quot;黑美人quot;馬鈴薯多酚氧化酶的特性研究

周向軍，高義霞，袁毅君，鄭 芳，張 繼，2，*

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

quot;黑美人quot;馬鈴薯多酚氧化酶的特性研究

周向軍1，高義霞1，袁毅君1，鄭 芳1，張 繼1，2，*

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以鄰苯二酚為底物，在413nm處測定黑美人馬鈴薯多酚氧化酶（PPO）的活性，研究了溫度、pH、底物濃度對其活性的影響，并建立了酶促褐變反應(yīng)動力學(xué)方程，探討了L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA及亞硫酸氫鈉五種抑制劑對酶促褐變的抑制效果。結(jié)果表明：黑美人馬鈴薯多酚氧化酶最適反應(yīng)pH為6.3；最適反應(yīng)溫度為35℃；酶促褐變反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程描述的單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)，以鄰苯二酚為底物，Km=0.0011mol/L，Vmax=142.23U/min·g；動力學(xué)方程為V=142.23［S］/（0.0011+［S］）；五種抑制劑均對PPO酶促褐變具有抑制作用，其強(qiáng)弱依次為亞硫酸氫鈉＞L-半胱氨酸＞抗壞血酸＞EDTA＞檸檬酸。

“黑美人”馬鈴薯，多酚氧化酶，抑制劑，反應(yīng)動力學(xué)，酶促褐變

“黑美人”馬鈴薯，又稱紫色馬鈴薯，表皮光滑，呈黑紫色，果肉色澤也為紫色。這種馬鈴薯不但外表好看，其營養(yǎng)價值也比普通馬鈴薯高，它不但含有普通馬鈴薯所擁有的淀粉、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸，而且富含有花青素、VC、胡蘿卜等多種維生素，素有“地下蘋果”和“第二面包”之稱［1］。黑美人馬鈴薯薯肉含有大量的花青素，而花青素是一種天然抗氧化劑，可以消除人體內(nèi)因代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)-自由基，因此黑美人馬鈴薯具有抗癌、延緩機(jī)體組織衰老、增強(qiáng)血管彈性、改善循環(huán)系統(tǒng)、增進(jìn)皮膚光滑度、抑制炎癥和過敏、改善關(guān)節(jié)的柔韌性等功效［2］。多酚氧化酶（PPO）是一種含銅的氧化酶，植物受到機(jī)械損傷或病菌感染后，PPO催化酚與O2氧化成醌與蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致黑色素的生成［3］，使馬鈴薯色澤變劣，品質(zhì)下降，影響其進(jìn)一步加工，因此研究PPO酶促褐變機(jī)理、控制加工過程中的褐變程度對于提高黑美人馬鈴薯的應(yīng)用價值具有重要作用。本研究主要對PPO活性的影響因素進(jìn)行了探索，并分析了幾種抗褐變劑的抑制效果，旨在為黑美人馬鈴薯加工過程防止褐變提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮黑美人馬鈴薯 采購于甘肅省天水市蘭天綜合超市；鄰苯二酚、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、L-半胱氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 均為分析純。

高速冷凍離心機(jī)，分光光度計(jì)，數(shù)顯恒溫水浴鍋，精密酸度計(jì)，電子天平，透析袋（MWCO 14000），磁力攪拌器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑美人馬鈴薯多酚氧化酶粗酶液的制備 取新鮮黑美人馬鈴薯去皮，精確稱取5g，迅速放入-20℃預(yù)冷的研缽中，按照1∶5（W/V）的比例依次加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH6.8）30mL、2%PVPP，研磨3min成勻漿［4］，充分混合，置4℃冰箱中靜止30min后，低溫?cái)嚢柰肝?4h，期間不斷更換外液5次。將袋內(nèi)液全部轉(zhuǎn)入離心管中，4℃，5000r/min離心15min，傾出上清液密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPO活性的測定 以1.95mL、pH6.8的磷酸緩沖液和0.5mL、0.1μmol/L的鄰苯二酚溶液為底物，加入0.5mL酶液，35℃反應(yīng) 5min，于最大吸收波長413nm處測定OD值。酶活力單位定義：在測定條件下，吸光度值每分鐘增加0.01所需要的酶量定義為一個活力單位［5］。

1.2.3 溫度對酶促反應(yīng)速度的影響 分別在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃條件下，測定PPO活性，確定最佳酶促反應(yīng)溫度。

1.2.4 pH對酶促反應(yīng)速度的影響 取14個試管，分別加入pH為2.8、3.3、3.8、4.3、4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3、7.8、8.3、8.8、9.3的磷酸緩沖液進(jìn)行酶促反應(yīng)，在35℃下測定吸光值，確定最佳酶促反應(yīng)pH。

1.2.5 不同底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 在35℃，pH6.3條件下測定底物濃度分別為0.0001、0.0002、0.0004、0.0006、0.0008、0.001、0.002、0.004mol/L時的吸光度，得不同底物濃度隨時間的變化曲線，并擬合各直線斜率，即為反應(yīng)初速度。

1.2.6 不同抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響 各反應(yīng)體系中分別加入半胱氨酸、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、EDTA及檸檬酸五種不同濃度的抑制劑，同時以相同體積的蒸餾水為對照，測定黑美人馬鈴薯PPO活性，以對照實(shí)驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)為PPO的100%相對活力，計(jì)算各抑制劑的抑制百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

黑美人馬鈴薯PPO以鄰苯二酚為底物進(jìn)行酶促化學(xué)反應(yīng)，生成褐色醌類化合物，進(jìn)行波長掃描得到吸收曲線，見圖1。由圖1可知，產(chǎn)物在413nm處具有最大吸收峰。因此，本研究中PPO活性的測定波長均選擇413nm。

2.2 黑美人馬鈴薯多酚氧化酶反應(yīng)進(jìn)程曲線

由圖2可知，在反應(yīng)初始階段，酶促褐變反應(yīng)發(fā)生速度加快，幾乎呈線性增加，但當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)5min后，曲線的斜率逐漸降低，說明反應(yīng)速率下降，究其主要原因可能為：一是底物濃度降低和產(chǎn)物濃度增加致使逆反應(yīng)加強(qiáng)；二是醌類物質(zhì)不穩(wěn)定，黑美人馬鈴薯PPO酶液中含有抗壞血酸等抗氧化劑，生成的產(chǎn)物被其還原成鄰苯二酚［6］。因此選擇5min為酶促反應(yīng)時間。

圖1 波長掃描曲線

圖2 黑美人馬鈴薯PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線

2.3 溫度對PPO活性的影響

溫度與PPO活性的關(guān)系曲線見圖3。由圖3知，在35℃以下，黑美人馬鈴薯PPO活性隨溫度升高而逐漸增加，但活力相對較高且變化不大，說明PPO是一種嗜冷酶［7］；當(dāng)溫度達(dá)到35℃以上時，PPO活性逐漸下降，且變化較大，說明黑美人馬鈴薯PPO對熱不穩(wěn)定，究其原因可能為：溫度增高，加速酶促反應(yīng)速度，但當(dāng)超過最適溫度后，反而使酶失活，降低了酶促反應(yīng)速度［8］。在35℃時表現(xiàn)出最大吸收值，即黑美人馬鈴薯PPO最適溫度為35℃。

圖3 溫度對PPO活性的影響

2.4 pH對PPO活性的影響

pH和PPO活性的關(guān)系曲線見圖4。由圖4可知，pH對PPO活性的影響非常靈敏，當(dāng) pH處于3.8～6.3時，酶促反應(yīng)速度明顯加快，原因可能是酸性條件下對輔助因子Cu2+的穩(wěn)定性有利；當(dāng)pH達(dá)到6.8后，酶促反應(yīng)速度開始急劇下降，原因可能是堿性條件下輔助因子Cu2+解離出來，形成Cu（OH）2沉淀，使酶活性顯著降低［9］。在pH3.8、5.3、6.3時，分別具有相應(yīng)的吸收峰，表明PPO具有三個同工酶［10］。pH6.3處具有最大PPO活性，這是因?yàn)槠浠钚灾行暮薪M氨酸基團(tuán)（pK=6.0），所以在中性條件下表現(xiàn)出較高的PPO活性，因此黑美人馬鈴薯PPO最適pH為6.3。

2.5 底物濃度對PPO活性的影響

制作不同底物濃度隨時間的變化曲線，并分別擬合所得直線斜率，此斜率即為反應(yīng)初速度，并制作初速度與底物濃度的關(guān)系曲線圖，如圖5、圖6所示。

圖4 pH對PPO活性的影響

圖5 不同底物濃度對反應(yīng)速度的影響

圖6 反應(yīng)初速度隨底物濃度的變化曲線

由圖6可以看出，黑美人馬鈴薯PPO酶促褐變反應(yīng)初速度隨底物濃度的變化曲線類似于米氏方程描述的變化規(guī)律。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用雙倒數(shù)作圖進(jìn)行相應(yīng)的處理進(jìn)行驗(yàn)證，得1/V0-1/［S］的關(guān)系圖，如圖7所示，擬合得到的直線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9933，可見黑美人馬鈴薯PPO酶促褐變反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程［11］。根據(jù)直線斜率和截距可求得該反應(yīng)的Km=0.001128mol/L，Vmax=142.22816U/min·g，相應(yīng)的動力學(xué)方程為V= 142.23［S］/（0.0011+［S］）（U/min）。

2.6 抑制劑對PPO活性的影響

半胱氨酸、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、EDTA及檸檬酸五種抑制劑對PPO活性的影響見圖8和圖9。由圖8和圖9可知，亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、EDTA、檸檬酸均對黑美人馬鈴薯PPO活性有一定的抑制作用。亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸在較低濃度時具有較好的抑制效果，當(dāng)達(dá)到10mmol/L時，PPO活性幾乎被完全抑制；對于EDTA和檸檬酸，當(dāng)達(dá)到200mmol/L時，PPO活性被檸檬酸抑制20%左右，被EDTA完全抑制。亞硫酸氫鈉的相對活性出現(xiàn)負(fù)值原因可能是過多的亞硫酸氫鈉將體系內(nèi)本身存在的醌類物質(zhì)還原成無色物質(zhì)所致［12］。在中性和堿性溶液中，抗壞血酸很不穩(wěn)定，容易褐變，另外，由于粗酶液體系中本身含有抗壞血酸氧化酶，所以當(dāng)加入抗壞血酸時，首先抗壞血酸被氧化形成脫氫抗壞血酸，水合形成2，3-二酮古洛糖酸，脫水脫羧形成糠醛和二氧化碳，再進(jìn)一步形成褐色素，所以當(dāng)抗壞血酸在低濃度時（4mmol/L以下），主要促進(jìn)褐變，致使沒有抑制效果；濃度增大時（4mmol/L以上），褐變被逐漸抑制。檸檬酸主要是提供酸性環(huán)境，使PPO偏離最適pH，同時三個羧基螯合Cu2+；EDTA提供堿性環(huán)境，同時也具有螯合金屬離子的作用；抗壞血酸、亞硫酸氫鈉及半胱氨酸對PPO的抑制作用主要是其還原酚氧化生成的醌類化合物成無色化合物［12］。

圖7 1/V0-1/［S］

圖8 不同抑制劑對PPO活性的影響

圖9 不同抑制劑對PPO活性的影響

3 結(jié)論

黑美人馬鈴薯PPO最適反應(yīng)pH為6.3；最適反應(yīng)溫度為35℃，為一種嗜冷酶。PPO酶促褐變反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)。以鄰苯二酚為底物，Km=0.0011mol/L，Vmax=142.23U/min·g；動力學(xué)方程為V=142.23［S］/（0.0011+［S］）。不同抑制劑對PPO活性影響程度不同，抑制作用強(qiáng)弱依次為亞硫酸氫鈉＞L-半胱氨酸＞抗壞血酸＞EDTA＞檸檬酸。

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Study on characteristics of polyphenoloxidase（PPO）in Heimeiren potato

ZHOU Xiang-jun1，GAO Yi-xia1，YUAN Yi-jun1，ZHENG Fang1，ZHANG Ji1，2，*
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.Department of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

The activity of Heimeiren potato polyphenoloxidase（PPO）was determined by spectrophotometer at 413nm using catechol as substrate.The effects of the temperature，pH，substrate concentration and inhibitors on PPO were studied and the reaction kinetics equation was also established.The results showed that the optimum temperature and pH were 35℃and pH6.3，respectively.The reaction kinetics of enzymatic browning accorded with Michaelis Equation model.The Km，Vmaxand kinetics equation were 0.0011mol/L，142.23U/min·g and V=142.23［S］/（0.0011+［S］）using catechol as substrate，respectively.Five different inhibitors demonstrated different effects on enzymatic browning of PPO and the inhibiting order was as follows：sodium bisulfite＞L-cysteine＞ascorbic acid＞EDTA＞citric acid.

Heimeiren potato；polyphenoloxidase（PPO）；inhibitors；reaction kinetics；enzymatic browning

TS255.3

A

1002-0306（2011）01-0115-04

2010-01-18 *通訊聯(lián)系人

周向軍（1980-），男，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。