高效毛細(xì)管電泳中移動(dòng)反應(yīng)界面法富集奶粉中三聚氰胺的方法研究

黨 亞，李 敏，王秋蘭，馮呈呈，王劭獅

（滁州學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽滁州 239000）

高效毛細(xì)管電泳中移動(dòng)反應(yīng)界面法富集奶粉中三聚氰胺的方法研究

黨 亞，李 敏，王秋蘭，馮呈呈，王劭獅

（滁州學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽滁州 239000）

運(yùn)用移動(dòng)反應(yīng)界面理論建立奶粉中三聚氰胺的毛細(xì)管電泳富集分離體系。與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳相比，體系中引入了富集緩沖溶液（富集相）和分離緩沖溶液（分離相）。優(yōu)化的條件：樣品緩沖溶液為50mmol／L甲酸－甲酸鈉（p H2.60），富集相為20mmol／L甲酸鈉－甲酸p H8.00），分離緩沖溶液為50mmol／L～50mmol／L甲酸－甲酸鈉（p H2.60）；樣品壓力進(jìn)樣50mbar×40s，富集相壓力進(jìn)樣50mbar×20s，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)232nm，電壓30kv。該方法比常規(guī)電泳靈敏度高近20倍。

毛細(xì)管電泳；移動(dòng)反應(yīng)界面；三聚氰胺；富集；奶粉

三聚氰胺（melamine，MEL）簡(jiǎn)稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。其最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂 （MF）的原料。近幾年食品安全問(wèn)題頻繁出現(xiàn)，引起社會(huì)廣泛的關(guān)注。其中不法商人在食品或飼料中添加三聚氰胺（即所謂的“蛋白精”），以提高蛋白質(zhì)的表觀含量，對(duì)人民生命安全造成很大危害。因此建立快速的檢測(cè)方法以確保食品的安全十分重要。目前三聚氰胺的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法（LC）［1］、液相質(zhì)譜法（LC－MS）［2］、氣相色譜法（GC）和氣相色譜法－質(zhì)譜（GC－NS）［3］。液相色譜法因需要大量的預(yù)處理步驟而稍顯麻煩。與其相比，毛細(xì)管電泳具有速度快、分離效率高、上樣量小、廢液少等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于毛細(xì)管的光路只有50～100μm，因此紫外吸收檢測(cè)法的靈敏度不高。各種毛細(xì)管電泳富集方法用于提高檢測(cè)靈敏度。這些富集方法包括：場(chǎng)放大樣品富集（FASS）［4］、場(chǎng)放大進(jìn)樣富集（FASI）［5］、p H梯度、p H動(dòng)態(tài)連接、以及等速電泳法［6］和掃集法［7］。

移動(dòng)反應(yīng)界面法（MRB）是建立在沉淀反應(yīng)界面理論［8］和移動(dòng)界面理論［9］基礎(chǔ)上的一種富集方法。一系列關(guān)于移動(dòng)沉淀反應(yīng)界面及中和界面［10］的實(shí)驗(yàn)定量地證明并發(fā)展了這一理論。在MRB方法中，富集相溶液和樣品緩沖溶液間形成反應(yīng)界面，樣品可在界面處實(shí)現(xiàn)富集。

MRB理論已經(jīng)被進(jìn)一步用于富集兩性物質(zhì)［11］和巴比妥類物質(zhì)［12］，但這一方法用于堿性物質(zhì)的富集至今見(jiàn)有一篇報(bào)道［13］。本文應(yīng)用MRB的方法進(jìn)行奶粉中三聚氰胺的富集。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

HP毛細(xì)管電泳儀（Agilent公司）配有二極管陣列檢測(cè)器；Milli－Q超純水儀（美國(guó)密理博公司）；TGL－16高速電動(dòng)離心機(jī)（無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司）；PHS－3C p H計(jì)（上海宇?。幻?xì)管（河北永年光學(xué)儀器廠）；CP124S型分析天平。

甲酸、甲酸鈉、鹽酸、乙腈、甲醇（均為分析純）；甲醇溶液：甲醇－水（體積比為20：80）。市售某品牌奶粉；三聚氰胺（滁州金豐有限公司，純度≥99.9%）

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

毛細(xì)管為52cm×75um（有效長(zhǎng)度43.5cm）；運(yùn)行電壓30kv；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)（232nm）；實(shí)驗(yàn)溫度25℃；樣品緩沖溶液為50mmol／L甲酸－甲酸鈉（p H2.60）；富集相溶液為20mmol／L甲酸鈉－甲酸（p H8.00）；分離緩沖溶液為50mmol／L甲酸鈉－甲酸（p H2.60）；毛細(xì)管使用前均依次用1.0mmol／L NaOH沖洗30min；超純水沖洗15min；分離緩沖溶液沖洗30min；兩次進(jìn)樣中間用緩沖溶液沖洗3min。

1.3 溶液的配制

用甲醇溶液溶解三聚氰胺標(biāo)品配成500mg／L的儲(chǔ)備液；分別配制一系列濃度和p H值的甲酸－甲酸鈉溶液及甲酸鈉溶液作為樣品緩沖溶液、分離緩沖溶液、富集緩沖溶液。

1.4 奶粉的前處理方法

稱取2.0g奶粉兩份，一份加入40ml 20%甲醇溶液，另一份加入40ml三聚氰胺儲(chǔ)備液，各加入2.5%甲酸5ml，超聲5min后各取1ml上述液體，分別加入9ml乙腈，超聲10min后離心（12000r／min）取上清液在（78－80℃）下蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶液復(fù)溶到10ml，待上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MRB基礎(chǔ)上的富集與分離條件

三聚氰胺呈堿性（p Kb＝8）。根據(jù)MRB理論，試驗(yàn)在背景緩沖溶液和樣品緩沖溶液之間加入一段甲酸鈉溶液作為富集相，當(dāng)加入高壓時(shí)，樣品相和富集相之間形成化學(xué)反應(yīng)界面，當(dāng)物質(zhì)的遷移速度大于反應(yīng)界面速度時(shí)，三聚氰胺進(jìn)入富集相，使其帶有的正電荷減少，遷移速度變慢，當(dāng)進(jìn)入樣品相時(shí)遷移速度變快，反復(fù)進(jìn)行，從而使三聚氰胺在界面富集。在本實(shí)驗(yàn)中，使用低p H（2.6）的甲酸緩沖溶液作為樣品和背景電解質(zhì)，采用20mmol／L甲酸鈉（p H8.00）作為富集相緩沖溶液，當(dāng)富集完成后，物質(zhì)在背景電解質(zhì)中分離。具體操作步驟如圖1所示。

圖1 基于移動(dòng)反應(yīng)界面的操作步驟

2.2 富集和分離條件的優(yōu)化

2.2.1 分離緩沖溶液優(yōu)化

三聚氰胺在酸性環(huán)境下帶正電荷［14］，在電壓為30kv電泳條件下，采用樣品濃度為40mg／L，分離緩沖溶液濃度在50mmol／L，p H 2.60～4.0的甲酸鈉－甲酸條件下，試驗(yàn)的最佳分離p H，研究了結(jié)果表明（如圖2），隨著p H的增大，三聚氰胺的遷移時(shí)間延長(zhǎng)而且分離效率不好，又研究了p H為2.60條件下，緩沖溶液濃度從10mmol／L～70mmol／L對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)在50mmol／L甲酸鈉－甲酸分離效果最好，綜合考慮，選p H＝2.60，甲酸鈉－甲酸為50mmol／L的背景緩沖溶液下進(jìn)行分離。

圖2 分離緩沖溶液p H對(duì)分離度的影響

2.2.2 富集相優(yōu)化

在常規(guī)分離電泳條件下，選擇甲酸鈉（p H8.00）作為富集相，研究其濃度從10mmol／L～50mmol／L的甲酸鈉對(duì)三聚氰胺富集效果的影響。結(jié)果表明如圖3：隨著富集相濃度的增大，峰高和分離度都有提高，但當(dāng)濃度超過(guò)20mol／L時(shí)，峰高有所降低，繼續(xù)增大濃度，由于奶粉中雜質(zhì)也有富集現(xiàn)象，使分離效果變差，綜合考慮用20mmol／L甲酸鈉，峰形，富集效果，分離效率最好，同時(shí)研究了一系列富集相在20mmol／L甲酸鈉p H值的影響結(jié)果表明只有在p H＝8.00時(shí)峰形較好，分離效率較高。

圖3 富集相對(duì)分離度和峰高的影響

2.2.3 進(jìn)樣時(shí)間和電壓優(yōu)化

為達(dá)到更好的富集效果，進(jìn)樣時(shí)間由5s增加到60s，相應(yīng)的富集相的進(jìn)樣時(shí)間也延長(zhǎng).隨著富集相進(jìn)樣的時(shí)間的延長(zhǎng)，三聚氰胺的遷移時(shí)間也延長(zhǎng)，而且峰高，峰寬與進(jìn)樣時(shí)間關(guān)系結(jié)果如圖4，但綜合分離效率、峰形、峰高，最終確定樣品相進(jìn)樣時(shí)間為40s，富集相進(jìn)樣20s。

圖4 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)富集效果的影響

研究操作電壓范圍為15～30kv的對(duì)分離效率、遷移時(shí)間和富集效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低電壓的電流小、遷移緩慢、分離效果較差，綜合考慮到分離度、富集效果，選擇操作電壓為30kv。

2.3 富集效果

將最優(yōu)化條件的進(jìn)樣時(shí)間40s和常規(guī)區(qū)帶電泳條件下的進(jìn)樣時(shí)間3s相近峰寬條件下比較如圖5，富集效果提高近20倍。

圖5 富集分離與常規(guī)分離比較

3 結(jié)論

本文提出一種簡(jiǎn)單有效的富集分離奶粉中三聚氰胺的方法，這一方法樣品處理簡(jiǎn)單，在復(fù)雜基體中不需過(guò)柱，只要簡(jiǎn)單處理樣品就可進(jìn)行富集分離。同時(shí)具有較高的分離效率，提高了毛細(xì)管電泳的靈敏度，分離成本較低，使用試劑少，經(jīng)濟(jì)。將進(jìn)一步使用該方法用于奶粉中三聚氰胺的定量檢測(cè)。

［1］趙永彪，李自春，劉 婷，等.高效液相色譜法測(cè)定寵物食品中的三聚氰胺［J］.分析試驗(yàn)室.2008，27（增刊）：190－192.

［2］蔡勤仁，歐陽(yáng)穎瑜，錢振杰，等.超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中殘留的三聚氰胺［J］.色譜，2008，26（3）：339－342.

［3］Bardalaye P C，Wheeler W B，Meister C W.Determination of Cyromazine and Melamine in Soils by High－performance Liquid Chromatographic Method［J］.J AOAC，1987，70（3）：455－457.

［4］Burgi D S，Chien R L.Large volume stacking of anions in capillary electrophoresis using an electroosmotic flow modifier as a pump［J］.Anal.Chem，1991，63（18）：2042－2047.

［5］Chien R L，BurgiD S.On－column sample concentration using field amplification in CZE［J］.J Chromatogr，1991，559（12）141－152.

［6］張 薇，曹成喜.毛細(xì)管電泳中高鹽樣品在線富集的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2005，33（2）：267－271.

［7］Quirino J P，Iwai Y，Otsuka K，Terabe S.Determination of environmentally relev－ant aromatic amines in the ppt levels by cation selective exhaustive injection－swe－eping－micellar electrokinetic chromatography［J］.Electrophoresis，2000， 21（14）：2899－2903.

［8］Deman J，Rigole W.Chemical reaction during electromigration of ions［J］.J.Phys.Chem，1970，74（5）：1122－1126.

［9］Cao C X.Moving chemical reaction boundary and isoelectric focusing：I the conditional equations of Svensson－Tiselius＇differential equation of solute concentration distribution in an idealized isoelectric focusing at steady state［J］.J.Chromatogr.A，1998，813（1）：153－172.

［10］Cao C X，Zhou S L，He Y Z，et al.Experimental Study on Moving Neutralization Reaction Boundary Created with the Strong Reactive Electrolytes of HCl and NaOH in Agarose Gel［J］.J.Chromatogr.A，2000，891（2）：337－347.

［11］Cao C X，He Y Z，Li M，et al.Stacking ionizable analytes in a sample matrix with high salt by a transient moving chemical reaction boundary method in capillary zone electrophoresis［J］.A－nal.Chem，2002，74（16）：4167－4174.

［12］Wang Q L，F(xiàn)an L Y，Zhang W，et al.Sensitive analysis of two barbiturates in human urine by capillary electrophoresis with sample stacking induced by moving reaction boundary［J］.Anal.Chim.Acta，2006，580（2）：200－205.

［13］王 星，張 薇，樊柳蔭，等.毛細(xì)管電泳中移動(dòng)反應(yīng)界面法富集分和檢測(cè)尿樣中的氧化苦參堿［J］.色譜，25（5）：694－698.

［14］饒欽雄，童 敬，郭 平，等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定牛奶和奶粉中殘留的三聚氰胺［J］.色譜，2008，26（6）：755－758.

Stacking and Separation of Melamine in Milk Powder by the Moving
Chemical Reaction Boundary Method in Capillary Electrophoresis

Dang Ya，Li Min，Wang Qiulan，F(xiàn)eng Chengcheng，Wang Shaoshi
（School of Material and Chemical Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，China）

A stacking system was based on moving reaction boundary（MRB）for stacking and separation of melamine in milk powder.The experimental conditions were optimized for the stacking of melamine as well as its separation.The optimized conditions were 50mmol／L HCOOH－HCOONa（p H2.60）as sample buffer，20mmol／L HCOONa－HCOOH（p H8.00）as stacking buffer，50mmol／L HCOOHHCOONa（p H 2.60）as separation buffer，50mbar（40s）sample phase injection and 50mbar（20s）stacking phase injection，232nm of detection wavelength，30kv of voltage.This method can be well used for stacking and separation of melamine in milk powder.

capillary electrophoresis（CE）；moving reaction boundary；melamine；stacking；milk powder

TS252.7

A

1673－1794（2011）05－0071－03

黨亞（1986－），男，滁州學(xué)院2007級(jí)本科生，中科院研究生，研究興趣：高效毛細(xì)管電泳分離富集；通信作者：李敏，副教授，Email：liminchen＠126.com。

滁州學(xué)院2010年度大學(xué)生校級(jí)研究項(xiàng)目（2010xs047），安徽省應(yīng)用化學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（200802187C），滁州學(xué)院科研項(xiàng)目（2008kj018B）

2011－03－23