微直流電場對大腸桿菌生長代謝活性的作用*

周生學 馬 潔

(1.寧夏師范學院化學與化學工程學院，固原，756000;2.首都師范大學化學系，北京，100048)

微直流電場對大腸桿菌生長代謝活性的作用*

周生學1＊＊馬 潔2

(1.寧夏師范學院化學與化學工程學院，固原，756000;2.首都師范大學化學系，北京，100048)

對大腸桿菌(Escherichia coli，DH5α)培養(yǎng)液在連續(xù)培養(yǎng)時分別通入不同強度的直流電場，研究了其在持續(xù)直流電刺激下的生長曲線、pH曲線、ATP酶活性、胞內(nèi)總蛋白含量、細胞膜通透性以及細菌微觀形態(tài)變化.結(jié)果表明，適宜的直流電能夠促進大腸桿菌增殖;大腸桿菌的ATP酶活在25 mA電流作用下在對數(shù)生長前期、對數(shù)生長后期和穩(wěn)定期分別比對照組同期提升1.68、1.57和1.31倍，表明適宜強度的電場增強了細菌細胞的代謝活性.細菌通透性也有不同程度提高，與通過透射電鏡觀察到細菌細胞通電后的形態(tài)變化具有一致性.

直流電場，生長代謝，大腸桿菌，酶活性.

用電化學方法刺激微生物改變正常生長代謝的技術(shù)在微生物發(fā)酵、微生物冶金［1］、細菌快速檢測［2］、生物醫(yī)藥及微生物土壤修復(fù)［3］等領(lǐng)域越來越受到人們的關(guān)注.目前使用的通電培養(yǎng)方法是在微生物培養(yǎng)液中通入微小直流電流，篩選得到對微生物細胞有利的電流刺激條件［4］.這種方法對酵母菌的發(fā)酵物產(chǎn)量及生物脫氮速率有明顯提高［5］;Matsumoto研究表明采用這種技術(shù)可以刺激細菌生長，并將微生物的生長期延長3倍，同時大幅增加細菌數(shù)量，減少能耗［6］.清華大學劉錚等人研究了直流電場對細菌Enterobacter dissolvens生長代謝的影響，認為10 mA是該菌生長的適宜電流強度，而電流強度大于100 mA則會對細菌生長產(chǎn)生抑制作用［7］.直流電場對微生物作用機制復(fù)雜，掌握這種機制，對調(diào)控電流以有效調(diào)節(jié)微生物生長代謝在微生物工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義.

大腸桿菌(Escherichia coli，DH5α)具有遺傳背景清楚，技術(shù)操作和培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟等優(yōu)點［8］，目前是在基因工程中應(yīng)用最廣泛、最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系.因此對大腸桿菌的深入研究具有很重要的學術(shù)和應(yīng)用意義.

本文通過控制直流電流強度對大腸桿菌DH5α進行電場刺激，探索了有利于提高大腸桿菌DH5α生長代謝的合適電流條件及其作用機理，并且探究了在不同電流條件下大腸桿菌DH5α生長代謝過程中菌體蛋白質(zhì)和酶活性等代謝過程的變化情況，得到了較系統(tǒng)的實驗結(jié)果，為進一步研究直流電場作用于大腸桿菌DH5α細胞的電場生物效應(yīng)作用機制提供了實驗參考.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

SONICS VC605超聲細胞破碎儀;HITACHI H-700電子透射顯微鏡;3K15型德國西格瑪臺式高速冷凍離心機(Sigma公司);VMP3多通道電化學工作站(法國Bio-Logic公司);721B型分光光度計(上海第三分析儀器廠);Milli-Q超純水處理器(美國Millipore公司);鈦網(wǎng)對電極;ATP酶活測試盒(南京建成生物工程研究所);酵母浸粉、胰蛋白胨(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠).

1.2 細菌的培養(yǎng)和活化

大腸桿菌(Escherichia coli，DH5α)由本校微生物實驗室提供.使用LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g·L－1，蛋白胨 10 g·L－1，氯化鈉 10 g·L－1，pH 7.0.

從斜面菌體接種1環(huán)到盛有200 mL已滅菌(在0.11 MPa，121℃條件下滅菌20 min)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37℃在恒溫搖床(150 r·min－1)中培養(yǎng)約10 h，此時獲得的細菌細胞處于對數(shù)生長期初期.

1.3 微直流電刺激實驗

微直流電刺激實驗在三口玻璃電解瓶中進行.加電陰、陽兩極均為鈦網(wǎng)電極(表觀面積3 cm ×3 cm，間距2 cm，通過測定電容值估算實際面積約為220 cm2［9］).從經(jīng)1.3活化培養(yǎng)的200 mL純菌液中取振蕩均勻的細菌培養(yǎng)液3 mL，接種到盛有300 mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基的電解瓶中加直流電處理，搖床恒溫培養(yǎng) (溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r·min－1)，以不加電培養(yǎng)作為空白對照.為了保證不同生長期細胞處理結(jié)果的可比性，以上所有操作，包括細胞的培養(yǎng)，均保持實驗條件的完全平行，且圖1中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)測定的平均值.

1.4 分析方法

細菌濃度檢測 采用平板計數(shù)法或測量660 nm波長處的吸光度值以反映細菌濃度.

細胞ATP酶活檢測 取待測菌懸液在細菌生長對數(shù)前期，對數(shù)后期和穩(wěn)定期的細菌進行處理后，用總ATP酶測定試劑盒測定ATP酶活性.其活性單位為:每mg蛋白中，ATP酶每小時分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位，單位為μmol·mg－1·h－1.

細胞顯微觀察 將細菌樣品溶液數(shù)滴滴在硫酸紙上，用帶膜銅網(wǎng)面向下放在液滴上，吸附3—5 min，取出后用濾紙吸干;用3%磷鎢酸染色1—2 min，用濾紙吸干殘液，用透射電子顯微鏡(HITACHI H-700 TEM)觀察細菌的顯微形態(tài).

大腸桿菌總蛋白含量的測定:采用考馬斯亮藍法檢測細菌內(nèi)總蛋白含量.

大腸桿菌在直流電場刺激下的通透性測定 測定大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液離心處理后上清液中蛋白質(zhì)的濃度來反映細菌通透性變化.方法為:取5 mL待測菌液，5000 r·min－1離心20 min，取上清液稀釋后用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定.

電化學循環(huán)伏安曲線測定 以鈦盤電極(電極面積為0.927 cm2)為工作電極，鉑網(wǎng)電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極構(gòu)成三電極體系，采用VMP多通道電化學工作站對滅菌后的新鮮培養(yǎng)基進行循環(huán)伏安實驗，以表征培養(yǎng)基的電化學特性.

2 結(jié)果與討論

2.1 微直流電場對大腸桿菌DH5α生長和pH值的影響

微直流電場對大腸桿菌DH5α生長的影響見圖1.在不通入電流條件下測定了加入鈦電極和不加電極時菌株的生長曲線，結(jié)果表明，所用鈦電極對細菌的生長無明顯干擾(數(shù)據(jù)略).

由圖1可見，當外加直流電10 mA，培養(yǎng)30 h時，菌液的A660達到最大，與不加電場時菌液A660的最大差值為0.500，大腸桿菌DH5α生長較好;當電流強度為25 mA時，細菌在培養(yǎng)過程中生長曲線均高于對照組和加電10 mA菌株，當培養(yǎng)26 h時，菌液的A660達到最大，與對照組相比最大差值為0.524，大腸桿菌DH5α與其它電流條件處理的菌液相比生長最好;當電流強度增至35 mA，菌液的A660與對照組相比逐漸靠近.而當電流強度增至100 mA，菌液的A660開始低于對照組菌液的A660，說明電流強度增大到100 mA對大腸桿菌DH5α正常增殖具有抑制作用.由此可見，當電流強度為10—25 mA時可以促進大腸桿菌DH5α的生長，其中最佳電流強度為25 mA.

pH值影響到微生物對營養(yǎng)物的吸收程度［10］以及細菌胞內(nèi)和胞外酶的活性.微直流電場對菌液pH的影響見圖2.由圖2可見，細菌在0—2 h，pH均有所下降;到4 h后開始上升，10 h后變化趨于平緩，通電菌樣與不通電菌樣的pH相比差距較小，維持在0.1—0.4之間;且通電組與對照組相比隨著電流強度的不同，pH在4 h后上升速度也不同［11-12］.本課題組對此現(xiàn)象的原因也進行了分析［13］.

2.2 微直流電場對大腸桿菌DH5α總蛋白含量的影響

微直流電場對大腸桿菌DH5α總蛋白含量的影響見圖3.為了保證實驗的準確性及不同生長期細菌的可比性，實驗中的實驗條件是平行的，圖中數(shù)據(jù)都是3次測定取平均值.如圖3所示，在對數(shù)生長前期(earlier log phase)，加電流25 mA大腸桿菌DH5α胞內(nèi)總蛋白含量低于對照組菌液和加電10 mA菌液，說明25 mA電流強度在對數(shù)生長前期對細菌生長略有抑制，與其生長曲線吻合;在對數(shù)生長后期(later log phase)，25 mA電流的胞內(nèi)總蛋白含量為0.264 g·L－1，是0 mA對照組菌液在同一生長時期的1.11倍，并高于同期的10 mA加電菌液;在穩(wěn)定期(stable phase)，25mA電流的胞內(nèi)總蛋白含量為0.286 g·L－1，是0 mA對照組菌液在同一生長時期的1.13倍，并高于同期的10 mA加電菌液.由此可見，10—25 mA電流強度可以適當提高大腸桿菌DH5α胞內(nèi)總蛋白含量，促進菌體生長.

2.3 微直流電場對大腸桿菌DH5α ATP酶活性的影響

細胞生長過程中伴隨有ATP等能量物質(zhì)的生成，而細胞ATP酶在細胞內(nèi)外物質(zhì)傳送，能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要作用，是維持細胞營養(yǎng)物質(zhì)濃度穩(wěn)定的重要酶類［8］，常用于表征細胞的代謝活力.為研究電極反應(yīng)對DH5α代謝活力的影響，監(jiān)測了細胞ATP酶活性的變化.結(jié)果如圖4所示，加電流25 mA的大腸桿菌DH5α在對數(shù)生長前期的ATP酶活性為5.21 μmol·mg－1·h－1，是0mA對照組菌液同期ATP酶活性的1.68倍;而其在對數(shù)生長后期的ATP酶活性為7.88 μmol·mg－1·h－1，是對照組菌液同期的1.57倍;在穩(wěn)定期，加25 mA電流的ATP酶活性則為0 mA對照組菌同期的1.31倍.由此可見，10—25 mA的電流強度可以增強DH5α的ATP酶活性，提高細菌的生長活性，其中對DH5α ATP酶活性提升效果最好的電流強度為25 mA.大腸桿菌DH5α在加入適宜的直流電時ATP酶活性增加的原因，可能是由于電場處理導致ATP酶的構(gòu)象發(fā)生改變.Tsong等報道了生物膜ATP酶能夠從規(guī)則的交變電場中吸收自由能并做功［14］.這表明ATP酶能夠從外加電場吸收能量，補充生理活動中作為生物膜離子泵功能所需的能量，促進代謝水平.

圖1 大腸桿菌DH5α在不同電流下的生長曲線Fig.1 Growth curves of DH5α under different current magnitude

圖2 大腸桿菌DH5α在不同電流下的pH曲線Fig.2 pH curves of DH5α under different current magnitude

圖3 微直流電場對大腸桿菌DH5α總蛋白含量的影響Fig.3 Protein concentration of DH5α in different DC electric fields

圖4 微直流電場對大腸桿菌DH5α ATP酶活性的影響Fig.4 ATPase Activity of DH5α in different DC electric fields

2.4 微直流電場對大腸桿菌DH5α生長形態(tài)的影響

進一步監(jiān)測細菌生長形態(tài)的變化過程，于20 h分別取出電解瓶和參照瓶中的細胞樣品，經(jīng)染色后，用透射電子顯微鏡(TEM)進行顯微觀察.如圖5所示，在25 mA微直流電場作用下的大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液，其菌體細胞表面形貌與對照組相比，形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然完整，且細菌形狀略有脹大(圖5A、B);在對細胞個體的TEM圖中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象(圖5C、D).這有可能是電場使得ATP酶活性增強，而一些ATP酶具有細胞膜上營養(yǎng)物質(zhì)運輸通道的功能，從而促進細胞膜上的營養(yǎng)物質(zhì)通道一定程度開放，胞外營養(yǎng)物質(zhì)輸入增多.

圖5 透射電鏡下受微直流電場作用細胞及參比樣細胞的表面形貌(A)大腸桿菌DH5α不加電(放大7000倍);(B)大腸桿菌DH5α加電25 mA(放大7000倍);(C)大腸桿菌DH5α不加電(放大30000倍);(D)大腸桿菌DH5α加電25 mA(放大30000倍)Fig.5 TEM micrograph of cells coped with and without DC electric field

2.5 大腸桿菌DH5α在直流電場刺激下的通透性

通過測定菌懸液離心后上清液中蛋白質(zhì)濃度的變化反映細菌通透性的變化.對液體培養(yǎng)基中蛋白含量的檢測表明，液體培養(yǎng)基本身含有的蛋白含量很少，對樣品中的蛋白質(zhì)檢測無明顯干擾.如圖6所示，加電10 mA和25mA菌液離心后上清液中蛋白質(zhì)濃度與對照組相比明顯升高，說明細菌分泌或運輸?shù)襟w外蛋白含量增多.

結(jié)合圖5可以看出，在所加入直流電場下，細菌形態(tài)完好，這說明外加適宜強度的直流電流可以在不損傷細菌細胞的情況下增強細胞膜通透性，提高細胞向胞外運輸物的量.這對于菌體內(nèi)外物質(zhì)交換及與此有關(guān)的細菌生長代謝過程具有積極意義.

有研究表明這些運輸物有可能是細菌代謝過程中分泌到細菌體外的胞外糖蛋白和酶類［15-16］.

2.6 大腸桿菌電化學循環(huán)伏安曲線測定

為了表征培養(yǎng)基的電化學特性，考察了LB培養(yǎng)基的循環(huán)伏安曲線.以鈦盤狀電極為工作電極，鉑網(wǎng)電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極構(gòu)成三電極體系，采用VMP多通道電化學工作站對滅菌后的新鮮培養(yǎng)基進行循環(huán)伏安實驗，掃速為200 mV·s－1，掃描范圍為－2 V到2 V.在此范圍內(nèi)主要存在3個電極反應(yīng)，陽極主要為析氧反應(yīng)(2H2O=O2+4H++4e－)，陰極主要為析氫反應(yīng)(2H2O+2e－=H2+2OH－)，此反應(yīng)分為兩步，第一步為水分子得電子形成吸附氫(H2O+M+e－=MH+OH－)，第二步為吸附氫脫附形成氫氣;以及析氫反應(yīng)所產(chǎn)生氫的氧化反應(yīng).

由圖7可以看出，大腸桿菌直流電刺激培養(yǎng)過程中，電極反應(yīng)主要為水電解的析氫反應(yīng)，電極反應(yīng)產(chǎn)物主要為H2、O2和吸附在電極上的活性H原子.活性H原子是一種很好的電子供體，能被附著在電極表面的微生物充分利用進行各種生理活動，能夠作為供氫體供細菌更好地生長.同時生成的氧氣對好氧菌的生長也有一定影響.

圖6 大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液上清液蛋白含量Fig.6 The protein concentration of DH5α solution supernant with different DC currents

圖7 大腸桿菌LB培養(yǎng)基用鈦電極掃描的循環(huán)伏安圖Fig.7 The CV curve of LB liquid medium on Ti electrode

3 結(jié)論

(1)在菌液中加適宜強度的電場，能促進大腸桿菌DH5α生長，增加DH5α細菌胞內(nèi)總蛋白含量，增強細菌ATP酶活性，提高菌株的代謝水平.

(2)外加適宜強度的直流電場可以在一定范圍內(nèi)不損傷細菌的情況下增強細胞膜通透性，提升細胞代謝活力，提高菌向胞外分泌物的量.

(3)對大腸桿菌DH5α直流電刺激培養(yǎng)過程中的循環(huán)伏安法分析表明，電極反應(yīng)主要為水電解反應(yīng).電解水產(chǎn)物為菌的有氧反應(yīng)和還原反應(yīng)提供更充足的O2、吸附氫和H2.電極反應(yīng)產(chǎn)物中的H2和原子態(tài)氫(H)能夠作為供氫體供細菌更好地生長.

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EFFECT OF DIRECT CURRENT ELECTRIC FIELD ON THE GROWTH AND METABOLISM OF ESCHERICHIA COLI

ZHOU Shengxue1MA Jie2

(1.College of Chemistry＆ Chemical Engineering，Ningxia Teachers'University，Guyuan，756000，China;2.Department of Chemistry，Capital Normal University，Beijing，100048，China)

Different direct currents were provided for Escherichia coli DH5α in liquid medium during the bacteria's continuous culture.The growth curve，pH value，ATPase activity and TEM micrograph of the bacterial cells were investigated.The results indicate that direct currents accelerated the multiplication of the bacteria，and 25 mA current promoted the ATPase activity of Escherichia coli DH5α，which is consistent with its TEM micrograph.

direct current electric field，metabolism，Escherichia coli，ATPase activity

2011年3月8日收稿.

*寧夏回族自治區(qū)自然科學基金(No.NZ10227)資助;寧夏師范學院科學研究基金(YB2010010)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，Tel:15825341361;E-mail:shengxuezhou@yahoo.com.cn