散發(fā)性阿爾茨海默病早老素2基因的新突變

白云峰，田菊，權(quán)文香，，前田潔

（1.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心一科，北京 100039；2.北京大學(xué)第六醫(yī)院生化室，北京 100191； 3.日本神戶(hù)大學(xué)醫(yī)學(xué)系研究科精神神經(jīng)科，日本 神戶(hù) 6500017）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）是一種漸進(jìn)性神經(jīng)變性疾病，分為家族性AD（FAD）和散發(fā)性AD（SAD）兩種類(lèi)型，其中SAD占多數(shù)。在歐洲SAD的比例為50%~75%，在日本SAD占80%~90%。目前為止有3種AD的致病基因：β淀粉樣蛋白前體（APP）、早老素 1（presenilin-1，PSEN1）和早老素 2（PSEN2）。FAD 大多與 PSEN1、APP 基因突變有關(guān)，極少數(shù)與PSEN2基因突變有關(guān)。迄今為止，世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)與FAD相關(guān)的PSEN1基因突變有164個(gè)，與SAD相關(guān)的PSEN1基因突變有3個(gè)。與PSEN1基因同源性的PSEN2基因中也有11種基因突變的報(bào)道，10種基因突變與FAD相關(guān)，1種基因突變與SAD相關(guān)。ApoE是SAD和晚發(fā)性FAD的易感基因，ApoE等位基因ε4是SAD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子［1］，然而攜帶APOEε4的SAD患者并不一定發(fā)病，所以可能還存在其他遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。我們?yōu)榱诉M(jìn)一步探討SAD與PSEN2基因突變的相關(guān)性，進(jìn)行了日本人群中PSEN2基因的序列測(cè)序。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

300例患者來(lái)自日本神戶(hù)大學(xué)附屬醫(yī)院精神神經(jīng)科門(mén)診。其中男120例，女180例，年齡56~92歲，平均（72.57±7.56）歲。入組患者均進(jìn)行常規(guī)檢查、腦電圖、MRI檢查，MRI檢查顯示內(nèi)顳葉結(jié)構(gòu)萎縮，包括海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核和內(nèi)嗅皮質(zhì)［2，3］。并根據(jù)NINCDS/ADRDA統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)確立為很可能的AD［4］，患者或知情者訴有超過(guò)6個(gè)月的緩慢進(jìn)行性記憶減退，測(cè)試發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的情景記憶損害的客觀證據(jù)，主要為回憶受損，通過(guò)暗示或再認(rèn)測(cè)試不能顯著改善或恢復(fù)正常，全部患者無(wú)陽(yáng)性家族史。并用簡(jiǎn)易智能量表（MMSE）進(jìn)行認(rèn)知能力評(píng)估，評(píng)分≤24分者被選入組。對(duì)照組300例來(lái)自社區(qū)隨機(jī)抽樣。其中男120例，女180例，年齡55~94歲，平均（70.97±6.73）歲；進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查及MRI檢查均正常者被選入組，并且MMSE得分≥28分。此研究經(jīng)日本神戶(hù)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR：提取所有受試者的周?chē)? ml，用基因組DNA提取試劑盒從外周血的白細(xì)胞中提取基因組DNA。用PCR方法進(jìn)行PSEN2基因外顯子區(qū)域的擴(kuò)增。正向引物及反向引物見(jiàn)表1。用Takara DNA多聚酶進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系30μL：包括100ng基因組DNA 1μL、30pmol/L的引物各1μL、3μL的 10×PCR 緩沖液、0.2 mmol/L的dNTP 3μL、1U的Takara Taq DNA多聚酶0.15μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃變性9 min后，進(jìn)入主循環(huán)；95℃30 s、各外顯子PCR的不同退火溫度30 s、72℃1 min共35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。外顯子2的PCR退火溫度為65℃，外顯子4的PCR退火溫度為56℃，其他外顯子PCR的退火溫度為60℃。取PCR產(chǎn)物5μL在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，之后用EB染色并在紫外線(xiàn)下觀察結(jié)果。

1.2.2 堿基序列測(cè)序：采取直接測(cè)序PCR產(chǎn)物，首先用PCR純化試劑盒（Qiagen，USA）純化25μL的PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行堿基序列的測(cè)序反應(yīng)（用PCR引物），反應(yīng)體系為20μL；包括純化PCR產(chǎn)物1 μL，10 pmol/L的單向引物2μL，BigDye Terminator1.1的4μL，Sequence緩沖液4μL。退火溫度為56℃。然后用ABI 3700基因測(cè)序儀（ABI，USA）進(jìn)行測(cè)序。核酸序列經(jīng)數(shù)據(jù)收集軟件整理，用DNAsis2軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。

2 結(jié)果

采用12對(duì)引物（表1），對(duì)PSEN2基因的各外顯子分別進(jìn)行PCR及直接測(cè)序。測(cè)序300例患者組PSEN2基因序列，在3例SAD患者的外顯子3上發(fā)現(xiàn)了100G>A基因突變，第34號(hào)密碼子由甘氨酸到絲氨酸（G34S）的變化（圖1），而300例對(duì)照組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此基因突變。顯然，100G>A基因突變?cè)赟AD組中的頻率為1%，對(duì)照組中的頻率為0%。此外，在1例67歲的SAD患者PSEN2基因的外顯子4上發(fā)現(xiàn)1915C>T基因突變，但此基因突變沒(méi)有引起氨基酸編碼的改變（87H）。

表1 各外顯子的引物Tab.1 The primers of exons

3 討論

圖1 PSEN2基因DNA測(cè)序結(jié)果Fig.1 The results of DNA sequencing of PSEN2

PSEN2基因全長(zhǎng)24 837 bp，位于1號(hào)染色體，有12個(gè)外顯子，從第3個(gè)外顯子到第12個(gè)外顯子含有編碼區(qū)，共2 236 bp。PSEN2蛋白是由PSEN2基因編碼的448個(gè)氨基酸組成，是8次跨膜的膜蛋白質(zhì)。PSEN2蛋白與其同源性的PSEN1蛋白是γ分泌酶復(fù)合體的組成之一，也是活性中心。PSEN屬于天冬酰氨蛋白酶家族（aspartyl protease family），在8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（transmenbrane domain，TMD）中，2個(gè)分別位于TMD6及TMD7中的天冬氨酸殘基是催化剪切底物必需的活性位點(diǎn)（圖2）。PSEN首先以無(wú)活性的全蛋白形式分泌，再經(jīng)過(guò)自身催化的跨膜剪切斷裂為功能性片斷C端片段（CTF）和N端片段（NTF），才形成有生物功能的PSEN-NTF/CTF二聚體。除此之外，PSEN在C端保守的PAL（prolinealanine-leucine，脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸）序列以及在第 4跨膜區(qū)中保守的 WNF（tryptophan-asparagine-phenylalanine，色氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸）序列，對(duì)于γ分泌酶的活性也很重要［5］。當(dāng)PSEN蛋白異常時(shí)，會(huì)改變?chǔ)梅置诿傅幕钚?，從而?dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生過(guò)量的異常沉積的Aβ42，或?qū)е?Aβ42/Aβ40 的比例失調(diào)［6］。目前PSEN2基因測(cè)序的研究中，已發(fā)現(xiàn)11個(gè)PSEN2基因突變，所有基因突變的表現(xiàn)型均為AD。

為了探索AD的致病基因，以微陣列或SNP（singlenucleotidepolymorphism）為標(biāo)記檢測(cè)堿基全序列的研究是目前國(guó)內(nèi)外的熱門(mén)。根據(jù)國(guó)際人類(lèi)基因組計(jì)劃已經(jīng)清楚人類(lèi)的全部基因，并進(jìn)行了大量的基因分析，盡管這樣還有很多堿基替換的報(bào)道接連不斷。1995年，Sherrington等［7］發(fā)現(xiàn) M146L、H163R、A246E、L286V和C410Y 5個(gè)位于PSEN1基因的突變。相繼100多個(gè)PSEN1基因突變?cè)诩易逍訟D中陸續(xù)被報(bào)道，其中3個(gè)PSEN1基因突變是在SAD中被報(bào)道。其一是Dumanchin等［8］在法國(guó)的37歲SAD患者中發(fā)現(xiàn)的M139K基因突變。其二是Kamimura等［9］在日本的散發(fā)人群中發(fā)現(xiàn)的1例具有H163R基因突變的AD患者。這兩個(gè)基因突變分別位于PSEN1蛋白CTF第5外顯子的TM-II和第6外顯子的HL-II，認(rèn)為均具有致病性［10］。其三是Scacchi等［11］在85歲SAD患者的外顯子4上發(fā)現(xiàn)的N32（AAT>AAC）的基因突變。該基因突變位于PSEN1蛋白的非功能區(qū)NTF，認(rèn)為不具有致病性。另外，Rogaeva等［12］在家族性AD中發(fā)現(xiàn)了R35Q、A79V基因突變。這兩種基因突變也位于PSEN1蛋白的非功能區(qū)NTF，認(rèn)為與AD發(fā)病無(wú)關(guān)。

PSEN2基因分析中，Bird首次提出PSEN2基因突變會(huì)引起家族性AD。Bird報(bào)道的Volga German家系的發(fā)病原因?yàn)镹141I的基因突變，其AD的平均發(fā)病年齡為58.7歲［13］。同期，Rogaev等在意大利FLO10家系中發(fā)現(xiàn)了具有PSEN2基因M239V基因突變的9例患者，發(fā)病年齡為45~88歲，平均50歲?？梢?jiàn)PSEN2基因點(diǎn)突變有早發(fā)性AD也有晚發(fā)性AD，且外顯率不是100%，同一家族里具有PSEN2基因點(diǎn)突變的成員不一定發(fā)病。PSEN2基因突變?cè)赟AD人群中也有報(bào)道，Cruts等在荷蘭的SAD人群中發(fā)現(xiàn)了R62H基因突變，位于PSEN2蛋白的非功能區(qū)NTF，患者的發(fā)病年齡為62歲，在SAD中此基因突變的頻率為1%，正常對(duì)照組中的頻率為0%。Walker等［14］將PSEN2基因突變載體轉(zhuǎn)染到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，觀察Aβ的含量。發(fā)現(xiàn)N141I、M239V、M239I和T122P等基因突變體的Aβ42或者Aβ42/Aβ40的比例比對(duì)照組有明顯增多，但R62H、S130L、V148I、D439A 等基因突變體沒(méi)有相應(yīng)的變化?？梢?jiàn)部分PSEN2基因突變可能是與AD發(fā)病無(wú)關(guān)的點(diǎn)突變。本文的G34S基因突變與R62H同樣在SAD中被發(fā)現(xiàn)，同樣位于PSEN2蛋白的非功能區(qū)NTF，G34S基因突變?cè)赟AD中的頻率為1%，在對(duì)照組中頻率為0%，曾被認(rèn)為有可能與AD的發(fā)病有關(guān)［15］。G34S基因突變可能與SAD發(fā)病無(wú)關(guān)的正常多態(tài)性，但其生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步探討。對(duì)于1915 C>T（87H）的基因突變沒(méi)有引起氨基酸編碼的改變，且同樣位于PSEN2蛋白非功能區(qū)NTF，所以不會(huì)影響PSEN2蛋白的功能。

今后為了更多的發(fā)掘與AD相關(guān)的新的基因或者新的基因突變，有必要繼續(xù)進(jìn)行基因分析。在AD發(fā)病中除了顯性遺傳之外，還有多個(gè)基因的多重作用，并且在明確的家系中也存在非顯性遺傳方式遺傳、或者母性遺傳方式遺傳的報(bào)道。更不應(yīng)忽視人種差異、區(qū)域、環(huán)境、放射線(xiàn)等基因以外的影響。AD遺傳學(xué)不像單一的顯性遺傳那么簡(jiǎn)單，應(yīng)該是復(fù)合因子相互影響的一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題。

［1］Saunders AM，Strittmatter WJ，Schmechel D，et al.Association of apolipoprotein Ealleleepsilon 4 with late-onset familial and sporadic Alzheimer’sdisease［J］.Neurology，1993，43（8）：1467-1472.

［2］Jack CR Jr，Petersen RC，Xu YC，et al.Medial temporal atrophy on MRIin normal aging and very mild Alzheimer’sdisease［J］.Neurology，1997，49（3）：786-794.

［3］母其文，謝敬霞，翁雅琴，等.早期階段Alzheimer病內(nèi)顳葉記憶系統(tǒng)多相關(guān)結(jié)構(gòu)多變量的定量MRI研究［J］.中華放射學(xué)雜志，1998，32（12）：807-811.

［4］McKhann G，Drachman D，F(xiàn)olstein M，et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease：report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s Disease［J］.Neurology，1984，34 （7）：939-944.

［5］Tomita T，Watabiki T，Takikawa R，et al.The first proline of PALP motif at the Cterminus of presenilins is obligatory for stabilization，complex formation，and gamma-secretase activities of presenilins［J］.JBiolo Che，2001，276（35）：33273-33281.

［6］Joanna LJ，Daniel JF，Jeffrey A，et al.Mutant presenilins specifically elevate thelevelsof the Aβ42 residue β-amyloid peptide in viva evidencefor augmentation of Aβ42-specific γsecretase［J］.Human Mol Genet，2004，13（2）：159-170.

［7］Sherrington R，Rogaev EI，Liang Y，et al.Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease［J］.Nature，1995，375（6534）：754-760.

［8］Dumanchin C，Brice A，Campion D，et al.Denovopresenilin 1 mutations are rare in clinically sporadic，early onset Alzheimer's disease cases.French Alzheimer’s Disease Study Group ［J］.J Med Gen，1998，35（8）：672-673.

［9］Kamimura K，Tanahashi H，Yamanaka H，et al.Familial Alzheimer’s diseasegenesin Japanese［J］.JNeuro Sci，1998，160（1）：76-81.

［10］Cruts M，Van BC.Presenilin mutations in Alzheimer’s disease［J］.Hum Mut，1998，11（3）：183-190.

［11］Scacchi R，Gambina G，Moretto G，et al.A mutation screening by DHPLC of PSEN1 and APP genes reveals no significant variation associated with the sporadic late-onset form of Alzheimer’s disease［J］.Neuro Lett，2007，418（3）：282-285.

［12］Rogaeva EA，F(xiàn)afel KC，Song YQ，et al.Screening for PS1 mutations in a referral-based series of AD cases：21 novel mutations［J］.Neurology，2001，57（4）：621-625.

［13］Bird TD，Lampe TH，Nemens EJ，et al.Familial Alzheimer’s disease in American descendants of the Volga Germans：probable genetic founder effect［J］.Ann Neur，1988，23（1）：25-31.

［14］Walker ES，Martinez M，Brunkan AL，et al.Presenilin 2 familial Alzheimer’sdisease mutations result in partial loss of function and dramatic changes in Abeta 42/40 ratios［J］.JNeuroche，2005，92（2）：294-301.

［15］Yasuda M，Quan W，Maeda K，et al.Genetic Analysis of Japanese Cases with Alzheimer Disease［J］.Ann Re Pharma Res Fou，2004，36：242-247.