一株海洋光合細(xì)菌D25的分離與鑒定

劉天華 李樂樂 喬夢等

摘要：從威海近海采得的海洋沉積物中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選，得到一株紫色菌落的海洋光合細(xì)菌，編號為Ｄ２５。利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株的生理生化特征進(jìn)行了檢測，ＡＰＩ ２０Ｅ檢測結(jié)果共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陽性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陰性。經(jīng)ＰＣＲ反應(yīng)得到１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列測定和分析結(jié)果顯示該菌株為嗜硫小紅卵菌 （Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）。

關(guān)鍵詞：海洋；光合細(xì)菌；１６Ｓ ｒＲＮＡ基因；生理生化

中圖分類號：Ｑ９３－３３１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）16－3276-03

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ２５

ＬＩＵ Ｔｉａｎ－ｈｕａ，ＬＩ Ｌｅ－ｌｅ，ＱＩＡＯ Ｍｅｎｇ，ＸＩＥ Ｆｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｔ Ｗｅｉｈａｉ，Ｗｅｉｈａｉ ２６４２０９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｐｕｒｐｌｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｎｕｍｂｅｒｅｄ Ｄ２５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ＷｅｉＨａｉ ｏｆｆｓｈｏｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２５ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｎｅｗ ＡＴＢ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＡＰＩ ２０Ｅ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ４ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｕｃｈ ａｓ ＡＤＨ ａｎｄ ＣＩＴ ，１６ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｋｅ ＯＮＰＧ ａｎｄ ＬＤＣ． Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆied ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ａｓ Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｒｉｎｅ； ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

光合細(xì)菌（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＳＢ），是一類在自然界中廣泛存在的，能在厭氧條件下進(jìn)行不放氧的光合作用并且能夠利用光能自養(yǎng)生長，具有復(fù)雜代謝功能的細(xì)菌的總稱。其具有固碳、固氮、脫氮、氧化硫化物等功能，是生命演化中的過渡類型，可作為光合作用機(jī)理和產(chǎn)氫固氮機(jī)理的研究材料［１－３］。由于光合細(xì)菌可以廣泛利用多種有機(jī)物，具有在不同的條件下進(jìn)行多種方式的生長代謝的特點(diǎn)，使其在有機(jī)廢水處理中得以應(yīng)用，和傳統(tǒng)活性污泥法相比，利用光合細(xì)菌處理污水具有動力消耗低、脫氮除磷效果好、設(shè)備規(guī)模小、占地面積小、管理簡易等明顯優(yōu)勢［１］。此外，由于光合細(xì)菌具有凈化水質(zhì)和保護(hù)水環(huán)境的作用，加之其本身是活蛋白，營養(yǎng)豐富，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面可以促進(jìn)生長，提高成活率和養(yǎng)殖效果，含有的抗病毒因子及多種免疫促進(jìn)因子可活化機(jī)體的免疫系統(tǒng)，因此其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也得到了廣泛的應(yīng)用［４］。對海洋沉積物中的一株光合細(xì)菌Ｄ２５進(jìn)行分離并對其生理生化特性進(jìn)行研究以及１６ＳｒＲＮＡ 基因序列的測定和分析，經(jīng)鑒定該菌株為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１海洋沉積物海洋沉積物由威海近海海域采得。

１．１．２培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基：氯化銨１.0 ｇ，乙酸鈉２.0 ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ，酵母膏０．２ ｇ，蛋白胨０．２ ｇ， ＥＤＴＡ １.0 ｇ，１ ０００ ｍＬ陳海水，ｐＨ值為７，滅菌后加入碳酸氫鈉１.0 ｇ， 磷酸二氫鉀０．２ ｇ。分離培養(yǎng)基：蛋白胨５.00 ｇ，酵母粉１.00 ｇ，檸檬酸鐵０．０１ ｇ，瓊脂１８.00 ｇ，陳海水１ ０００ ｍＬ，pＨ值為７。

１．２方法

１．２．１海洋光合細(xì)菌的富集取海洋沉積物約３ ｇ，置于盛滿富集培養(yǎng)基的２５０ ｍＬ密閉富集培養(yǎng)瓶中，置于有恒定光源（２５Ｗ白熾燈泡）的恒溫培養(yǎng)箱中在２８ ℃條件下富集培養(yǎng)３０ ｄ，至培養(yǎng)液呈紅褐色時，富集結(jié)束。

１．２．２海洋光合細(xì)菌的分離對富集得到的培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后采用涂布法轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中２８ ℃恒溫培養(yǎng)５ ｄ。選取紫色單菌落進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化培養(yǎng)，得到海洋光合細(xì)菌的純培養(yǎng)菌株Ｄ２５。

１．２．３生理生化特性檢測取一環(huán)分離純化得到的純培養(yǎng)菌株，通過劃線的方法轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中２８ ℃恒溫培養(yǎng)４８ ｈ。利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（ＡＰＩ ２０Ｅ鑒定試劑條）對菌株進(jìn)行生理生化特征的檢測與分析。

１．２．４１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列測定和分析［５－８］ 將菌株轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中于恒定光源的恒溫培養(yǎng)箱中２８ ℃培養(yǎng)過夜。取一環(huán)單菌落懸浮于５０ μＬ無菌去離子水中，１００ ℃水浴加熱５ ｍｉｎ，離心，取上清液作為ＰＣＲ模板ＤＮＡ。擴(kuò)增正向引物２７Ｆ對應(yīng)于Ｅ． ｃｏｉｌ １６ＳｒＤＮＡ序列的第８～２７個堿基位置，反向引物１４９２Ｒ對應(yīng)于Ｅ． ｃｏｌｉ １６ＳｒＤＮＡ的第１４９２～１５１０個堿基位置，其序列分別為５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ（Ｃ／Ａ）ＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′和５′－ＴＡＣＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡ

ＣＧＡＣＴＴ－３′。１０２．１０ μＬ ＰＣＲ反應(yīng)體系組成為：１×ＰＣＲ緩沖液，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２，４×ｄＮＴＰ混合物各２００ μｍｏｌ／Ｌ，引物各０．５ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶

１ μＬ（５ Ｕ／μＬ），２ μＬＤＮＡ 原液。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９６ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５０ ℃復(fù)性1 ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３０個循環(huán)；最后７２ ℃ 溫育７ ｍｉｎ。ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定。

向ＧｅｎＢａｎｋ提交測得的基因序列，取得收錄號。通過ＮＣＢＩ網(wǎng)站選取相似程度較高的序列利用ＭＥＧＡ（４．１）軟件對其進(jìn)行序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定其種屬及進(jìn)化位置。

２結(jié)果與分析

２．１海洋光合細(xì)菌的分離篩選結(jié)果

通過富集培養(yǎng)，３０ d后觀察到富集培養(yǎng)液變?yōu)榧t褐色，將富集培養(yǎng)液稀釋，涂布于分離培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)后再次劃線分離得到1株純培養(yǎng)光合細(xì)菌，編號為Ｄ２５。

在分離培養(yǎng)基上，２８ ℃恒溫培養(yǎng)７２ ｈ，可觀察到紫色、直徑０．５～０．８ ｍｍ圓形、表面隆起、邊緣整齊、不透明的菌落。經(jīng)革蘭氏染色鑒定其為革蘭氏陰性菌。

２．２生理生化特性檢測

利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株的生理生化特征進(jìn)行了檢測，ＡＰＩ ２０Ｅ檢測結(jié)果（表１）表明，共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陽性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陰性。

２．２１６Ｓｒ ＲＮＡ基因序列測定與分析結(jié)果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，得到的目的片段長度約為１ ５００ ｂｐ。將得到的目的片段交由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定，得到核苷酸序列（圖１）。向ＧｅｎＢａｎｋ提交測得的基因序列，取得收錄號為ＨＱ２３４２９９。通過ＮＣＢＩ網(wǎng)站選取相似程度較高的序列，利用ＭＥＧＡ（４．１）軟件對其進(jìn)行序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定其種屬及進(jìn)化位置。該菌株為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的嗜硫小紅卵菌（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ），是一類能產(chǎn)氫的光合細(xì)菌，由此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖２）。

３小結(jié)與討論

２０世紀(jì)６０年代日本科學(xué)家小林正泰等［９］發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌在不同營養(yǎng)級的微生物群生態(tài)演替的過程中起著十分重要的作用，而該過程是高濃度有機(jī)廢水在自然界得以自凈的原因所在。采用光合細(xì)菌處理污水不僅能夠降解簡單的有機(jī)化合物，而且還能夠降解較難處理的芳香化合物和鹵代化合物，因此光合細(xì)菌處理污水具有較大的推廣應(yīng)用價值［１］。隨著對光合細(xì)菌研究的深入，光合細(xì)菌作為一種具有特殊營養(yǎng)、促生長、抗病因子和高效率凈化養(yǎng)殖污水及對環(huán)境和水產(chǎn)動物無毒無害的特殊細(xì)菌［４］，在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域中被逐漸得到了應(yīng)用。

試驗(yàn)從海洋沉積物中分離篩選得到了海洋光合細(xì)菌Ｄ２５，通過ＰＣＲ技術(shù)擴(kuò)增得到其１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，經(jīng)測序和比對，將其鑒定為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，由此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了其親緣進(jìn)化關(guān)系。嗜硫小紅卵菌是一種能利用還原性硫化物作為光合電子供體營光自養(yǎng)生長的嗜鹽紫色非硫細(xì)菌，這種代謝的方式對凈化海水、海產(chǎn)養(yǎng)殖地和高鹽含硫廢水的生物治理將具有重要意義。其菌體含有較為豐富的蛋白質(zhì)和色素，可作為魚類的開口飼料資源的重要來源，此外用其來培育輪蟲等多種餌料生物，其所含有的營養(yǎng)物質(zhì)可以通過食物鏈的關(guān)系間接供給水產(chǎn)養(yǎng)殖動物［１０］，因此菌株Ｄ２５在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有著廣泛的利用價值。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 周洪波，劉飛飛，邱冠周． 一株光合細(xì)菌的分離鑒定及污水處理能力研究［Ｊ］． 生態(tài)環(huán)境，２００６，１５（５）：９０１－９０４．

［２］ 谷志靜，陳錫時，韓士杰，等． 海洋光合細(xì)菌Ｒｘ 菌株的分離鑒定與生物學(xué)特性研究［Ｊ］． 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００４，３２（９）：７－５２．

［３］ 程新，涂曉嶸，魏賽金，等． 一株光合細(xì)菌的分離鑒定及其處理污水能力的研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（１０）：４３９１－４３９３．

［４］ 黃鈞，陳琴，韋勇剛，等． 光合細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用概況［Ｊ］． 廣西畜牧獸醫(yī)，２００１，１７（１）：３９－４１．

［５］ 莫照蘭，茅云翔，陳師勇，等． 一株牙鲆出血癥病原菌的分子生物學(xué)鑒定［Ｊ］． 高技術(shù)通訊，２００１（１２）：１２－１７．

［６］ 李筠，顏顯輝，陳吉祥，等． 養(yǎng)殖大菱鲆腹水病病原的研究［Ｊ］． 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，２００６，３６（４）：６４９－６５４．

［７］ ＫＵＭＡＲ Ｓ，ＴＡＭＵＲＡ Ｋ，ＮＥＩ Ｍ． ＭＥＧＡ３： Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５：１５０－１６３．

［８］ 賈晶，張小葵，鄭凱，等． 一株土壤瓊膠降解菌ＱＭ６４ 的１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分析［Ｊ］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，４８（８）：１８１１－１８１３．

［９］ 黃寶興，李蘭生，趙亮，等． 固定化海洋光合細(xì)菌處理生活污水的研究［Ｊ］．海洋湖沼通報(bào)，２００６（２）：６９－７４．

［１０］ 王紹校，楊惠芳，黃志勇，等． 嗜鹽光合細(xì)菌的分離鑒定及其營養(yǎng)成分分析［Ｊ］． 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，２００３，９（３）：２９８－３０１．