人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞容積激活性氯電流的研究*

曹國振， 左婉紅， 馬文波， 李 媛， 葉文才， 朱林燕， 徐 兵， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科, 廣東 廣州 510515)

人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞容積激活性氯電流的研究*

曹國振1▲， 左婉紅1▲， 馬文波1， 李 媛1， 葉文才2， 朱林燕1， 徐 兵3， 王立偉1△， 陳麗新1△

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科, 廣東 廣州 510515)

目的研究人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(Molt4細(xì)胞)容積激活性氯電流。方法采用膜片鉗全細(xì)胞方式記錄細(xì)胞外低滲液(160 mOsmol/L)激活的Molt4細(xì)胞容積激活性氯電流，分析該電流的特性。結(jié)果Molt4細(xì)胞在等滲溶液中背景電流較小且穩(wěn)定，低滲溶液誘導(dǎo)激活容積激活性氯電流，該電流呈現(xiàn)較明顯的外向優(yōu)勢(shì)，在鉗制電壓0 mV～±120 mV及脈沖波寬200 ms條件下，沒有觀察到明顯的電壓依賴性失活和時(shí)間依賴性失活。該電流具有容積敏感性，可被細(xì)胞外高滲刺激所抑制。氯通道阻斷劑他莫昔芬顯著抑制容積激活性氯電流, 對(duì)內(nèi)向電流和外向電流的抑制作用無顯著差異。結(jié)論Molt4細(xì)胞膜存在容積敏感性氯通道；低滲刺激可激活該通道產(chǎn)生容積激活性氯電流；該通道對(duì)氯通道阻斷劑他莫昔芬敏感。

氯通道； Molt4細(xì)胞系； 膜片鉗術(shù)

調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積減小(regulatory volume decrease, RVD)是指細(xì)胞在低滲刺激時(shí), 細(xì)胞發(fā)生膨脹、容積增大激活了細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)功能,導(dǎo)致胞內(nèi)的溶質(zhì)(主要是離子)及水份外流,使已膨脹的細(xì)胞容積向正常容積轉(zhuǎn)化的過程。在這個(gè)過程中可以激活氯通道開放并產(chǎn)生容積激活性氯電流。我們前文報(bào)道細(xì)胞容積調(diào)節(jié)廣泛參與多種細(xì)胞的生理活動(dòng)，并研究了容積激活性氯電流在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中的作用[1-4]。目前人們對(duì)血液細(xì)胞容積激活性氯電流的作用及特點(diǎn)尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Molt4細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過降低細(xì)胞外滲透壓使細(xì)胞發(fā)生低滲性腫脹，觀察容積激活性氯電流的變化，并分析其特性，這有助于了解淋巴細(xì)胞氯通道在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中的作用，并為以后深入了解氯通道在白血病細(xì)胞增殖及凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

人急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt4培養(yǎng)于10 %新生牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的RPMI- 1640(Roswell Park Memorial Institute-1640) 培養(yǎng)液中， 于5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種在包被多聚賴氨酸的玻片上，待細(xì)胞貼壁1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2主要試劑及溶液

等滲灌流液(isotonic solution，Iso)含(mmol/L):70 NaCl, 0.5 MgCl2,2 CaCl2, 10 HEPES和140 D - 甘露醇。用D - 甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓至300 mOsmol/L。低滲灌流液(47% hypotonic solution)滲透壓為160 mOsmol/L，除不含D - 甘露醇外，其它成分和濃度與等滲液相同，因?yàn)樵撘后w滲透壓(160 mOsmol/L)比等滲液滲透壓(300 mOsmol/L)低47%，故又稱47%低滲液(47% hypotonic solution)。高滲灌流液滲透壓為440 mOsmol/L, 比等滲液滲透壓高47%，又稱47% 高滲液(47% hypertonic solution)。除溶液中D -甘露醇為280 mmol/L 外,余同等滲液。各灌流液分別用Tris(三羥甲基氨基甲烷)液調(diào)pH 至7.4。在離子置換實(shí)驗(yàn)中，低滲液中的氯化鈉被等量的葡萄糖酸鈉或碘化鈉置換。電極內(nèi)液含(mmol/L):70 N -methyl - D - glucamine chloride(NMDG - Cl) , 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 140 D - 甘露醇 和2 ATP。用Tris調(diào)至pH 7.25, 滲透壓調(diào)至300 mOsmol/L。用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(Osmomat030, Gonotec) 檢測(cè)各溶液滲透壓。RPMI-1640、小牛血清、胰蛋白酶購自Gibco。他莫昔芬(tamoxifen) 購自Sigma, 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用甲醇將他莫昔芬配制成50 mmol/L原液，在臨用前用灌流液稀釋至所需濃度。

3單個(gè)白血病細(xì)胞容積激活性氯電流的記錄

采用全細(xì)胞膜片鉗方式記錄細(xì)胞氯電流。用EPC - 7 膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個(gè)的Molt4細(xì)胞全細(xì)胞電流。使用外徑為1.5 mm 、內(nèi)徑為0.86 mm的硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管,在微電極拉制器( PB - 7)上分兩步拉制微電極。微電極充灌電極內(nèi)液后尖端電阻5 - 10 MΩ。電流和電壓信號(hào)用CED 1401( Cambridge)數(shù)字化( 采樣頻率3kHz), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC(CED, Cambridge) 軟件分析。電壓鉗制模式有2 種：(1)細(xì)胞被鉗制在0、-40、+40、-80、+80 mV，并不斷反復(fù)循環(huán)，每個(gè)鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s，在每個(gè)鉗制脈沖開始10 ms 后取值；(2)鉗制電壓-120 mV～120 mV，步增20 mV，每個(gè)鉗制脈沖波寬300 ms。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞玻片安放在灌流槽中,為適應(yīng)灌流環(huán)境，預(yù)先用等滲液灌流細(xì)胞5 min, 然后記錄細(xì)胞在等滲灌流液中的背景電流，用細(xì)胞外灌流47%低滲液的方法，誘導(dǎo)并記錄全細(xì)胞容積激活性氯電流的變化。當(dāng)容積激活性氯電流達(dá)到最大值并穩(wěn)定時(shí)，在灌流液中加入氯通道阻斷劑他莫昔酚，等待氯電流達(dá)到最小值并平穩(wěn)，計(jì)算電流抑制率。所有實(shí)驗(yàn)在室溫下(20- 24 ℃)進(jìn)行。

計(jì)算氯通道阻斷劑對(duì)全細(xì)胞電流抑制率公式:抑制率(%) = [(Chypotonic solution-Cisotonic solution)-(Ctamoxifen-Cisotonic solution)] /(Chypotonic solution-Cisotonic solution)×100%。其中Chypotonic solution:灌流47%低滲液電流峰值； Cisotonic solution: 灌流等滲液時(shí)背景電流； Ctamoxifen:加入阻斷劑他莫昔芬后的全細(xì)胞容積激活性電流值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1低滲刺激誘導(dǎo)的Molt4細(xì)胞氯電流

細(xì)胞被鉗制在0 mV, 以0 mV、±40 mV和±80 mV順序循環(huán)往復(fù), 每一電位持續(xù)200 ms, 兩電位之間間隔4s。在等滲條件下，背景電流較小而且相對(duì)穩(wěn)定。然而，當(dāng)細(xì)胞受到47%低滲刺激時(shí)，在(59.12±11.01) s氯電流開始增大( 圖1A )，該電流在3-5 min內(nèi)達(dá)到峰值，然后保持相對(duì)穩(wěn)定，電流最大值比背景電流增大約50-60倍。

Figure 1. Chloride currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells.A:the typical time course of current recordings;B:the typical current traces at the maximal activation in hypotonic solutions. Iso: isotonic bath solution; Hypo:47% hypotonic bath solution;Hyper: 47% hypertonic bath solution. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV in A and between -120 and +120 mV in 20 mV steps in B, respectively.

2Molt4細(xì)胞容積激活性氯電流的特性

在鉗制電壓±120 mV、鉗制脈沖波寬300 ms時(shí), 低滲刺激誘導(dǎo)的Molt4細(xì)胞氯電流沒有出現(xiàn)明顯的電壓依賴性失活和時(shí)間依賴性的失活,見圖1B。如圖2所示，低滲刺激誘導(dǎo)的氯電流的外向電流較大[(122.66 ±19.90)pA/pF，+80 mV]，而內(nèi)向電流較小[(-88.11±18.35)pA/pF，-80 mV],表現(xiàn)為較明顯的外向優(yōu)勢(shì)(Plt;0.01)。該電流的翻轉(zhuǎn)電位為(-2.30± 0.37) mV, 接近本實(shí)驗(yàn)條件氯離子平衡電位理論值(-0.9 mV)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低滲激活的氯通道是容積敏感性的。當(dāng)容積激活性氯電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)后，將細(xì)胞外的47%低滲溶液置換為47%高滲溶液, 電流迅速減小，見圖1A。

3氯通道阻斷劑抑制Molt4細(xì)胞容積激活性氯電流

結(jié)果顯示，細(xì)胞外灌流他莫昔酚(20 μmol/L)顯著抑制47%低滲液激活的Molt4全細(xì)胞氯電流,見圖3A，他莫昔酚作用前后細(xì)胞氯電流有顯著差異(Plt;0.01)，見圖3B、3C。在鉗制電壓為-80 mV時(shí)，他莫昔酚對(duì)內(nèi)向電流的抑制率達(dá)75.66%±6.15%(Plt;0.01)，在鉗制電壓為+80 mV時(shí)，抑制外向電流達(dá)78.11%±6.56%(Plt;0.01)。他莫昔酚對(duì)內(nèi)向電流的抑制作用和對(duì)外向電流的抑制作用無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖4。他莫昔芬對(duì)電流的抑制是可逆的，去除灌流液中的他莫昔芬，容積激活性氯電流部分恢復(fù)。

Figure 2. Current-voltage relationship of volume-activated chloride currents in Molt4 cells±s.n= 19.**Plt;0.01 vs isotonic solution. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.

Figure 3. Inhibition of the hypotonicity-activated chloride current by the chloride channel blocker tamoxifen in Molt4 cells. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.A:the typical time course of current recordings;B and C:the current traces at the maximal activation in hypotonic solutions and after treatment with tamoxifen,respectively. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

Figure 4. The effects of tamoxifen on the outward(at +80 mV) and inward(at -80 mV) currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells±s.n=5.**Plt;0.01 vs control.

4容積激活性氯通道的離子選擇性

當(dāng)?shù)蜐B激活的氯電流達(dá)到最大并平穩(wěn)后，將含70 mmol/L 氯化鈉的低滲灌流液換成含等量葡萄糖酸鈉或碘化鈉的低滲液。結(jié)果顯示，低滲液中的氯化鈉被葡萄糖酸鈉置換后，電流減小，基線下移，見圖5A,而低滲液中的氯化鈉被碘化鈉置換后，電流增大，基線上移(未顯示結(jié)果)。分析所記錄的結(jié)果表明，Molt4細(xì)胞容積激活性氯通道對(duì)碘離子和葡萄糖酸離子的相對(duì)通透性(PI/PCl、Pgluconate/PCl；設(shè)定PCl為1)分別為1.05±0.05(Plt;0.05)和0.31±0.05(Plt;0.01)，即此通道對(duì)陰離子通透性的大小為碘離子gt; 氯離子gt;葡萄糖酸離子，見圖5B。

Figure 5. Anion permeability of volume- activated chloride channels in Molt4 cells±s.n=5.*Plt;0.05, **Plt;0.01 vs Cl-. Hypo: 47% hypotonic solution.

討 論

分布在血液中的血液細(xì)胞，能直接感受血液滲透壓的變化，血液滲透壓的微小變化可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生滲透性容積變化，低滲使細(xì)胞膨脹，高滲致細(xì)胞皺縮，細(xì)胞須有較強(qiáng)的容積調(diào)節(jié)能力，才能維持本身正常的形態(tài)和體積。細(xì)胞在受到低滲刺激發(fā)生膨脹而激活容積調(diào)節(jié)功能,導(dǎo)致胞內(nèi)的溶質(zhì)(主要是離子)及水外流,使已膨脹的細(xì)胞容積回縮，向正常容積轉(zhuǎn)化。在這個(gè)過程中，氯通道開放起重要作用，滲透性容積增大可以激活氯通道開放而產(chǎn)生氯電流，即容積激活性氯電流。Nilius等[5]很早在內(nèi)皮細(xì)胞記錄到了低滲激活的氯通道電流,發(fā)現(xiàn)該電流可明顯減輕細(xì)胞在低滲刺激下腫脹的程度。到目前為止, 容積激活性氯通道已被證實(shí)廣泛分布在多種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上。容積激活性氯通道在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，探討了人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Molt4細(xì)胞在低滲刺激下容積激活性氯電流的特性。結(jié)果表明， Molt4細(xì)胞膜有容積敏感性氯通道，可被細(xì)胞外低滲刺激激活和被高滲刺激抑制。當(dāng)細(xì)胞接受低滲刺激而膨脹時(shí)，細(xì)胞膜上的氯通道開放，氯離子外流，相反，當(dāng)細(xì)胞處于高滲環(huán)境中而皺縮時(shí)，細(xì)胞膜氯通道關(guān)閉，氯離子外流減少。表明在低滲刺激時(shí)氯離子外流伴隨水外流，而使?jié)q大的細(xì)胞容積趨于減小。而在高滲刺激時(shí)氯離子和水外流減少而使細(xì)胞容積趨于增大。Molt4細(xì)胞膜上的容積激活性的氯電流呈現(xiàn)明顯的外向優(yōu)勢(shì)，沒有明顯的時(shí)間依賴性失活和電壓依賴性失活。Molt4細(xì)胞膜容積激活性氯通道對(duì)氯通道阻斷劑他莫昔芬很敏感，他莫昔芬可以阻斷已開放的氯通道，顯著抑制容積激活性氯電流, 對(duì)內(nèi)向電流和外向電流的抑制作用無顯著差異。另外， Molt4細(xì)胞膜容積激活性氯通道對(duì)陰離子的通透性為碘離子gt;氯離子gt;葡萄糖酸離子。結(jié)果表明，Molt4細(xì)胞氯通道的特性與其它種類細(xì)胞相似，然而其容積敏感性氯電流的產(chǎn)生在幾分鐘后才能達(dá)到峰值，這提示Molt4細(xì)胞對(duì)低滲刺激的敏感性似乎低于其它種類細(xì)胞[6],其細(xì)胞膜上的氯通道需要較長時(shí)間或者較大的容積變化才能被充分激活。

細(xì)胞膜的氯通道參與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)，如細(xì)胞容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、增殖、凋亡和遷移等[7,8]，某些抗癌藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中有氯通道的參與。阻斷氯通道可以降低細(xì)胞容積的調(diào)節(jié)能力，干擾細(xì)胞的功能[8]，阻斷氯通道可以不同程度地逆轉(zhuǎn)某些抗癌藥物對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用[9]。

研究容積敏感性氯通道的特點(diǎn)和機(jī)制不僅有助于我們很好地理解生理狀況下細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的機(jī)制，有助于更好地理解抗癌藥物的作用機(jī)制，而且有助于尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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Volume-activatedchloridecurrentsinhumanacutelymphoblasticleukemiaMolt4cells

CAO Guo-zhen1, ZUO Wan-hong1, MA Wen-bo1, LI Yuan1, YE Wen-cai2, ZHU Lin-yan1, XU Bing3, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin1

(1SchoolofMedicine,2CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofHematology,SouthernMedicalUniversityNanfangHospital,Guangzhou510515,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To characterize the chloride current activated by extracellular hypotonic stress in human acute lymphoblastic leukemia Molt4 cells.METHODSThe technique of whole-cell patch clamp recording was used to detect the volume-activated Cl-current in Molt4 cells. The characteristics of the current were investigated.RESULTSThe background Cl-current was weak and stable under isotonic condition. However, a large Cl-current was induced by exposure of the cells to 47% hypotonic solution. The current showed a characteristic of outward rectification. No voltage-dependent inactivation and time-dependent inactivation were observed. The current was sensitive to the change of cell volume and was inhibited by extracellular hypertonic solution. Extracellular tamoxifen, which is one of the chloride channel blockers, significantly inhibited the current. The effects of tamoxifen were almost equal for both inward and outward currents (Pgt;0.05).CONCLUSIONThere are volume-activated chloride channels on the cell membrane of Molt4 cells. Exposure of the cells to a hypotonic solution activates the chloride channels and induces a volume-activated chloride current. The volume-activated Cl-channels are sensitive to tamoxifen in Molt4 cells.

Chloride channels; Molt4 cell line; Patch-clamp techniques

1000-4718(2011)04-0677-05

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.11

2010-12-14

2011-02-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30771106;No.30870567; No.30871267;No.90913020;No.U0932004); 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 07005974)

△通訊作者 王立偉 Tel: 020-85220260;E-mail: wangliweic@sohu.com;陳麗新 Tel: 020-85228865;E-mail: chenlixinw@sohu.com

▲并列第1作者