木槿花醇溶性色素的提取及其清除超氧自由基活性研究

耿明江 范秉琳 李琴等

摘要：測(cè)定了木槿花醇溶性色素在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，以吸光度與浸提液總體積之積為指標(biāo)，對(duì)提取溫度、浸提時(shí)間、超聲時(shí)間和料液比進(jìn)行優(yōu)選研究，采用鄰苯三酚自氧化法考察該色素清除超氧自由基活性。結(jié)果顯示最佳提取工藝條件為提取溫度40℃，料液比1∶50（W/V，g∶mL），浸提時(shí)間1 h（包括超聲時(shí)間45 min）；該色素具有一定的清除超氧自由基活性。

關(guān)鍵詞：木槿花；醇溶性色素；正交試驗(yàn)；超氧自由基

中圖分類號(hào)：Ｓ６８５．９９ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）16－3378-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｓｃａｖｅｎｇｅ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.

ＧＥＮＧ Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎｇ１，ＦＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉｎ１，ＬＩ Ｑｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａｉ－ｋｕｎ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ of Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ２．Ａｎａｌｙｓｉｓ ＆ Ｔｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ３．Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｗｅｉｈｕｉ ４５３１００，Henan， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ. ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ （Ａ·Ｖ）， ａｍｏｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ temperature， ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌ－ｓｏｌｖｅｎｔ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ was extracting temperature 40 ℃， material-solvent ratio 1∶50（W/V，g∶mL）， soaking time 1h（including ultrasonic time 45 min）， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.； ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ

木槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.）屬于錦葵科木槿屬落葉喬木，夏季滿枝綴花，花朵大而艷麗，花、葉對(duì)ＳＯ２、ＮＯｘ具有較強(qiáng)的吸收性和耐受性［１］，因而被廣泛用作庭院、街道的綠化植物。此外，木槿還是一種重要的藥用植物，其根、皮、花、種子皆可入藥［２，３］。Ｋｗｏｎ等［４］考察了熱處理對(duì)木槿枝、根醇提取物抗氧化活性的影響。金月亭等［５］證實(shí)木槿花的乙醇研磨液具有一定的抑菌、促進(jìn)凝血的活性。景立新等［６］從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的角度對(duì)木槿花進(jìn)行了研究。蔣新龍的研究小組先后對(duì)木槿花中的總黃酮［７］、紅色素［８］的提取工藝進(jìn)行了探討。本試驗(yàn)以干燥粉碎的重瓣紫色木槿花花瓣為原料，對(duì)木槿花醇溶性色素的提取工藝及其清除超氧自由基活性進(jìn)行研究，以期為木槿花色素的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１木槿花木槿花于２０１０年８月采摘于河南省新鄉(xiāng)市新中大道，花瓣經(jīng)３５～４０ ℃鼓風(fēng)干燥４８ ｈ，粉碎后避光保存?zhèn)溆谩?/p>

１．１．２試劑維生素Ｃ，美國(guó)Sｉｇｍａ公司，其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，使用前未進(jìn)行任何純化處理。除自由基活性測(cè)試過(guò)程中用水為二次蒸餾水外，其他檢測(cè)用水均為去離子水。８６００２１大孔吸附樹(shù)脂，山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司，使用前按說(shuō)明書(shū)所示方法進(jìn)行活化處理。

１．１．３儀器島津ＵＶ２５５０紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，ＳＥＮＣＯ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，１０１－３型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，Ｓａｒｔｏｕｒｕｓ ＢＳ２４４ 電子分析天平，ＫＱ－１００ＤＢ型超聲波清洗器，多功能粉碎機(jī)，恒溫水浴鍋，雷磁ＰＨＳ－３Ｂ型酸度計(jì)。

１．２方法

１．２．１色素的提取準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的木槿花瓣粉末于５０ ｍＬ具塞三角瓶中，加入溶劑，按一定的水浴溫度、超聲時(shí)間、浸提時(shí)間和料液比進(jìn)行提取，冷卻后過(guò)濾；然后向?yàn)V液中加入一定體積的９５％乙醇，使終體積分?jǐn)?shù)約為８０％，將此液體以

４ ０００ ｒ／ｍｉｎ的速度離心５ ｍｉｎ，棄去沉淀，上清液經(jīng)減壓濃縮后得粗色素浸膏。

１．２．２色素的精制向色素浸膏中加入少量水，超聲分散后，石油醚萃取２次；水相上８６００２１大孔吸附樹(shù)脂柱，先用４倍柱體積的水洗后，再用９５％乙醇進(jìn)行洗脫；將洗脫液減壓蒸去乙醇，得紫黑色色素粉末。

１．２．３色素吸收光譜的測(cè)定取適量精制的色素粉末，用５０％乙醇溶解后得紅色溶液。以等體積分?jǐn)?shù)乙醇為參比，將此溶液在３００～８００ ｎｍ的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得其吸收曲線。

１．２．４單因素試驗(yàn)影響色素得率的因素較多，本試驗(yàn)主要從浸提溫度、時(shí)間、超聲時(shí)間和料液比等方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)。浸提溫度選取２０、３０、４０、５０、６０℃ ５個(gè)水平，提取時(shí)間選?。?、２、３、４、５ ｈ ５個(gè)水平，超聲時(shí)間選取０、１５、３０、４５、６０ ｍｉｎ ５個(gè)水平，料液比選?。薄茫常啊ⅲ薄茫矗?、１∶５０、１∶６０、１∶７０（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）５個(gè)水平，分別進(jìn)行試驗(yàn)。

１．２．５正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以提取液的吸光度（Ａ）與浸提液的總體積（V）之積為得率考察指標(biāo)，采用Ｌ９（３４）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表１。試驗(yàn)結(jié)果利用Ｏｒｉｇｉｎ ７．５進(jìn)行方差分析，篩選出提取醇溶性色素的最佳條件，并對(duì)所得的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

１．２．６體外清除超氧自由基活性試驗(yàn)根據(jù)許申鴻等［９］所述方法稍加改變。在４ ｍＬ反應(yīng)混合物中含有Ｔｒｉs－ＨＣｌ緩沖溶液（ｐＨ值為８．２）３．４ ｍＬ、２０

ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ水溶液０．２ ｍＬ、不同含量的精制色素水溶液０．２ ｍＬ、５ ｍｍｏｌ／Ｌ的鄰苯三酚０．２ ｍＬ。先將混合物于２５℃保溫２０ ｍｉｎ， 再加入等溫的鄰苯三酚溶液；加入后立即搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)４ ｍｉｎ，立即在４２０ ｎｍ波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Ａｉ。同時(shí)設(shè)立自身組（Ａｉ′）和控制組（Ａ０），分別以等體積的水代替鄰苯三酚或色素，并以維生素Ｃ為正的對(duì)照試驗(yàn)。清除率（％）＝［１－（Ａｉ＋Ａｉ′）／Ａ０］×１００。

２結(jié)果與分析

２．１木槿花醇溶性色素的光譜特征

從圖１可知醇溶性色素在可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)有一個(gè)較明顯的吸收，其最大吸收峰位于５３４ ｎｍ處。故本試驗(yàn)均以５３４ ｎｍ作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

２．２單因素試驗(yàn)

將０．５ ｇ木槿花瓣粉末分別溶于一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇中，控制其他因素，考察改變某單一因素時(shí)對(duì)醇溶性色素A·V值的影響（圖２）。由圖２可知，當(dāng)料液比為１∶４０、超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、浸提時(shí)間為２ ｈ時(shí)，醇溶性色素的A·V值在２０～６０ ℃范圍內(nèi)隨著提取溫度的升高，A·V值相應(yīng)增大；當(dāng)溫度超過(guò)５０ ℃時(shí)，溫度對(duì)色素A·V值的影響變小，因此以５０ ℃為提取溫度較為合適。當(dāng)固定料液比１∶４０、超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、（５０±１）℃恒溫條件下，改變浸提時(shí)間，醇溶性色素的A·V值隨浸提時(shí)間的增加而增大；但當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到３ ｈ后，浸提時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)色素A·V值的影響不大。當(dāng)固定料液比１∶４０、５０ ℃恒溫、浸提時(shí)間共計(jì)２ ｈ時(shí)，超聲處理時(shí)間對(duì)醇溶性色素的A·V值影響較為明顯，并且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，色素的A·V值會(huì)相應(yīng)增加；但當(dāng)超過(guò)４５ ｍｉｎ后，增幅變緩。當(dāng)超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、總提取時(shí)間為２ ｈ、提取溫度保持在（５０±１）℃時(shí)，隨料液比的改變色素的A·V值發(fā)生相應(yīng)的變化，考慮到料液比過(guò)大會(huì)使后面的沉淀、離心、濃縮等工作量增大，且耗費(fèi)更多的乙醇和熱能，因此料液比為１∶４０～１∶６０較為合適。

２．３正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)上述各因素選定３個(gè)水平，以浸提液的吸光度（Ａ）與浸提液的總體積（Ｖ）之積（Ａ·Ｖ）為得率考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。其正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表２。由表２結(jié)果可知，Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即影響木槿花色素提取效果的各因素主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞料液比＞提取溫度＞浸提時(shí)間。

由方差分析結(jié)果可知，除浸提時(shí)間外，其他各因素均對(duì)色素的提取效果有顯著性差異。根據(jù)表２可知最佳工藝條件為Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，但考慮到在４０、５０ ℃時(shí)提取效果增加不明顯，而溫度越高所消耗的能源就越多，從節(jié)約能源角度綜合考慮，提取色素最佳工藝條件定為Ａ３Ｂ１Ｃ2Ｄ２，即在４０ ℃條件下，按

１∶５０的料液比混合后先超聲處理４５ ｍｉｎ，然后再浸取1５ ｍｉｎ。

２．４驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取０．５ ｇ干燥木槿花花瓣粉末，按上述所得最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，醇溶性色素的A·V值分別為１３．５５０、１３．６００、１３．４７５，平均A·V值為１３．５４２。

２．5木槿花色素對(duì)超氧自由基的清除作用

從表３可以看出，木槿花色素具有一定的清除超氧自由基活性，并且這種活性隨著色素濃度的升高而增強(qiáng)，表明它們間存在一定的量效關(guān)系。但對(duì)比ＶC的清除活性可知，在等濃度條件下該色素活性比ＶC要弱得多，色素對(duì)超氧自由基清除率達(dá)５０％時(shí)所需濃度（ＥＣ５０）大于１０ ｇ／Ｌ（清除率為４０．３％），而ＶC的ＥＣ５０小于０．４ ｇ／Ｌ（消除率為６７．８％）。因此該色素并不是一種很強(qiáng)的清除超氧自由基活性物質(zhì)。

３結(jié)論

影響木槿花色素得率的因素依次為：超聲時(shí)間、料液比、提取溫度和浸提時(shí)間，最佳提取工藝條件是：溫度４０℃、料液比１∶５０、提取時(shí)間1 ｈ（包括超聲處理４５ ｍｉｎ）。3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為０．４３３％，說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定可行。木槿花色素具有一定清除超氧自由基的活性，并且其清除能力與濃度存在量效關(guān)系。

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