羊蹄蒽醌類成分的質(zhì)控方法研究

吳澤青，帥歐，陳地靈，林勵(lì)

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

質(zhì)量

羊蹄蒽醌類成分的質(zhì)控方法研究

吳澤青1，帥歐，陳地靈，林勵(lì)*

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

目的：建立羊蹄藥材中蒽醌類成分鑒別和含量測定方法，為羊蹄藥材質(zhì)量評價(jià)提供新依據(jù)。方法：采用薄層色譜法對羊蹄藥材進(jìn)行定性鑒別，超高速液相色譜法（UPLC）建立羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等成分的含量測定方法。結(jié)果：羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等成分的薄層鑒別特征明顯，UPLC法能快速地同時(shí)測定羊蹄中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量。結(jié)論：該方法具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，能準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速地對羊蹄藥材進(jìn)行鑒別和定量測定，可作為羊蹄藥材中蒽醌類成分的質(zhì)量控制方法。

羊蹄；蒽醌；薄層色譜法；超高速液相色譜法；含量測定

草藥羊蹄為蓼科酸模屬多年生草本植物羊蹄Rumex japonicusHoutt.的根，又名癬草、土大黃、金不換、牛舌條等，多分布于我國華東、華中、華南等地區(qū)，資源豐富。羊蹄味苦，性寒，有殺蟲、活血止血、清熱解毒等功效，用于治療皮膚病、疥癬、各種出血及各種炎癥[1]。羊蹄根中的主要化學(xué)成分為大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，具有止血和抗衰老等藥理活性[2-3]。目前尚未見有羊蹄藥材薄層同時(shí)鑒別和同時(shí)快速測定其大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類成分含量的報(bào)道。為進(jìn)一步提高羊蹄藥材的質(zhì)控水平，作者進(jìn)行了本項(xiàng)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DFT-200型手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、KQ-500型超聲儀（40 KHz，500 w，昆山市超聲儀器有限公司）、DHG-90553A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、Sartorius B P211D分析天平（d＝0.01 mg）、2μL定量毛細(xì)管、Waters Acquity UPLCTM超高速液相色譜儀-二極管陣列檢測器（PDA）、Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱 （2.1×50 mm，1.7μm）、Empower 2色譜工作站。

1.2 材料

羊蹄藥材購于廣東各大藥店、中藥飲片廠及藥材市場，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵(lì)研究員鑒定為蓼科酸模屬植物羊蹄Rumex japonicusHoutt.的根。大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：201007，201007，201003，純度≥98%）。HPLC級(jí)乙腈（默克公司生產(chǎn)），冰醋酸（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑廠），甲醇、石油醚、環(huán)己烷、甲酸乙酯、甲酸等試劑均為分析純，水為超純水，硅膠G板（青島海洋化工廠）。

2 薄層色譜

2.1 對照品溶液的制備

取大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇制成每1 mL含大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為1.35，1.27，1.42 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取羊蹄根藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，超聲提取45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.3 方法與結(jié)果

照《中國藥典》（2010版一部附錄VIB）試驗(yàn)薄層色譜法，吸取供試品溶液和對照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（1.5∶2.5∶1.5∶0.1）上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

3 含量測定

3.1 溶液制備

3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲(chǔ)備液濃度分別為0.037 4，0.077 0，0.046 6 mg·mL－1；分別精密量取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

圖1 羊蹄藥材TLC圖

3.1.2 供試品溶液的制備 按照2.2項(xiàng)下制備供試品溶液后，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；乙腈（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度條件為0～7min，40%A～65%A，流速0.3 mL·min－1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：1μL；柱溫：室溫。分別吸取對照品溶液、供試品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰與樣品中其他成分峰均能達(dá)到基線分離，見圖2。

3.3 UPLC方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取各濃度混合對照品溶液進(jìn)樣1μL，記錄色譜圖，測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程及線性范圍見表1。

3.3.2 精密度試驗(yàn) 在上述色譜條件下，精密吸取大黃素、大黃酚、大黃素甲醚濃度為0.014 96，0.030 80，0.018 64 mg·mL－1的混合對照品溶液連續(xù)測定6次，進(jìn)樣量為1μL，測定峰面積，結(jié)果大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.56%，0.74%，0.62%，表明精密度良好。

圖2 對照品及羊蹄藥材含量測定UPLC圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，取同一樣品溶液（批號(hào)20110320），分別于0，2，4，8，12，24 h測定，測得羊蹄藥材樣品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均含量分別為0.11%、0.17%、0.10%，RSD分別為0.69%、0.79%、1.19%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品（批號(hào)20110320）6份，按3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測得樣品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均含量分別為1.2，1.8，1.0 mg·g－1，RSD分別為0.75%、0.83%、0.64%，表明方法重現(xiàn)性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試樣品0.25 g（批號(hào)20110320）共6份，分別加入混合對照品溶液，按3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品，按3.2項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

3.4 樣品含量測定

分別取待測樣品，按3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在3.2項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)行樣品含量測定，結(jié)果見表3。

表2 大黃素、大黃酚、大黃素甲醚加樣回收率試驗(yàn)

表3 不同來源羊蹄藥材中蒽醌類成分含量/mg·g－1

4 討論

4.1 提取條件的選擇

供試品的制備方法考察了甲醇超聲、三氯甲烷回流提取、甲醇超聲后鹽酸水解等方法，經(jīng)試驗(yàn)供試品色譜中都能顯示3種成分的特征斑點(diǎn)，但甲醇超聲方法簡單快速，因此選擇甲醇超聲直接制備含量測定供試品溶液。

4.2 展開劑的選擇

經(jīng)考察石油醚-丙酮-甲醇-甲酸、石油醚-丙酮-苯、石油醚-環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸等體系展開劑效果，其中石油醚-環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（1.5∶2.5∶1.5∶0.1）上層液為展開劑時(shí)，斑點(diǎn)清晰，尤其對于大黃酚和大黃素甲醚的分離效果較好。

4.3 色譜條件的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道羊蹄藥材含量測定所用流動(dòng)相為甲醇-水-高氯酸、甲醇-磷酸水等[4-6]，經(jīng)過考察甲醇-水-高氯酸、甲醇-水、乙腈-冰乙酸及甲醇-磷酸水等體系流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)前3種流動(dòng)相均可達(dá)到較好的分離效果，甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)拖尾現(xiàn)象比較明顯，甲醇-磷酸水、乙腈-冰乙酸體系中磷酸、冰乙酸為中強(qiáng)酸和弱酸，相比于高氯酸酸性較低，對色譜柱損傷較小。

4.4 小結(jié)

羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等成分的薄層鑒別特征明顯。含量測定試驗(yàn)結(jié)果表明不同來源及產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等成分差異較大。6批次的測試樣品中大黃素的含量范圍在0.77～1.42 mg·g－1，大黃酚的含量范圍在1.23～1.83 mg·g－1，大黃素甲醚的含量范圍在0.71～1.84mg·g－1。HPLC法測定羊蹄藥材大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等成分含量所用時(shí)間較長，UPLC法相比于HPLC法分析效率高，分析速度快，并且減少有機(jī)溶劑的使用，達(dá)到更高的分析靈敏度。采用UPLC法測定羊蹄藥材中大黃酚、大黃素、大黃素甲醚的含量，方法學(xué)考察結(jié)果表明，該法線性關(guān)系良好，回收率、精密度高，重復(fù)性良好，具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，且分析效率高，可作為羊蹄藥材質(zhì)量控制與評價(jià)的方法之一。

[1]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志[M].第1冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：40-49.

[2]李淑娟，張力，張丹參，等.大黃酚抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國老年學(xué)雜志，2005，25（11）：1362-1364.

[3]孫曉如，周新新，朱荔，等.中藥羊蹄根抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)血管收縮活性成分的分離及藥理活性研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，19（6）：488-491.

[4]鄒劍成，邱小梅，王定勇.RP-HPLC法測定羊蹄根中大黃酚的含量[J].中藥材，2009，32（7）：1081-1083.

[5]王雪芹，趙祖興，陳吉炎，等.武當(dāng)山5種土大黃中3種蒽醌類成分的含量比較[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（9）：1206-1208.

[6]原源，陳萬生，張漢明，等.HPLC法測定酸模屬植物根中蒽醌類成分的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（10）：952-954.

Study on the Quality Control of Anthraquinones in Rumex japonicus Houtt.

WU Ze-qing，SHUAIOu，CHEN Di-ling，LIN Li

（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medcine，Guangzhou510006，China）

Objective：To establish the new methods that can identify and assay the anthraquinones ofRumex japonicusHoutt.while be used to evaluate the quality of theRumex japonicusHoutt..Methods：Thin layer chromatography（TLC）was used for the identification and UPLC was applied to assay the contents of emodin，chrysophanol and physcion ofRumex japonicusHoutt..Results：The characteristic of TLC was distinct.It showed that the UPLC can fast assay the contents of emodin，chrysophanol and physcion at one time.Conclusion：These methods can be used in qualitative identification and quantitative assay of the anthraquinones ofRumex japonicusHoutt.with good specificity，reproducibility and stability.

Rumex japonicusHoutt.；Anthraquinone；TLC；UPLC；Content determination

*林勵(lì)，Tel：（020）39358270，E-mail：LL76611＠yahoo.com.cn

2011-10-17）