油茶果殼鞣質(zhì)提取工藝及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029)

油茶果殼鞣質(zhì)提取工藝及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029)

目的:研究油茶果殼鞣質(zhì)的提取工藝及降血糖功能。方法:以紫外分光光度法測(cè)定含量，采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化油茶果殼中鞣質(zhì)的提取工藝。油茶果殼鞣質(zhì)制備后，以400mg/(kg·d)的劑量灌胃。結(jié)果:確定優(yōu)化工藝為:超聲輔助提取80min，固液比1∶20，乙醇濃度50%，油茶果殼中鞣質(zhì)含量為6.75%。油茶果殼鞣質(zhì)可明顯降低糖尿病小鼠空腹血糖。結(jié)論:優(yōu)化工藝條件可以有效提取油茶果殼中的鞣質(zhì)，工藝操作簡(jiǎn)單合理。油茶果殼鞣質(zhì)是潛在的降糖功能因子。

油茶果殼，鞣質(zhì)，提取工藝，降血糖

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果殼 品種為普通白花油茶，取自浙江省常山縣芳村鎮(zhèn);沒(méi)食子酸對(duì)照品、鎢酸鈉 AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鉬酸鈉 AR，合肥科華精細(xì)化工研究所;硫酸鋰 99%，上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)工廠;無(wú)水碳酸鈉 AR，太倉(cāng)美達(dá)試劑有限公司;干酪素 杭州微生物試劑有限公司;磷酸 ≥85%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸 AR，蘭溪市六洞山化工試劑廠;無(wú)水乙醇 AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水 均為蒸餾水;ICR小鼠 60只，雄性，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(浙)2007-0029;阿卡波糖 規(guī)格50mg/片，批號(hào):091023，拜耳醫(yī)藥保健有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒 葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法，批號(hào)20091216，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

5424離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf股份公司; Varioskan Flash酶標(biāo)儀 Thermo公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司;SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;BS124S萬(wàn)分之一天平 Sartorius公司; KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電動(dòng)粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶果殼鞣質(zhì)提取的步驟 油茶果殼→曬干→粉碎→溶劑浸泡→超聲波輔助提取→抽濾→定容→定量分析

1.2.2 鞣質(zhì)含量測(cè)定［11-12］

1.2.2.1 溶液的制備 磷鉬鎢酸試液:取鎢酸鈉100g和鉬酸鈉25g，加水700mL使之溶解，加鹽酸100mL和磷酸50mL，加熱回流10h，加硫酸鋰150g，水50mL和溴數(shù)滴，煮沸除去過(guò)多的溴(溶液由棕紅色漸變?yōu)辄S色)，放冷，加水稀釋至1000mL，過(guò)濾。

29%碳酸鈉試液:準(zhǔn)確稱取145g碳酸鈉，加蒸餾水定容至500mL容量瓶中。

對(duì)照品溶液:精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品50mg，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置于50mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得0.05mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于25mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加入水11.5、11.0、10.5、10.0、9.0、8.0、7.0mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外分光光度法在760nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=102.17X-0.1199，R2=0.9997(n=6)，在0.01～0.001mg/mL范圍線性關(guān)系良好。

1.2.2.3 供試品溶液制備 準(zhǔn)確稱取油茶果殼粉10.0g于250mL三角燒瓶中，按料液比加入一定量的乙醇，采用超聲波輔助萃取不同時(shí)間后，趁熱減壓抽濾，用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至250mL容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.2.4 樣品含量測(cè)定 總酚量:精密吸取供試品溶液20mL，至100mL棕色容量瓶中，得待測(cè)液。精密吸取待測(cè)液0.5mL，按照1.2.2.2項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品中沒(méi)食子酸的量(mg)，計(jì)算，即得。

不被吸附的多酚量:精密量取待測(cè)液25mL，加至已盛有干酪素0.6g的100mL具塞錐形瓶中，密塞，至30℃水浴中保溫1h，時(shí)時(shí)振搖。取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，精密吸取濾液2mL，置25mL棕色量瓶中，按照1.2.2.2項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品中沒(méi)食子酸的量(mg)，計(jì)算，即得。

含量計(jì)算:鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量

油茶果殼鞣質(zhì)含量計(jì)算公式:

式中:R為油茶果殼鞣質(zhì)的含量(%)，C為根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出的所測(cè)樣品沒(méi)食子酸的濃度(mg/mL)，V為樣品體積(mL)，K為稀釋倍數(shù)，W為油茶果殼粉質(zhì)量(mg)

1.2.3 提取工藝研究 以乙醇為溶劑采用超聲波輔助法提取油茶果殼中的鞣質(zhì)，影響鞣質(zhì)含量的主要因素包括乙醇濃度、超聲提取時(shí)間和乙醇用量。為了得到優(yōu)化的工藝參數(shù)，采用L9(33)的正交實(shí)驗(yàn)表，在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 提取參數(shù)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 降血糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 油茶果殼鞣質(zhì)制備 油茶果殼在優(yōu)化工藝條件下經(jīng)超聲波輔助提取后，噴霧干燥，得到油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)。

1.2.4.2 糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)［13-15］ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后禁食(不禁水)8h，鏈尿佐菌素150mg/kg腹腔注射，注射容積0.1mL/10g，7d后禁食12h，剪尾取血測(cè)空腹血糖，根據(jù)血糖值隨機(jī)分為3組，分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(阿卡波糖300mg/kg)、油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)組(400mg/kg)，每組動(dòng)物數(shù)6只。每天定時(shí)灌胃給藥，給藥容積0.1mL/10g，連續(xù)給藥8d后，禁食(不禁水)12h，末次給藥1h后剪尾取血，離心分離血清，測(cè)空腹血糖。隔日進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，小鼠禁食(不禁水)12h，末次給藥1h后測(cè)空腹血糖，再灌胃給予葡萄糖2g/kg，分別于給葡萄糖后0.5、1、2h剪尾取血，離心分離血清，測(cè)血糖值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝研究結(jié)果

超聲波提取在天然產(chǎn)物有效成分提取方面有著突出的作用［16］。超聲波能有效地打破細(xì)胞邊界層，使擴(kuò)散速度增加，提高破碎速度，從而縮短了破碎時(shí)間，可顯著提高提取率。同時(shí)在浸提過(guò)程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不破壞所提取生物活性物質(zhì)的相關(guān)活性。

實(shí)驗(yàn)以油茶果殼鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，其值越高越好。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析可得，各因素的主次順序?yàn)?提取時(shí)間＞固液比＞乙醇濃度。優(yōu)化的工藝條件組合為:A3B2C3，即超聲輔助提取80min，乙醇濃度50%，固液比1∶20。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，在這一條件下油茶果殼鞣質(zhì)的含量可達(dá)6.75%±0.04%。

表4 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響(s)

表4 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響(s)

注:*表示與模型組比較p＜0.05，＊＊表示與模型組比較p＜0.01。

組別 血糖值(mmol/L) 0 30min 1h 2h AUC (mmol/L·min) 抑制率(%) 445.0±237.1 -阿卡波糖 4.62±3.13＊＊ 12.32±4.39* 3.87±3.09 1.65±3.50* 662.3±391.9* 54.17 CPT 11.75±7.07 18.37±7.01 8.27±5.93 6.58±8.模型組 15.64±2.97 19.80±2.30 7.78±2.97 8.89±4.33 1 33 1267.7±761.8 12.27

表2 油茶果殼超聲提取工藝參數(shù)正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果的極差分析

2.2 降血糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組與油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)組空腹血糖值均有明顯的降低，并有顯著性差異(p＜0.01)，血糖下降百分率分別為65.1%和38.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響(s)

表3 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響(s)

注:＊＊表示與模型組比較p＜0.01。

組別 血糖值(mmol/L)血糖下降給藥前 給藥后 百分率(%)模型組26.21±5.41 23.18±4.37 11 19.44±5.55 6.34±3.4465.1 38.5阿卡波糖 ＊＊CPT 19.77±6.34 13.37±3.31＊＊

2.2.2 油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)對(duì)鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組0、0.5、2h時(shí)刻點(diǎn)的血糖值有明顯降低，并有顯著性差異(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)，油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)組的降糖作用不明顯。曲線下面積(AUC)，陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組較模型組有降低，并有顯著性差異(p＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組與油茶果殼鞣質(zhì)粗提物(CPT)抑制率分別為54.17%和12.27%，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)油茶果殼鞣質(zhì)的超聲波輔助提取方法及工藝的研究，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)果得出以油茶果殼鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，影響其值高低的各因素按主次順序依次為:提取時(shí)間＞固液比＞乙醇濃度，并且得到了一組優(yōu)化的工藝參數(shù):超聲輔助提取80min，固液比1∶20，乙醇濃度50%。

本實(shí)驗(yàn)研究了油茶果殼鞣質(zhì)粗提物的降血糖作用，初步結(jié)果顯示:油茶果殼鞣質(zhì)粗提物能降低鏈尿佐菌素糖尿病小鼠的血糖值，與模型組相比，有顯著性差異。但對(duì)葡萄糖糖耐量的作用不明顯。分析其原因可能是鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)較為特殊，其作用特點(diǎn)一方面是通過(guò)與消化道內(nèi)的許多酶作用，特別是對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制［17］，從而調(diào)控了機(jī)體對(duì)葡萄糖等成分的吸收，起到降低血糖的作用;另一方面可能通過(guò)調(diào)控體內(nèi)6-磷酸葡萄糖激酶、蛋白酪氨酸磷酸酯酶、琥珀酸脫氫酶等的活性，加快血液中葡萄糖的利用。油茶果殼鞣質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)及其降糖的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on extraction process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and hypoglycemic effect

DAI Tian-tian，SHEN Jian-fu*
(College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:To determine the optimized extracting process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and study its hypoglycemic effect.Method:Ultraviolet spectrophotometry was used for assay，optimized extraction conditions were adopted by using ultrasonic parameters orthogonal tests.The tannin exreacted from the shell of Camellia oleifera Abel.was given to mice at the dose of 400mg/(kg·d)(ig)and the effect on blood glucose was observed.Results:The optimized extraction conditions were 50%ethanol extracting in 20times solution for 80min.The tannin contect in the shell of Camellia oleifero Abel.was 6.75%.The fasting serum glucose in diabetic mice was reduced significantly.Conclusion:The optimized extraction process could extract the tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.efficiently and the extraction technology was simple and reasonable.It’s a protential factor for decreasing bloodsugar.

shell of Camellia oleifera Abel.;tannin;extraction technology;hypoglycemic effect

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0255-04

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，目前全國(guó)種植面積約為400萬(wàn)hm2，主要分布在湖南、江西、廣西、浙江、福建、安徽和貴州等地。我國(guó)對(duì)油茶的利用主要集中在將油茶籽進(jìn)行榨油，油茶籽粕提取皂素等，而占油茶果總重量近60%的油茶果殼基本被廢棄或焚燒處理，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。前期報(bào)道指出，油茶果殼含有大量的木質(zhì)素、多縮戊糖、蛋白質(zhì)和皂素等化學(xué)成分［1］，可以用來(lái)生產(chǎn)栲膠、糠醛、木糖醇、活性炭等，并且油茶果殼的提取物有很強(qiáng)的抗氧化能力。鈕炎星等的研究也表明油茶果皮含有大量的鞣質(zhì)和皂苷類成分(《中國(guó)糧食學(xué)會(huì)油脂專業(yè)分會(huì)第十四屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文選集》)。近年來(lái)，鞣質(zhì)類化合物作為一類新的活性物質(zhì)，其研究日益受到人們的重視。這主要是由于其具有多方面的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗脂質(zhì)過(guò)氧化［2-7］等作用。鞣質(zhì)中表現(xiàn)化學(xué)及生理活性的主要活性基團(tuán)是多酚羥基結(jié)構(gòu)及其沒(méi)食子酰［8］?？伤怊焚|(zhì)的活性依據(jù)沒(méi)食子?；騂HDP基的數(shù)量增多而增強(qiáng)，縮合鞣質(zhì)則依據(jù)縮合程度的提高而增強(qiáng)。約有70%以上的中草藥中含有鞣質(zhì)類化合物。經(jīng)毒理及藥效學(xué)研究結(jié)果表示，此類化合物具有明顯的抗炎、止痛、止血、抗突變等功效，并且具有低毒、安全的特點(diǎn)，因此具有良好的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值［9］。沈忠明［10］研究了虎杖鞣質(zhì)對(duì)小鼠的降血糖作用，在同等劑量(100mg/(kg·d))條件下，虎杖鞣質(zhì)可使小鼠血糖降至6.85mmol/L，低于拜糖平(8.32mmol/L)。

2010-09-13 *通訊聯(lián)系人

戴甜甜(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:油茶副產(chǎn)物的加工利用。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30872056)。