XRCC1 Codon399單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌急性放射反應(yīng)的相關(guān)性研究

彭 欽 張軍寧 宋云風(fēng) 南秀麗 彭小波 査燕燕

鼻咽癌在我國(guó)屬于常見(jiàn)惡性腫瘤，放射治療是目前首選治療手段。隨放療設(shè)備的發(fā)展和影像技術(shù)的廣泛應(yīng)用，尤其是3D-CRT、IMRT的出現(xiàn)其療效進(jìn)一步提高，放療不良反應(yīng)也逐漸減少。但是臨床上常會(huì)出現(xiàn)一些鼻咽癌患者，病期一樣，治療技術(shù)、治療劑量相同，其療效及伴隨放療反應(yīng)卻存在一定的個(gè)體差異?；颊邆€(gè)體放射生物學(xué)的差異可能是其中一個(gè)重要影響因素。本文旨在通過(guò)檢測(cè)鼻咽癌患者的XRCC1 Codon399位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，分析不同基因型與正常組織急性放射反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性，為制定合理的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 資料

收集2006年9月至2008年2月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤放療科行鼻咽癌根治放療的患者60例，其中男性52例，女性8例，年齡27～72歲，中位年齡55歲。入組條件:①經(jīng)病理檢查證實(shí)為鼻咽低分化鱗癌;②Karnofsky評(píng)分≥60;③放療前均行全身檢查，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;皮膚、黏膜和涎腺完整;④放療前血常規(guī)、心電圖及肝、腎功能檢查各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)異常;⑤所有患者均經(jīng)CT掃描證實(shí)具有可測(cè)量的腫瘤病灶。

1.2 放療方法

所有患者均采用熱塑面罩固定頭頸肩部，行Siemens螺旋掃描，于治療計(jì)劃系統(tǒng)(TPS)精確勾畫(huà)GTV、CTV、PTV，然后于CMS治療計(jì)劃系統(tǒng)設(shè)計(jì)放療計(jì)劃。最后于模擬機(jī)下核實(shí)放療計(jì)劃后進(jìn)行放射治療。

1.3 XRCC1 Codon399單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)

放療前采集靜脈血5 ml，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-鏈激酶檢測(cè)反應(yīng)(PCR-LDR)技術(shù)［1］，檢測(cè)研究對(duì)象的XRCCl Arg399基因型。引物為5’TCACACCTAACTGGCATCTTCACT’3 和 5‘CTCCTTCCCTCATCTGGAGTACC3’。在PCR薄壁管中，配制20 μl多重PCR體系:10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTPs，0.5mmol/L Pfimem，1 U polymerase。加入 2 μl基因組 DNA。充分混勻，于94℃預(yù)變性15 min;94℃ 30 s、58℃ 120 s、64℃ 120 s，共35個(gè)循環(huán);64℃延伸10 min。再配制20 μl多重 LDR 體系:20 mmol/L Tris.HCl(pH 8.5)，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD+，0.2 mmol/L Probes，加入 2 μl 多重PCR產(chǎn)物，其中上游探針為5’p-GGGAGGGCAGCCGCCGACGCATGCTGCGACACTACGGAGGA–FAM3’，G探針為 5’ACGTGGACAGCTGCAGGGTTGGCGTGTGAGGCCTTACCTCC3’，A 探針為 5’TTTTTCACAGACAGGTCCCAGGGTTGGCGTGTGAGGCCTTACCTCT3’。充分混勻，然后于94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s、50℃120 s，共35個(gè)循環(huán)。最后取LDR產(chǎn)物1 μl，應(yīng)用測(cè)序儀測(cè)序測(cè)出XRCCl基因型。

1.4 急性放射損傷的觀察

參照RTOG急性放射損傷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較采用方差及協(xié)方差分析檢驗(yàn)，雙向無(wú)序計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，單向有序計(jì)數(shù)資料采用CMH(Cochran-Mamtel-Haenzsel)的χ2檢驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與皮膚急性放射損傷發(fā)生的關(guān)系

所有患者在放療過(guò)程中均發(fā)生了不同程度的急性皮膚放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2、3級(jí) 發(fā)生率均為33.3%;攜帶Arg/Gln基因型者1、2、3級(jí) 發(fā)生率分別為52.3%、42.9%、4.8%;攜帶 Arg/Arg 基因型者 1、2、3 級(jí)發(fā)生率分別為 57.6%、36.3%、6.1%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，此3種基因型患者皮膚急性放射損傷發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與黏膜急性放射損傷發(fā)生的關(guān)系

所有患者在放療過(guò)程中均發(fā)生了不同程度急性黏膜放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2、3級(jí)發(fā)生率分別為33.3%、50.0%、16.7%;攜帶 Arg/Gln 基因型者 1、2、3 級(jí)發(fā)生率分別為 38.1%、52.4%、9.5%;攜帶Arg/Arg基因型者1、2、3級(jí)發(fā)生率分別為48.5%、42.4%、9.1%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，此3種基因型患者黏膜急性放射損傷發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與涎腺急性放射損傷的關(guān)系

所有患者在放療過(guò)程中均發(fā)生了不同程度急性涎腺放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2級(jí)發(fā)生率分別為0、100%;攜帶Arg/Gln基因型者1、2級(jí)發(fā)生率分別為33.3%、66.7%;攜帶 Arg/Arg 基因型者1、2 級(jí)發(fā)生率分別為36.4%、63.6%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，此3種基因型患者涎腺急性放射損傷發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌患者正常組織急性放射損傷的關(guān)系(例)

3 討論

放療前腫瘤組織及正常組織放射反應(yīng)性的預(yù)測(cè)是目前放射生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，也是臨床放療醫(yī)師急需解決的問(wèn)題。然而，相對(duì)于化療藥物及靶向藥物敏感性研究，放射敏感性研究的進(jìn)展較慢。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外放射敏感性研究主要集中在用腫瘤細(xì)胞株和體外培養(yǎng)臨床腫瘤活檢腫瘤組織細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)電離輻射后細(xì)胞生存和復(fù)制能力、染色體畸變數(shù)量、輻射損傷后細(xì)胞修復(fù)能力以及輻射后細(xì)胞的凋亡的檢測(cè)等方面來(lái)衡量放射敏感性。近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施、尤其是單核苷酸多態(tài)性方面的研究成果，為從分子水平根據(jù)個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)放射敏感性提供了新的思路。目前研究研究較多的是檢測(cè)外周血有核細(xì)胞中相關(guān)基因等單核苷酸多態(tài)性預(yù)測(cè)正常組織放射損傷及腫瘤組織放射敏感性，如TGF-β1IL-6KL-6等細(xì)胞因子單核苷酸多態(tài)性預(yù)測(cè)輻射誘導(dǎo)的肺損傷。

電離輻射對(duì)DNA的損傷主要涉及堿基的損傷和DNA鏈的斷裂［2］。XRCC1基因是第一個(gè)分離到的影響細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性的哺乳動(dòng)物基因，XRCC1也是1種重要的堿基切除修復(fù)(BER)基因，它編碼的蛋白質(zhì)在堿基切除修復(fù)和DNA單鏈斷裂修復(fù)過(guò)程中都發(fā)揮重要作用。如果人體內(nèi)的DNA修復(fù)基因缺陷或發(fā)生變異，其所編碼的蛋白減少導(dǎo)致DNA修復(fù)基因修復(fù)能力下降。Giotopoulos等［3］對(duì)167例接受輔助放療的乳腺癌患者進(jìn)行XRCC l Codon 399分析發(fā)現(xiàn)，GA基因個(gè)體與放療后毛細(xì)血管擴(kuò)張顯著相關(guān)，且為毛細(xì)血管擴(kuò)張發(fā)生的獨(dú)立因素。Alsbeih等［4］應(yīng)用對(duì)照研究方法，對(duì)25例接受放療的頭頸腫瘤患者(無(wú)或有中至重度的皮下和深部組織的輕度纖維化)進(jìn)行XRCC l Codon 399分析發(fā)現(xiàn)，XRCCl Codon 399 A基因型個(gè)體發(fā)生纖維化的風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.31，95%CI=0.09～1.04，P=0.05)。MsAlsbeih 等［5］發(fā)現(xiàn) TGF-β1 和XRCC1上特定的SNPs與放射性纖維化明顯相關(guān)。本研究結(jié)果顯示:放療對(duì)正常組織的急性放射損傷與XRCC1 Codon 399基因單核苷酸多態(tài)性無(wú)顯著相關(guān)性?？赡茉蛟谟?造成人體正常組織放射性損傷的個(gè)體差異可能是多基因、多位點(diǎn)改變的結(jié)果;纖維增殖和炎性相關(guān)的細(xì)胞因子可能也與放射性損傷相關(guān)［6］;本研究樣本量少，今后應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并有待于進(jìn)行相關(guān)基因與位點(diǎn)的系統(tǒng)性研究，從而為將來(lái)個(gè)性化放療提供依據(jù)。

［1］肇 旭，秦勝營(yíng)，馮國(guó)部，等.基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)的基因芯片分型技術(shù)的建立〔J〕.國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2006，29(3):178.

［2］谷志遠(yuǎn)，趙亞力.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:53.

［3］Giotopoulos G，Symonds RP，F(xiàn)oweraker K，et a1.The late radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia，fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinct genotype-dependent causes〔J〕.Br J Cancer，2007，96(6):1001.

［4］Alsbeih G，Al-Harbi N，Al-Hadyan K，et al.Association between normal tissue complications after radiotherapy and polymorphic variations in TGFB1 and XRCC1 genes〔J〕.Radiat Res，2010，173(4):505.

［5］Alshaih GA，El—Sehaie MM，AI-Rajhi NM，et a1.Association between XRCC1 G399A polymorphism and late complications to radiotherapy in saudi head and neck cancer patients〔J〕.J Egypt Nail Cane Inst，2008，20(3):302.

［6］Zhao L，Wang L，Ji W ，et al.Association between plasma angiotens in converting enzyme level and radiation pneumonitis〔J〕.Cytokine，2007，37:71.