PCR-SSCP技術(shù)分析線粒體DNA多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

張明陽，單海燕，徐冬冬，丁梅，王保捷，龐灝，周勤虎，馮春梅

（1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 南通 2 2 6 0 0 0；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南通 2 2 6 0 0 0；3.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，四川南充 6 4 0 0 7 3；4.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

人類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是位于細(xì)胞核外的唯一遺傳物質(zhì)，因其拷貝數(shù)多、母系遺傳、突變率高等特點(diǎn)而被應(yīng)用于法醫(yī)鑒定中，特別是對微量、陳舊、降解檢材的DNA檢驗(yàn)。單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）的突出特點(diǎn)是成本低，設(shè)備要求簡單，周期短，適合作為基層分析的常規(guī)技術(shù)。目前mtDNA分型檢測大多采用PCR直接測序法，而本文旨在探索一種簡便實(shí)用的，適合于基層單位分析的mtDNA多態(tài)性檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

150例中國漢族無關(guān)個體的血液樣品200 μL、10例尸體（死亡后12 h）的各主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm和5例甲醛固定石蠟包埋的組織由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。血液樣品和組織樣品常規(guī)酚/氯仿法提取DNA，甲醛固定包埋組織醋酸銨法［1，2］提取DNA。紫外分光光度法定量，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物序列

根據(jù)人類mtDNA基因序列（GenBank.J01415.1），利用 Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，序列如下：5′GCCAGCCACCATGAATAT3′；5′AGGGTGGGTAGGT TTGTT3′。

1.3 PCR-SSCP分析

PCR反應(yīng)基本條件：20 μL體系，含DNA模板2 μL（25~30 ng），上下游引物各 0.375 μmol/L，4 種dNTP 各 0.2 mmol/L，1×PCR buffer，1U Taq 聚合酶。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 60 s，65 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循環(huán)30次；最后72℃10 min；4℃保溫。

取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入6 μL SSCP載樣緩沖液（95%去離子甲酰胺，5 mmol/L EDTA，0.025%溴酚藍(lán)，0.025%二甲苯青），混勻，98℃變性15 min，然后迅速將其置于0℃冰水中10 min，取8 μL加樣于預(yù)電泳30 min的非變性聚丙烯酰胺膠（T=15%，C=2%），在4℃條件下，恒壓150 V電泳12 h后銀染顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

直接計(jì)數(shù)150份無關(guān)個體的單倍型數(shù)目，計(jì)算每種單倍型的頻率。依據(jù)公式DP=［n（1-∑χ2）］/（n-1）計(jì)算個人識別率（probability of discrimination power，DP），RMP=∑χ2計(jì)算隨機(jī)匹配概率（random match probability，RMP）。

2 結(jié)果

2.1 150份無關(guān)個體血樣檢測結(jié)果

用PCR-SSCP法獲得樣品清晰的單倍型圖譜，中國北方漢族150份無關(guān)個體血樣檢出的9種單倍型（圖1），各種單倍型的頻數(shù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。其中單倍型Ⅸ頻率最高為0.173，單倍型Ⅲ頻率最低為0.040，其余各單倍型頻率分布在0.067~0.147之間。

圖1 9種單倍型的P A G E譜型F i g.1 P A G Ep a t t e r n s o f t h e 9 h a p l o t y p e s

R MP=0.125，DP=0.881.

2.2 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的引物分別擴(kuò)增10例尸體（死亡后12 h內(nèi)）不同臟器組織（心、肝、脾、肺、腎、腦組織）mtDNA16106-16297區(qū)域。同一個體不同臟器新鮮組織和甲醛固定石蠟包埋組織mtDNA16106-16297區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP分型結(jié)果完全一致（圖2）。

3 討論

線粒體DNA遺傳多態(tài)性多表現(xiàn)為序列多態(tài)性，其多態(tài)性程度雖遠(yuǎn)不及目前常用STR遺傳標(biāo)記，但在微量、降解檢材DNA多態(tài)性分析方面具有特殊的意義。甲醛固定石蠟包埋組織因福爾馬林固定、石蠟包埋等處理因素的影響，容易引起DNA的交聯(lián)和降解，使DNA多態(tài)性分析成為法醫(yī)學(xué)物證鑒定的難點(diǎn)［3，4］。因此，甲醛固定石蠟包埋組織等降解檢材，在首選核基因組DNA多態(tài)性分析未能得到理想結(jié)果時，進(jìn)行線粒體DNA多態(tài)性分析，將為案件的偵查和審理提供非常有價值的科學(xué)依據(jù)。本研究使用醋酸銨法提取甲醛固定石蠟包埋組織DNA能很好的擴(kuò)增目的片段，為法醫(yī)鑒定和疾病診斷與治療提供新的思路。

SSCP技術(shù)作為一種SNPs篩查方法，它可以快速對大量樣本進(jìn)行篩選，而且在一定片段長度內(nèi)有較高的檢出率。本實(shí)驗(yàn)利用SSCP技術(shù)調(diào)查了北方漢族150例無關(guān)個體mtDNA（16106-16297nt）的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)9種單倍型，DP值為0.881。由于本研究的mtDNA擴(kuò)增片段比較短，其中含有的堿基變異點(diǎn)數(shù)目較少，或者由于所選擇群體樣本和目的片段的不同，本研究檢出的單倍型數(shù)目及個人識別率均不及艾紅偉等［5］報(bào)告SSCP法檢測mtDNA多態(tài)性的結(jié)果（DP=0.935 6）。但本研究的擴(kuò)增產(chǎn)物長度較短不僅更適合降解生物性檢材的mtDNA多態(tài)性分析，而且所用電泳時間較短、電泳條件相對要求不嚴(yán)、型別判定比較容易，更適合于基層法醫(yī)物證鑒定的需要。

線粒體DNA多態(tài)性分析用于個人識別時，異質(zhì)性（heteroplasmy）是必須考慮的影響因素。個體發(fā)育源于一個受精卵，理論上同一個體所有的mtDNA序列應(yīng)是一致的。但實(shí)際卻發(fā)現(xiàn)有少數(shù)同一個體的mtDNA堿基序列并不完全相同。這種同一個體mtDNA出現(xiàn)兩種或兩種以上的堿基序列的現(xiàn)象稱為異質(zhì)性。其在人體的存在表現(xiàn)為同一個體不同組織、同一組織不同細(xì)胞或同一細(xì)胞不同線粒體之間存在不同的mtDNA序列［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道［7］異質(zhì)性發(fā)生率非常高，本研究對10例尸體不同臟器組織mtDNA16106-16297區(qū)域進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性。但異質(zhì)性的存在應(yīng)該引起我們的注意，減少由異質(zhì)性引起的錯誤排除［8］。同時，mtDNA異質(zhì)性又可作為個體的特殊標(biāo)記，增加個體認(rèn)定或排除的確定性。

mtDNA呈母系遺傳，加之其拷貝數(shù)多、突變率高、抗腐敗能力強(qiáng)，故mtDNA具有極高的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。本文利用PCR-SSCP技術(shù)對線粒體DNA進(jìn)行分析，證實(shí)其有較高的鑒別能力，其簡單、快速，批量檢測的特點(diǎn)特別適合于基層單位作為常規(guī)分析技術(shù)。

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