樊 輝 李國權(quán) 謝冰冰 陳英海 李小龍 鄒麗娟
放射治療是抗腫瘤治療的主要治療方法之一,通過放療和增敏劑的聯(lián)合應(yīng)用提高放療療效,是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。β-欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取出來的抗癌新藥,是1種高效、低毒的廣譜抗腫瘤藥物,而且β-欖香烯的放療增敏作用已經(jīng)得到證實(shí),但是放射增敏機(jī)制仍未完全闡明。我們通過探討β-欖香烯對移植瘤的放療增敏機(jī)制,是否與血管形成相關(guān),從而為闡明增敏機(jī)制提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.1.1 細(xì)胞系和裸鼠 A549人肺腺癌細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。6~8周齡的BALB/C-nu裸鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,恒溫(24℃ ~26℃)飼養(yǎng)?;\具、墊料、飲水及飼料均作高壓和紫外線消毒處理。
1.1.2 主要試劑 β-欖香烯注射液購于大連華立金港藥業(yè)有限公司。VEGF、CD34多克隆抗體、生物素標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG及SP染色試劑盒,均購自于北京中杉公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于37℃、5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中,用PRMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng),每2~3 d換液1次,定期傳代。
1.2.2 移植瘤模型 取對數(shù)生長期細(xì)胞,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基配備細(xì)胞懸液,最終細(xì)胞濃度為1×107個/0.2 ml;裸鼠右下肢外側(cè)皮下注入0.2 ml瘤細(xì)胞懸液。應(yīng)用游標(biāo)卡尺由專人定期測量瘤體的長徑(a)及短徑(b),計算移植瘤體積(V=ab2/2[1])。
1.2.3 照射方式 將荷瘤裸鼠裝入一有機(jī)玻璃盒內(nèi),接種腫瘤的后腿拉出用膠布固定。腫瘤部位位于照射野中央,距野邊緣均超過1 cm,全身其余部位均在野外。Varian 2 300C/D醫(yī)用直線加速器,6 MeV電子線,照射野4 cm×3 cm,劑量5 Gy,源皮距100 cm,照射部位上墊1.0 cm厚蠟塊。
1.2.4 腫瘤生長延緩時間和計算增敏系數(shù) 待移植瘤體積達(dá)0.8~1.0 cm3時,將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組:空白組(NaCl)、25 mg/kg藥物組、45 mg/kg藥物組、100 mg/kg藥物組、放療組(NaCl+放療)、25 mg/kg+放療組、45 mg/kg+放療組、100 mg/kg+放療組,每組5只。腹腔注射β-欖香烯,空白組注射同等體積生理鹽水。與放療聯(lián)合時,β-欖香烯于放療前1h腹腔注射。觀測移植瘤的體積倍增時間,絕對腫瘤生長延緩時間(AGD)=放療組體積倍增時間-空白組體積倍增時間。標(biāo)準(zhǔn)化腫瘤生長延緩時間(NGD)=聯(lián)合組體積倍增時間-藥物組體積倍增時間。增敏系數(shù)(EF)=NGD/AGD,EF>1提示有放射增敏效應(yīng)[2]。
1.2.5 移植瘤取材 再次將瘤體達(dá)到0.8~1.0 cm3的新裸鼠隨機(jī)分組,具體:空白組(NaCl);藥物組(最佳增敏劑量)、放療組、藥物+放療組。24 h后采用斷頸法處死裸鼠,立刻置于冰上,用無菌手術(shù)器具剝?nèi)∧[瘤組織,去除脂肪等非瘤組織,置于保存管里于液氮罐保存。
1.2.6 石蠟切片制備及VEGF、CD34免疫組化染色新鮮腫瘤標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋,切成4 μm厚連續(xù)切片。采用SP法免疫組化染色,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用IPP軟件(Image-Pro Plus 6.0)對VEGF的染色結(jié)果進(jìn)行分析,選擇測量面積計算累積光密度及平均光密度[3]。參照 Weidner[4]微血管計數(shù)法標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)CD34染色陽性細(xì)胞,計數(shù)MVD平均數(shù)目。
應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件,采用單因素方差分析方法,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)前各組瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隔日檢測移植瘤體積變化,計算各組的體積倍增時間。由圖1可見,各藥物組與空白組(6.8±1.10)比較倍增時間均延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。藥物組間倍增時間比較,100 mg/kg組(17.2±1.92)最長,45 mg/kg 組(10.6 ± 1.14)次之,25 mg/kg組(9.0 ±0.71)最短,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。放療組倍增時間(11.8 ±0.45)短于 100 mg/kg組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),長于 45 mg/kg組,兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
圖1 各實(shí)驗(yàn)組的體積倍增時間
根據(jù)NGD和AGD計算增敏系數(shù),由于25 mg/kg組EF=0.84<1,提示該劑量沒有放療增敏作用。45 mg/kg組(EF=1.24)和 100 mg/kg組(EF=2.04)的EF值均>1,說明兩種劑量具有增敏作用。由圖1可見,100 mg/kg β-欖香烯的抑瘤能力超過了放療的抑瘤能力,說明該劑量抑瘤能力過強(qiáng),因此不是理想的增敏劑量。45 mg/kg符合放射增敏劑量的要求。
顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色或棕褐色者為VEGF表達(dá)陽性。依據(jù)累積光密度及平均光密度結(jié)果分析各組VEGF的表達(dá)水平,見表1。累積光密度結(jié)果:藥物組VEGF表達(dá)水平略低于空白組,但是兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);放療組與空白組及藥物組比較,VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),聯(lián)合組與空白組、藥物組及放療組比較VEGF表達(dá)明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組平均光密度分析結(jié)果與累積光密度結(jié)果一致。
表1 各組VEGF免疫組化染色結(jié)果的IPP圖像分析(s)
表1 各組VEGF免疫組化染色結(jié)果的IPP圖像分析(s)
★為與空白組、藥物組比較,P<0.01;◆為與其它各組比較,P<0.01
組別 樣本數(shù)(n)累積光密度 平均光密度(×10-2)空白組◆
參照Weidner微血管計數(shù)法標(biāo)準(zhǔn),以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色著色為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性。CD34免疫組化結(jié)果見表2。藥物組的微血管個數(shù)表達(dá)略低于空白組,但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);放療組與空白組及藥物組比較,微血管個數(shù)表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),聯(lián)合組與空白組、藥物組及放療組比較,微血管個數(shù)表達(dá)明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。
表2 各組CD34免疫組化染色結(jié)果
β-欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取出來的具有抗癌活性的藥物,由于其高效,低毒,廣譜的特點(diǎn)越來越多的受到臨床治療的青睞?;A(chǔ)研究證明β-欖香烯對肺腺癌 A549[5]、小鼠移植瘤 U14[6]等多種細(xì)胞均具有放射增敏作用。放射增敏機(jī)制研究主要涉及到細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及 DNA 雙鏈損傷修復(fù)等方面[7,8],而且主要是體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及在腫瘤血管形成機(jī)制方面研究甚少。
VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的活性和專屬性最強(qiáng)的血管生成因子[9],廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞,在腫瘤血管形成機(jī)制方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用,所以我們選擇了VEGF做為研究的主要目標(biāo)。VEGF的表達(dá)與腫瘤微血管密度(MVD)緊密相關(guān)[10],所以本實(shí)驗(yàn)著重研究β-欖香烯的放療增敏機(jī)制與VEGF和MVD表達(dá)的相關(guān)性。
本實(shí)驗(yàn)的前期整體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),45 mg/kg藥物組劑量本身的抑瘤能力較弱,而增敏系數(shù)(EF=1.24)較理想,所以選擇此劑量作為進(jìn)一步研究的增敏劑量。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可看出:藥物組VEGF的免疫組化表達(dá)與空白組比較差異不大,無統(tǒng)計學(xué)意義。Moeller等[11]研究表明放療會誘導(dǎo)腫瘤HIF-1α表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)其下游眾多分子(如VEGF等)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn),VEGF免疫組化結(jié)果可看出放療組表達(dá)明顯增強(qiáng),與空白對照組有明顯差異。而聯(lián)合組VEGF表達(dá)水平明顯低于其他各組。CD34各組表達(dá)與VEGF表達(dá)結(jié)果基本吻合。這說明了β-欖香烯和放療協(xié)同,通過抑制VEGF表達(dá),改善腫瘤的血管形成情況,增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的放射敏感性,其機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)改善了腫瘤的乏氧狀態(tài),值得進(jìn)一步研究。
[1]Liu XF,Xia YF,Li MZ,et al.The effect of p21 antisense oligodeoxynucleotides on the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells with normal p53 function〔J〕.Cell Biol Int,2006,30(3):283.
[2]Milas L,F(xiàn)ujii T,Hunter N,et al.Enhancement of tumor radioresponse in vivo by gemcitabine〔J〕.Clin Cancer Res,1999,59(1):107.
[3]Wang CJ,Zhou ZG,Holmqvist A,et al.Survivin expression quantified by Image Pro-Plus compared with visual assessment〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2009,17(6):530.
[4]Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al.Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma〔J〕.N Engl J Med,1991,324(1):1.
[5]Jiang H,Ma SL,F(xiàn)eng JG.In vitro study of radiosensitization by β-elemene in A549 cell line from adenocarcinoma of lung〔J〕.C-G JCO,2009,8(1):12.
[6]鄒麗娟,孫秀華,徐曉穎,等.欖香烯對小鼠移植瘤U14放療增敏的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2004,24(3):254.
[7]張 卓,鄒麗娟,田瑩瑩.β-欖香烯乳聯(lián)合照射對DNAPKcs基因表達(dá)及凋亡的影響〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2009,24(6):555.
[8]張 卓,鄒麗娟,田瑩瑩.β-欖香烯乳聯(lián)合照射對肺腺癌A549細(xì)胞凋亡及KU70基因表達(dá)的影響〔J〕.中國腫瘤臨床,2010,37(4):184.
[9]Links Inda AM,Andrini LB,Garcla MN,et al.Evaluation of angiogenesis with expression of VEGF and CD34 in human non small cell lung cancer〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2007,26(3):375.
[10]Volta M,Koomagi R,Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer〔J〕.Jnt J Cancer,1997,74(1):64.
[11]Moeller BJ,Cao Y,Li CY,et al.Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors:role of reoxygenation,free radicals,and stress granules〔J〕.Cancer Cell,2004,5(5):429.