生長抑素對胃癌VEGFs和VEGF受體影響的實驗研究

趙 濱 楊 靜 孫勇偉 蔡 端

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，每年全世界都有80萬人因此死亡，一般而言，胃癌患者平均5年存活率大約22%，而晚期胃癌患者5年存活率低于5%。研究表明，血管和淋巴管的惡性增生是腫瘤轉(zhuǎn)移和惡化的重要原因［1］。內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子及其受體是血管淋巴管增生的重要原因之一［2～5］。

研究表明，VEGF過表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)，抑制VEGF表達(dá)能夠減弱胃癌的成瘤性［6～9］。表明 VEGF過表達(dá)會引起腫瘤的惡化，并且能將VEGF作為腫瘤治療的重要靶點。

生長抑素是1種重要的內(nèi)生性抑制因子，最初由豬的下丘腦中獲得［10］。生長抑素的激動劑如奧曲肽(octreotide)被廣泛用于肢端肥大患者，胰島瘤和許多良性腫瘤的激素調(diào)控［11～13］。研究表明生長抑素很有可能通過抑制VEGF而發(fā)揮抑制血管生成的作用，因此可能在內(nèi)分泌瘤中發(fā)揮著重要的作用［14］。有研究表明，生長抑素及其類似物在體內(nèi)和體外發(fā)揮作用依賴于血管的發(fā)育程度［15］。我們推斷，生長抑素在胃癌血管生成中發(fā)揮著作用，并能影響VEGF水平。為此，我們通過建立隨機實驗，以探討生長抑素對胃癌患者VEGF水平的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇本院普通外科收治的行根治性手術(shù)胃癌患者60例，均經(jīng)病理檢查證實，病理分期Ⅲ～Ⅳ期，并有可測客觀病灶。隨機分組，兩組性別比例和平均年齡等見表1。兩組患者術(shù)前肝、腎功能均正常，無糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等代謝性疾病，無任何免疫性疾病，以往6個月內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑，未接受過放療或化療，愿意接受全腸內(nèi)營養(yǎng)，在性別、年齡、病變部位及術(shù)式等方面兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表 1。

表1 2組患者基本資料的比較(例，%)

1.2 治療方法

實驗組患者術(shù)前靜脈注射生長抑素3 mg，3次/天，連續(xù)3天。對患者行常規(guī)檢查，記錄患者相關(guān)的各項體征、體重、全血計數(shù)和血清學(xué)指標(biāo)，藥物引起的不良反應(yīng)均記錄在案。

1.3 標(biāo)本收集

手術(shù)切除的新鮮胃癌標(biāo)本用10%的福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋或直接溶于Trizol備用。

1.4 免疫組化

常規(guī)石蠟包埋的組織，切成4 μm切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、100%、95%、80%、70%梯度酒精復(fù)水?？乖迯?fù)采用玻片浸入檸檬酸緩沖液加熱至99℃，保持30 min再室溫自然冷卻。3%過氧化氫浸泡5 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。一抗KDR/Flt-1(購自Santa Cruze)，均以1∶100配成工作濃度，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌2次后用生物素標(biāo)記的二抗(上海長島)室溫孵育30 min，再用鏈酶素辣根過氧化物酶孵育30 min，DAB(上海長島)試劑盒顯色。蘇木精復(fù)染后封片。PBS代替一抗作為陰性對照，根據(jù)抗體說明書以大腸癌標(biāo)本作為陽性對照。

每張切片選取5個200倍視野，用Olympus BX51顯微鏡拍攝(日本)。圖像分析采用 Image-Pro Plus 6.0軟件計算每張圖片中陽性表達(dá)部分的平均光密度(mean optical density，mean OD)及累積光密度(integral OD，IOD)。

1.5 實時定量PCR

胃癌組織50～100 mg溶于1 ml TRIzol中，根據(jù)試劑說明書提取總 RNA，并測定濃度。取總 RNA 1 mg，補充無核酸酶水至9.9 ml，70 ℃孵育10 min后，短暫離心后，置于冰上;在同管中依次加入:MgCl2(25 mmol/L)4 μl、10 × 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μl、dNTP 混合液(10 mmol/L)2 μl、RNA 酶抑制劑(40 U/μl)0.5 μl、Oligo(dT)15 引物(0.5 μg/μl)1 μl、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(5 U/μl)0.6 μl。42 ℃下孵育 15 min，然后 95 ℃作用5 min終止反應(yīng)，4℃下孵育5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。使用iCycler IQ(Bio-Rad，美國)進(jìn)行 Realtime PCR分析。以 β-actin作為內(nèi)參。VEGF-A的引物序列為5’-CCA TGA ACT TTC TGC TGT CTT-3’(sense)和 5’-TCG ATC GTT CTG TAT CAG TCT-3’(antisense)，β-actin 引物序列為 5’-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3’(sense)和5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3’(antisense)。

1.6 酶聯(lián)免疫反應(yīng)實驗

實驗組分別在給藥前和術(shù)后24、48、72 h時行抽血取樣。通過離心獲得血清后行酶聯(lián)免疫分析血清VEGF水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 生長抑素抑制VEGF表達(dá)水平

生長抑素預(yù)處理前兩組血清VEGF水平無明顯差異，而術(shù)前及術(shù)后生長抑素預(yù)處理組VEGF水平均明顯低于對照組(圖1)。

2.2 生長抑素對VEGF各亞型mRNA水平的影響

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，VEGF各亞型A、B、C的RNA水平，生長抑素預(yù)處理組與對照組比較并無明顯差異(圖2)。

2.3 生長抑素對VEGFR2和VEGFR1水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示，VEGF受體表達(dá)位于胃癌原發(fā)灶及臨近黏膜組織中。生長抑素預(yù)處理并未明顯改變VEGFR1和R2表達(dá)水平，而VEGFR3水平明顯下降，同樣VEGFR3不僅表達(dá)于原發(fā)灶，而且表達(dá)于黏膜組織。VEGFR3主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中及黏膜下。VEGFR3陽性表達(dá)血管主要位于正常胃黏膜的下半部及臨近肌肉部位的黏膜下層(圖3)。

圖1 兩組血清VEGF水平比較

圖2 生長抑素預(yù)處理對VEGF各組mRNA水平的影響

圖3 2組中VEGFR1、R2、R3表達(dá)的平均光密度圖

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍僅次于肺癌而居各種惡性腫瘤死因的第二位。胃癌患者生存率的提高有賴于胃癌的早期診斷、早期治療、對轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的有效預(yù)防及尋找新的治療靶點提高胃癌的治療水平。血管生成對于腫瘤的轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生和釋放許多促血管和抗血管的因子來調(diào)節(jié)血管的生成。VEGFs是最常見的血管生長因子家族，其能夠通過與受體的結(jié)合促進(jìn)血管的生成，從而影響腫瘤的進(jìn)程。在胃癌患者中，VEGF過表達(dá)與不良預(yù)后緊密相連，提示我們抗VEGF治療對胃癌的治療可能存在作用［16，17］。生長抑素及其類似物能夠抑制VEGF的產(chǎn)生，從而影響血管的生長，起到治療腫瘤的作用［18］。同樣也有研究報道生長抑素及其類似物可能是通過影響VEGF的水平來影響血管生成的［18］。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)生長抑素的預(yù)處理可以降低血清VEGF的水平，并且下調(diào)VEGF受體的表達(dá)。

除了影響血管生成以外，VEGF同樣可以作為1個調(diào)控血管生成的標(biāo)志［19，20］。我們研究結(jié)果顯示，可溶性VEGF血清水平的下降，可能影響到后來的血管生成。但同時VEGF各亞型的mRNA水平并沒有改變。我們推斷生長抑素可能是通過影響VEGF蛋白的合成和降解來發(fā)揮作用。也有研究報道，在肝癌患者中使AZD2171引起時間和劑量依賴的VEGFR2的減少，VEGF水平反而升高［22～24］。說明在不同腫瘤的發(fā)展過程中，促血管生長因子起著兩面的作用［21］。

另外，我們的研究結(jié)果顯示，在生長抑素預(yù)處理的患者中VEGF受體3的表達(dá)水平明顯下降，而其配體VEGF-C并沒有改變。VEGF-C與VEGF受體3的表達(dá)有利于淋巴管的生成，而淋巴管對于腫瘤基質(zhì)有重要影響。VEGF-C與VEGF受體3的活化，腫瘤細(xì)胞更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。有研究報道，VEGF-C與VEGF受體3存在著重要的關(guān)聯(lián)，腫瘤基質(zhì)中VEGF受體3陽性細(xì)胞數(shù)量與胃癌惡性侵襲程度相關(guān)［25］。

綜上所述，在進(jìn)行胃癌切除術(shù)的患者中，預(yù)先使用生長抑素，可降低血清VEGF水平，同時可影響VEGF受體3的表達(dá)。生長抑素可以通過調(diào)控VEGF及其受體水平，從而影響血管和淋巴管的生成，而作為胃癌切除術(shù)患者治療的1種重要佐劑。

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