花生多肽對(duì)小鼠免疫功能影響的研究

劉麗娜 何東平 張聲華 王文亮 杜方嶺

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所1,濟(jì)南 250100)

(武漢工業(yè)學(xué)院食品學(xué)院2,武漢 430023)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院3,武漢 430070)

花生多肽對(duì)小鼠免疫功能影響的研究

劉麗娜1,2,3何東平2張聲華3王文亮1杜方嶺1

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所1,濟(jì)南 250100)

(武漢工業(yè)學(xué)院食品學(xué)院2,武漢 430023)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院3,武漢 430070)

本試驗(yàn)旨在探討花生多肽對(duì)正常小鼠生長(zhǎng)發(fā)育及免疫功能的影響。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn),測(cè)定小鼠體重、臟器及免疫器官質(zhì)量、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞 (NK cell)活性、血清免疫球蛋白 (IgG)含量等理化指標(biāo)及免疫器官的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明,花生多肽能夠增加小鼠的體重、臟器質(zhì)量和臟器指數(shù)、免疫器官質(zhì)量和指數(shù),促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育。中[200 mg/(kg·d)]、高劑量組[400 mg/(kg·d)]花生多肽能夠調(diào)節(jié)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、增強(qiáng) NK細(xì)胞活性及血清 IgG的含量,顯著提高機(jī)體的免疫功能。小鼠免疫器官病理切片觀察結(jié)果表明:中、高劑量花生多肽組小鼠脾臟組織淋巴小結(jié)生發(fā)中心擴(kuò)張,增加了網(wǎng)狀細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)目,這提示花生多肽有提高機(jī)體免疫的作用。

花生多肽 免疫 臟器指數(shù) 免疫器官指數(shù) 遲發(fā)型超敏反應(yīng) 自然殺傷細(xì)胞 免疫球蛋白

花生多肽含有人體所必須的 8種氨基酸,此外谷氨酸的含量相當(dāng)高,多肽中分子質(zhì)量低于 1 000 u的組分高達(dá) 90.53%[1]?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)研究表明:相對(duì)分子質(zhì)量低于 1 000的短肽極易被吸收,具有較強(qiáng)的生物活性和功能特性[2-3]。試驗(yàn)采用 Alcalase蛋白酶水解花生冷榨粕制備的花生多肽,在制備過(guò)程中采用了膜過(guò)濾和低溫干燥等工藝,產(chǎn)品得率 86.79%,水解度 19.61%。對(duì)花生多肽的營(yíng)養(yǎng)及免疫功能進(jìn)行研究,從花生多肽對(duì)小鼠臟器質(zhì)量、指數(shù)及理化性質(zhì)及形態(tài)學(xué)變化的影響等方面來(lái)探討花生多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響,為廣泛開(kāi)發(fā)利用花生多肽提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠,120只,2周齡,體重 (15±2)g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供,許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005;花生冷榨粕:山東德州宏鑫花生蛋白食品有限公司提供;IgG放免分析藥盒:原子高科股份有限公司;NK細(xì)胞試劑盒:美國(guó) ADL公司;普通小鼠飼料:湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;其他試劑均為分析純。

FS-1型勻漿器:江蘇省金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠;2-16K型高速冷凍離心機(jī):美國(guó) Sigma公司;DFM-96型 10管放射免疫γ計(jì)數(shù)器:安徽合肥眾成機(jī)電有限公司;Model550多功能酶標(biāo)儀:日本 Bio-RAD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生多肽的制備

花生多肽制備工藝流程如下[4]:冷榨花生餅→浸出 (50℃,兩次各 3 h)→堿溶 (料液比 1∶10,50℃,2 h,pH 8.5)→離心→上清液→酸沉 (pH 4.5)→離心→沉淀→酶解 (加酶量 75 AU/kg底物,料液比 1∶10,45℃,2.5 h,pH 8.0)→滅酶 (pH 4.0～4.5)→離心→超濾→冷凍干燥→花生多肽。

所得花生多肽為乳白色粉末,可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù) 90.87%,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及給藥[5]

動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度為 24℃,濕度為 65%～80%。每只小鼠每天 5 g飼料,試驗(yàn)動(dòng)物預(yù)飼 1周后,隨機(jī)分為 4組:對(duì)照組,以 200 mg/(kg·d)花生蛋白灌胃小鼠 (以小鼠耐受度為人體 5倍計(jì)算)、花生多肽低、中、高劑量組 ,分別以 100、200、400 mg/(kg·d)花生多肽灌胃小鼠。每組 30只。同天開(kāi)始灌胃,每天灌胃一次,連續(xù) 5周后,進(jìn)行試驗(yàn)。

普通飼料組成 (以 50 kg飼料計(jì)算):玉米20.625 kg,麩皮 17.5 kg,豆粕 8 kg,魚(yú)粉 3.125 kg,食鹽 0.125 kg,貝粉 0.75 kg,微量元素 50 g,維生素5 g,鋅 2 g。

1.2.3 觀察小鼠生長(zhǎng)情況及體重的變化

喂養(yǎng)中,觀察小鼠活動(dòng)的能力,并且每 3天稱(chēng)量體重 1次。

1.2.4 花生多肽對(duì)小鼠免疫器官質(zhì)量及免疫器官指數(shù)[6-7]

處死小鼠后立即取出脾臟及胸腺,用吸水紙吸去污血,稱(chēng)重,免疫器官指數(shù)以免疫器官質(zhì)量 (mg)與體重 (10 g)之比表示。

1.2.5 小鼠脾臟、胸腺病理切片觀察[8]

取出小鼠的脾臟及胸腺后,吸去表面的污血,固定于 10%福爾馬林溶液中,HE染色觀察。

HE染色方法:石蠟切片,厚度 4μm,裱于干凈載玻片上,60℃烤片機(jī)上烤片 2 h,二甲苯脫蠟 2次,每次 15 min,依次用無(wú)水乙醇,95%乙醇,80%乙醇,蒸餾水處理至透明,蘇木素染核胞 5～10 min,10%鹽酸酒精分化,自來(lái)水沖 15 min(返藍(lán)),樹(shù)脂膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 花生多肽對(duì)正常小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH)的影響[9-10]

飼養(yǎng) 5周后的 4組小鼠中,每組取出 10只,于小鼠腹部脫毛約 3 cm×3 cm的面積,以 1%DNFB液(以 1∶1丙酮麻油液配制)涂于脫毛區(qū),0.05 mL/只。第二天加強(qiáng)一次。然后繼續(xù)喂養(yǎng)不同的飼料,5 d后,以 1%DNFB液涂于小鼠右耳 (雙面),0.01 mL/只,24 h后,脫臼處死,剪下小鼠的左右耳,用打孔器分別在左右耳相同部位打下直徑為 8 mm的圓片,用分析天平稱(chēng)重,右耳質(zhì)量減去左耳質(zhì)量為腫脹度。

腫脹度 (mg)=右耳質(zhì)量 -左耳質(zhì)量

1.2.7 小鼠血清免疫球蛋白 (IgG)含量的測(cè)定[11-13]

飼養(yǎng) 5周后的 4組小鼠中,每組取出 10只,眼球取血,并分離得到血清。

取小鼠血清 20μL,加入緩沖液 1 mL混勻,再取稀釋的血樣 20μL血清,另加入緩沖液 1 mL混勻,然后按 IgG放免試劑盒具體操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 NK細(xì)胞活性測(cè)定[7]

取飼養(yǎng) 5周后的小鼠的脾臟,用 PBS緩沖溶液清洗 2次,除去表面血污,剪刀剪碎,冰浴中勻漿(1 g組織 /5 mL PBS緩沖液),-20℃凍融 2次,破膜;離心 10 min(4℃,5 000 r/min),上清液即為脾臟標(biāo)本溶液。然后按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用-x ±S表示相關(guān)指標(biāo),應(yīng)用 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 飼養(yǎng)過(guò)程中一般觀察和大體解剖觀察[14-15]

小鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中無(wú)異?，F(xiàn)象,進(jìn)食、飲水、糞便和活動(dòng)等情況均正常。動(dòng)物解剖后,觀察各臟器情況,沒(méi)有病變。

2.2 花生多肽對(duì)小鼠體重變化的影響

花生多肽對(duì)小鼠體重變化的影響見(jiàn)表 1,花生多肽各劑量組小鼠的體重與對(duì)照組相比有不同程度的提高,發(fā)生明顯變化出現(xiàn)在第 3周的時(shí)間。第 3周時(shí),各劑量組小鼠體重明顯高于對(duì)照組小鼠。隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),這種趨勢(shì)更加明顯,并且體重的增加與劑量呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系。

表 1 花生多肽對(duì)小鼠體重的影響(-x ±S,n=10)

2.3 花生多肽對(duì)小鼠免疫器官質(zhì)量及免疫器官指數(shù)的影響

從表 2中可以看出,花生多肽對(duì)小鼠的免疫器官有一定的影響,但是未表現(xiàn)出較顯著的差異。一般表現(xiàn)為中劑量的花生多肽小鼠的免疫器官質(zhì)量及其指數(shù)較對(duì)照組小鼠的要高。這提示中劑量的花生多肽有較強(qiáng)的增加機(jī)體免疫功能的作用。

表 2 花生多肽對(duì)小鼠免疫器官及其指數(shù)的影響(-x±S,n=10)

2.4 小鼠脾臟、胸腺病理切片觀察

2.4.1 脾臟病理切片

對(duì)照組、花生多肽低、中、高劑量組小鼠的脾臟病理切片圖見(jiàn)圖 1。

對(duì)照組及各劑量組小鼠脾臟被膜、小梁、紅髓、白髓結(jié)構(gòu)清楚,中央動(dòng)脈、淋巴小結(jié)、淋巴索形態(tài)清晰,分布較均勻。如圖 1 d所示中、高劑量組小鼠脾臟淋巴小結(jié)生發(fā)中心擴(kuò)張,細(xì)胞核較大,網(wǎng)狀細(xì)胞明顯,數(shù)目較多,漿細(xì)胞增多,其分泌的抗體也會(huì)增加,這提示高劑量組小鼠免疫力會(huì)有所增強(qiáng)。低劑量組無(wú)明顯變化。

圖 1 小鼠脾臟病理切片

2.4.2 胸腺病理切片

對(duì)照組、花生多肽低、中、高劑量組小鼠的胸腺病理切片圖見(jiàn)圖 2。

對(duì)照組及各劑量組小鼠胸腺小葉、皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚,胸腺細(xì)胞,上皮網(wǎng)狀細(xì)胞、胸腺小體等形態(tài)清晰。但如圖 2所示高倍鏡下觀察各劑量組組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。這說(shuō)明雖然生化指標(biāo)發(fā)生了變化,免疫力有所增強(qiáng),但這些變化不足以引起胸腺形態(tài)學(xué)上的變化。

圖 2 小鼠胸腺病理切片

2.5 花生多肽對(duì)正常小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng) (DTH)的影響

從表 3中可知,其中低劑量組[100 mg/(kg·d)]小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)腫脹度要顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。添加中劑量組 [200 mg/(kg·d)]小鼠的腫脹度極顯著的高于對(duì)照組 (P<0.01)。高劑量組[400 mg/(kg·d)]小鼠的腫脹度雖然與對(duì)照組相比也具有顯著性,但是下降了。這說(shuō)明一定劑量的花生多肽可以提高正常小鼠的免疫功能。所用的 3個(gè)劑量中,中劑量的花生多肽 [200 mg/(kg·d)]是提高正常小鼠免疫功能的最佳劑量。

表 3 花生多肽對(duì)正常小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響(-x±S,n=10)

2.6 花生多肽對(duì)正常小鼠 IgG含量的影響

花生多肽對(duì)小鼠 IgG含量的影響見(jiàn)表 4,通過(guò)放免法測(cè)定小鼠血清中 IgG的含量,各花生多肽劑量組小鼠的血清 IgG的含量與對(duì)照組相比,其值雖然都沒(méi)有表現(xiàn)出非常顯著的差異,但在一定程度上都有所增加。這說(shuō)明花生多肽在一定程度上對(duì)小鼠的體液免疫有所增強(qiáng)。2.7 花生多肽對(duì)小鼠脾臟 NK細(xì)胞活性的影響

表 4 花生多肽對(duì)正常小鼠 IgG含量的影響(-x±S,n=10)

NK細(xì)胞活性的測(cè)定結(jié)果如見(jiàn)表 5。與對(duì)照組相比,各劑量組小鼠 NK細(xì)胞活性均有增強(qiáng)。高劑量組[400 mg/(kg·d)]極顯著的高于對(duì)照組 (P<0.01),呈劑量 -效應(yīng)關(guān)系。

表 5 花生多肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響(-x ±S,n=10)

3 討論與結(jié)論

3.1 花生多肽對(duì)小鼠體重的影響

隨著喂養(yǎng)的時(shí)間的延長(zhǎng),花生多肽對(duì)小鼠體重的影響越明顯。喂養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng),劑量越大,與對(duì)照組相比,小鼠體重增加顯著。說(shuō)明花生多肽在一定程度上促進(jìn)了小鼠的生長(zhǎng)。

3.2 花生多肽對(duì)小鼠免疫器官和免疫器官指數(shù)的影響

花生多肽對(duì)小鼠的免疫器官質(zhì)量和指數(shù)有一定的影響,但與對(duì)照組相比未表現(xiàn)出較顯著的差異。通過(guò)觀察小鼠脾臟的病理切片,高劑量組[400 mg/(kg·d)]小鼠脾臟淋巴小結(jié)生發(fā)中心擴(kuò)張,網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)目較多,漿細(xì)胞增多,其分泌的抗體也會(huì)增加,這提示花生多肽有增加小鼠免疫功能的作用。

3.3 花生多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響

遲發(fā)型超敏反應(yīng)和 NK細(xì)胞活性是細(xì)胞免疫常用的評(píng)價(jià)指標(biāo),兩者的測(cè)定結(jié)果可以反映出藥物的免疫調(diào)節(jié)功能[16-18]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,各劑量組均有提高小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)及 NK細(xì)胞活性的作用,有增強(qiáng)小鼠免疫功能的效果。

血清中 IgG是全身性體液免疫反應(yīng)的效應(yīng)因子,是再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要免疫球蛋白,在血液中含量最高,在機(jī)體防御中發(fā)揮抗感染、中和毒素及調(diào)理等作用,其含量在一定程度上也反映了對(duì)機(jī)體體液免疫的調(diào)節(jié)功能[19-21]。試驗(yàn)表明,花生多肽能夠提高小鼠血清中 IgG含量,可以進(jìn)一步說(shuō)明:一定劑量的花生多肽可以在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫能力。

[1]劉麗娜,何東平,張聲華.花生蛋白水解工藝的優(yōu)化 [J].糧油加工,2008,11:60-63

[2]Gri mble G K,Silk D B A.Intravenous protein hydrolysates time to turn the clock back[J].Clinical Nutrition,1990,9(1):39-45

[3]頓新鵬,陳正望.酶法水解米渣蛋白制備大米小分子肽[J].食品科學(xué),2004,25(6):113-116

[4]張宇昊,王強(qiáng).酶水解花生蛋白制備花生短肽的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào).2007,23(4):258-263

[5]施新猷.醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué) [M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1989,492

[6]徐叔云,卞如濂,陳修主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:945,934

[7]徐叔云,卞如濂,陳修主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002,1429-1436

[8]張均田主編.現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 [M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:255-273

[9]張曉君,祝晨蔯,胡黎,等.黨參多糖對(duì)小鼠免疫和造血功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(3):174-176

[10]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.新藥 (中藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編[M].1993,7:124

[11]錢(qián)玉昆.實(shí)用免疫學(xué)新技術(shù) [M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1995:11-15

[12]Tryphonas H,Bondy G,Miller J D,et al.Effects of fumonism B1 on the immune system of sprague-dawley rats folliwing a 14-day oral(gavage)exposure[J].Fundamental and Applied Toxicology,1997,39:53-59

[13]Tryphonas H,Cooke G,CaldwellD,et al.Oral(gavage),in utero and post-natal exposure of Sprague-Dawley rats to low doses of tributyltin chloride:Part II:effects on the im2 mune system[J].Food and Chemical Toxicology,2004,42:227-241

[14]苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)出版社,1997

[15]王世若,王興農(nóng),韓文瑜.現(xiàn)代動(dòng)物免疫學(xué) [M].吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2001

[16]徐明清,黃燕虹,張志,等.羅哌卡因?qū)ν庵苎?CD3 CD4 CD8 CD20 I L-2 I NF-γ影響的研究 [J].河北醫(yī)學(xué),2005,11(9):774-776

[17]LusterM I,Portier C,PaitD G.Risk assess ment in immuno2 toxicology sensitivity and predictability of immune tests[J].Fundamental and Applied Toxicology,1992,18:200-210

[18]SuniM A,Ghanekar S A,Houck D W.CD4+CD8 low T lymphocytes exhibit enhanced cytokine expression,prolifera2 tion and cytotoxic activity in response to HCMV and H I V-1 antigens[J].Eur I mmunol,2001,31:512-520

[19]李強(qiáng)翔,文格波,顏向軍,等.氨基胍和維生素 C對(duì)糖尿病大鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,12(1):80-82

[20]Liu H,Zhu Y.Effect ofalcohol extract of Zingben oflicinale rose on immunologic function of mice to tumor[J].Journal Of Hygiene Research,2002,31(3):208-209

[21]Glush Kova O V,Novoselove E G,OgaiV B.Effect of centi2 metermi crowaves on the antibody production in mice[J].Biofizika.2001,46(1):126-130.

Effects of Peanut Peptides on I mmune Function ofMice

Liu Lina1,2,3He Dongping2Zhang Shenghua3WangWenliang1Du Fangling1
(Institute ofAgro-Food Science and Technology,Shandong Academy ofAgricultural Sciences1,Jinan 250100)
(College of Food Science and Technology,HuazhongAgriculturalUniversity2,Wuhan 430070)
(College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University3,Wuhan 430023)

This study aims to explore the effect of peanut peptides(PPs)on growth and immune function of mice through animal experiment and observation of the trend of bodyweight and immune organs.Results:PPs accel2 erates the growth and development ofmice to a certain extent.PPs atmiddle dosage[200 mg/(kg·d)]or high dos2 age[400 mg/(kg·d)]have obvious action on promoting the reaction ability of delayed type hypersensitivity(DTH),and raising the levelofNatural Killer cell(NK cell)activity and contentof serum IgG inmice.PPs i mprove the non2 specific and specific immune ability ofmice.From pathological observation of spleen,the number of reticulocyte and plasma cellof spleen in mice fed with PPs atmiddle or high dosage are increased.These imply PPs could improve the immune function ofmice.

peanut peptides(PPs),immunity,viscera index,immune organ index,DTH,NK cell,IgG

TS201.4

A

1003-0174(2011)01-0079-05

公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng) (200903043-3-2),農(nóng)業(yè)部科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 (2009C60050),山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專(zhuān)項(xiàng)(2009ZHZX1A1303)

2009-12-07

劉麗娜,女,1978年出生,博士,農(nóng)產(chǎn)品加工

杜方嶺,男,1972年出生,研究員,農(nóng)產(chǎn)品加工