

[6]Meyer-Siegler KL,Bellino MA,Tannenbaum M.macrophage migration inhibitory factor evaluation compared with prostate specific antigen as a biomarker in patients with prostate carcinoma[J].Cancer,2002,94(5): 1449-1456.

[7]Rendon BE,Roger T,Teneng I,et al.Regulation of human lung adenocarcinoma cell migration and invasion by macrophage migration inhibitory factor[J].J Biol Chem,2007,282(41): 29910-29918.

[8]Ren Y,Chan HM,Li Z,et al.Upregulation of macrophage migration inhibitory factor contribute to induced N-Myc expression by the activation of ERK signaling pathway and increased expression of interleukin-8 and VEGF in neuroblastoma[J].Oncogene,2004，23(23): 4146-4154.

[9]Jung H,Seong HA,Ha H.Critical role of cysteine residue 81 of macrophage migration inhibitory factor(MIF) in MIF-induced inhibition of p53 activity[J].J Biol Chem,2008,283(29):20383-20396.

[10]Binsky I,Haran M,Starlets D,et al.IL-8 secreted in a macrophage migration-inhibitory factor- and CD74-dependent manner regulates B cell chronic lymphocytic leukemia survival[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(33):13408-13413.

[11]Khan N,Cromer CJ,Campa M,et al.Clinical utility of serum amyloid A and macrophage migration inhibitory factor as serum biomarkers for the detection of nonsmall cell lung carcinoma[J].Cancer,2004,101(2):379-384.

[12]Kamimura A,Kamachi M,Nishihira J,et al.Intracellular distribution of macrophage migration inhibitory factor predicts the prognosis of patients with adenocarcinoma of the lung[J].Cancer,2000,89(2):334-341.

[13]White ES,Flaherty KR,Carskadon S,et al.Macrophage migration inhibitory factor and CXC chemokine expression in non-small cell lung cancer: role in angiogenesis and prognosis[J].Clin Cancer Res,2003,9(2): 853-860.

[14]McClelland M,Zhao L,Carskadon S,et al.Expression of CD74,the receptor for macrophage migration inhibitory factor,in non-small cell lung cancer[J].Am J Pathol,2009,174(2):638-646.

[15]Conroy H,Mawhinney L,Donnelly SC.Inflammation and cancer: macrophage migration inhibitory factor(MIF)-the potential missing link[J].QJM,2010,103(11):831-836.

[16]Tomiyasu M,Yoshino I,Suemitsu R,et al.Quantification of macrophage migration inhibitory factor mRNA expression in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance[J].Clin Cancer Res,2002，8(12):3755-3760.

[17]Arenberg D,Luckhardt TR,Carskadon S,et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor growth in the context of lung injury and repair[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,182(8):1030-1037.

血管鈣化轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展研討會(huì)第一輪通知

血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎衰的常見(jiàn)并發(fā)癥，與上述疾病的心血管事件發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)。為促進(jìn)國(guó)內(nèi)血管鈣化領(lǐng)域臨床工作者和基礎(chǔ)科研人員的深入交流與廣泛合作，提升我國(guó)在血管鈣化領(lǐng)域的國(guó)際學(xué)術(shù)影響力，凝練血管鈣化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究隊(duì)伍，由教育部分子心血管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理與病理生理系、附屬北醫(yī)三院和人民醫(yī)院、《生理科學(xué)進(jìn)展》雜志、中日友好醫(yī)院聯(lián)合主辦，茲定于2011年8月27日在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部召開(kāi)首屆血管鈣化轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展研討會(huì)，就血管鈣化的臨床流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、診治及預(yù)后等熱點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行為期一天的探討與交流。會(huì)議邀請(qǐng)了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域知名專家與會(huì)作專題報(bào)告，歡迎從事臨床、基礎(chǔ)、預(yù)防和藥學(xué)工作對(duì)血管鈣化感興趣的學(xué)者踴躍參會(huì)。

會(huì)議無(wú)需注冊(cè)費(fèi)。26號(hào)下午和27號(hào)早8點(diǎn)前報(bào)到，報(bào)名者請(qǐng)于6月1日之前將回執(zhí)發(fā)至kongfanwei2000@gmail.com,由大會(huì)主席批準(zhǔn)后確認(rèn)參會(huì)名單。會(huì)議征集500字論文摘要，內(nèi)容涉及血管鈣化相關(guān)臨床流行病學(xué)、診斷、發(fā)病機(jī)制、治療等方面，請(qǐng)于7月15日之前提交至kongfanwei2000@gmail.com。

會(huì) 議 主 席： 唐朝樞 教授，王 憲 教授

會(huì)議籌備組： 王 悅 教授，王 梅 教授，齊永芬 教授，孔 煒 教授

會(huì)議聯(lián)系人： 孔 煒 教授

電 話： 010-82805594

InhibitionofhumanlungcarcinomaH460cellproliferationbysiRNA-mediatedMIFknockdown

HOU Jun-na1,LUO Yi-feng1,WANG Du-juan2,YANG Hui-ling2,GUO Yu-biao1

(1DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:guoyubiao@hotmail.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA-mediated MIF knockdown on the proliferation of human lung carcinoma H460 cells and to elucidate the molecular mechanism of anti-tumor effect of the siRNA.METHODSThe transfection efficiency was assessed by immunofluorescence technique.The expression of MIF after the gene knockdown was determined by Western blotting.The viability and proliferation of H460 cancer cells were detected by MTT assay and colony formation assay,respectively.The cell apoptosis and morphological changes were examined by flow cytometry and electron microscopy,respectively.RESULTSMIF siRNA significantly inhibited MIF expression in H460 cells,and decreased the proliferation of the cells(Plt;0.05).The morphological changes were detected in the nuclei of H460 cells induced by MIF siRNA.The apoptotic rates were much higher in the groups of MIF siRNA1 and MIF siRNA2 than that in negative control group[(18.09±0.41)％ and(23.38±2.67)％vs(5.87±1.05)％,Plt;0.05].CONCLUSIONMIF might play an important role in the pathogenesis and progression of large cell lung cancer.siRNA-mediated knockdown of MIF results in the inhibition of H460 cell proliferation,indicating that MIF might be used as a potential therapeutic target in lung cancer.

Macrophage migration inhibitory factor; Small interference RNA; Lung neoplasms

1000-4718(2011)05-0853-06

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.005

2010-12-20

2011-03-07

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.10151008901000242)；2010年廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2010B080701010)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8132; E-mail: guoyubiao@hotmail.com