菠蘿皮渣生產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件研究

楊 瑞，翟海瑞，楊勁松

(海南大學食品學院，海南?？?70228)

菠蘿皮渣生產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件研究

楊 瑞，翟海瑞，楊勁松*

(海南大學食品學院，海南?？?70228)

以菠蘿皮渣為培養(yǎng)基的主要原料，采用法夫酵母(Phaffia rhodozyma)對其進行發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，采用響應面分析法對法夫酵母的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究。先用Plackett-Burman設計法實驗確定重要因素，再用最陡爬坡實驗法確定因素水平，最后用響應面分析方法求得的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%，酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h。用此優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母，蝦青素產(chǎn)量可達6.5751mg/L。

蝦青素，法夫酵母，菠蘿皮，響應面分析法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 本研究室保藏并通過誘變選育獲得;菠蘿皮 從市場取得;菌種保藏培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10、麥芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3、瓊脂20，pH5.0;液體種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10、芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3，pH5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 將菠蘿渣沖洗干凈后用榨汁機壓榨，過濾，用葡萄糖調至所需糖度，以上培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min;麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，生化試劑;葡萄糖、二甲基亞砜、丙酮 廣州化學試劑廠，分析純。

表2 Plackett-Burman實驗設計表及實驗結果

SHZ-95DF全溫振蕩器 金壇市大地自動化儀器廠;UV-1100紫外可見分光光度計 上海密通機電科技有限公司;80-2型離心沉淀器 上海手術器械廠;HSR025型人工氣候箱 南京實驗儀器廠; LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠;WYT手持糖量計 成都市青羊聯(lián)合光學儀器成套部。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)方法 取活化好的菌種接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中，轉速170r/min，溫度21.5℃，培養(yǎng)時間48h。

1.2.2 發(fā)酵方法 在500mL的三角瓶中裝入50mL培養(yǎng)液，接種量10%，轉速170r/min，溫度21.5℃，培養(yǎng)時間96h。

1.2.3 蝦青素提取及測定［10］改進二甲基亞砜法。發(fā)酵液經(jīng)離心洗滌，加入55℃預熱的二甲基亞砜溶液5mL，55.0℃水浴15min，再加入4mL丙酮溶液進行提取，離心，收集上清液，以二甲基亞砜與丙酮混合液(體積比5∶4)為空白，于480nm波長下測定上清液吸光度。按下式分別計算單位體積發(fā)酵液的蝦青素產(chǎn)量:

式中:Va為萃取液體積(mL);A480為480nm波長下的吸光度;E為比消光系數(shù)，取值2150;Vb為發(fā)酵液取樣體積(mL)。

1.2.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 Plackett-Burman實驗設計法篩選重要因素

Plackett-Burman是一種兩水平的實驗設計方法，它可以用最少的實驗次數(shù)達到使因素的主效應得到盡可能精確的估計，從眾多考察因素中快速的篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用。每個因素的兩水平分別取低水平與高水平，高水平約低水平的1.25倍。

本實驗以蝦青素的產(chǎn)量作為響應值，選擇培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件中的8個因素作為考察對象，即糖度、酵母膏、MgSO4、種齡、(NH4)2SO4、初始pH、KH2PO4、發(fā)酵溫度。采用實驗次數(shù)N=12的Plackett -Burman實驗設計方案。

1.2.4.2 應用最陡爬坡實驗法確定因素水平 由Plackett-Burman實驗可知，發(fā)酵溫度、初始pH、糖度這3個因素對法夫酵母的生長有重要的影響，糖度為正效應，應增加;發(fā)酵溫度和初始pH為負效應，應減小。根據(jù)這3個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗。

1.2.4.3 響應面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基 根據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗結果，確定對蝦青素產(chǎn)量影響顯著的3個因素:發(fā)酵溫度、初始pH、糖度。并確定接近最大響應值區(qū)域的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度的取值。采用中心組合設計對這些因素進行進一步的優(yōu)化。因素水平選取見表1。

表1 中心組合實驗設計實驗因素水平及編碼表

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗設計法篩選重要因素

實驗結果采用Minitab15軟件進行各因素主效應分析，結果見表2和表3。

表3 Plackett-Burman實驗回歸分析表

由表3可知，發(fā)酵溫度、糖度和初始pH是主要的影響因素，其可信度分別為99.6%、95.8%、94.6%。其中糖度為正效應，應增加;發(fā)酵溫度和初始pH為負效應，應減小。其它5個因素，酵母膏、MgSO4、種齡、(NH4)2SO4、KH2PO4的重要性相對較小一些，由此確定發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素進行下一步實驗。在后續(xù)的實驗中將對這三個因素做進一步的優(yōu)化。其余各因素的效應如下:酵母膏、MgSO4、種齡和(NH4)2SO4正效應，取高水平;KH2PO4為負效應，取低水平。因此在后續(xù)實驗中，除上述三個顯著因素外，其它各因素的水平調整如下:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h，且在后續(xù)實驗中將不再改變。

2.2 最陡爬坡實驗

Plackett-Burman實驗回歸分析確定發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素，由此設計最速上升實驗:減少發(fā)酵溫度、初始pH，分別每次減少2.0℃、0.4，糖度每次增加0.5%，其它因素水平為PB實驗調整后的值。考察發(fā)酵液蝦青素含量的變化趨勢，逼進最大響應區(qū)域。實驗設計及結果見表4。

表4 最速上升實驗設計及結果

由表4可知，隨發(fā)酵溫度、初始pH的下降和糖度的上升，蝦青素產(chǎn)量變化趨勢為先上升后下降，3號發(fā)酵瓶中的色素產(chǎn)量達到最大值。該處理的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度用于下面的優(yōu)化實驗。

2.3 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

由Plackett-Burman實驗選出發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素，進而由最陡爬坡實驗確定接近最大響應值區(qū)域的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度的取值。最后采用響應面分析法對發(fā)酵溫度、初始pH和糖度進行優(yōu)化。實驗設計采用中心組合設計(CCD)，實驗設計及結果見表5。

表5 中心組合實驗設計及其實驗結果

表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計值

表7 回歸方程的方差分析

回歸方程的 R2=0.9337，表明模型能解釋93.37%蝦青素素產(chǎn)量的變化，該模型的擬合效果較好，基本上可以用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。利用軟件可得到其響應面分析圖，見圖1～圖3。

圖1 溫度與pH交互作用對蝦青素產(chǎn)量的影響

圖2 溫度與糖度交互作用對蝦青素產(chǎn)量的影響

由回歸方程即可計算得到三個因素的最佳組合，最終確定培養(yǎng)基優(yōu)化后的最優(yōu)組合為:發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%，蝦青素預測產(chǎn)量Y=6.5925mg/L。

2.4 驗證實驗

為了確定建立的模型與實驗結果是否相符，通過作進一步實驗對模型的可靠性進行驗證，以發(fā)酵溫度為20.0℃、初始pH為5.29、糖度為6.1%、酵母膏 2g/L、MgSO42g/L、(NH4)2SO44g/L、KH2PO41.5g/L、種齡36h進行重復搖瓶實驗，蝦青素產(chǎn)量從4.8125mg/L提高到6.5751mg/L。預測值與實驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性。

圖3 pH與糖度交互作用對蝦青素產(chǎn)量的影響

3 結論

研究結果表明，在法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的過程中，發(fā)酵溫度、初始pH、糖度對蝦青素的提高起著重要作用，其參數(shù)分別為發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%。其他工藝參數(shù)分別為:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h;在上述條件下發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素最高值可達6.5751mg/L，比未優(yōu)化前的產(chǎn)值4.8125mg/L提高了13.7%。

［1］Meyers S P.Developments and in world aquaculture feed formulations and role of carotenoids［J］.Pure＆ Appl Chem，1994，66:1069-1076.

［2］Schiedt K，Bischof S，G1inz E.Recent progress on carotenoid metabo1ism in animal［J］.Pore Appl Chem，1991，63:89-100.

［3］楊勁松.果蔬汁發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的研究［J］.中國食品學報，2006，6(2):29-35.

［4］Guerin M，Huntleym E，OlaizolaM.Haematococcus astaxanthin:applications for human health and nutrition［J］. Trends in Biotechnology，2003，21(5):210-216.

［5］楊勁松，唐天健，林伏榮，等.蝦青素高產(chǎn)菌株的選育［J］.激光生物學報，2002，11(6):438-439.

［6］朱曉立，裘暉，鄧毛程，等.紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(2):61-64.

［7］J M Cruz.Improved astaxanthin production by Phaffia Rhodozyma growing on enzymatic wood hydrolysates containing glucose and cellobiose［J］.Food Chemistry，1998，63:479-484.

［8］Kesava S S，An G H，Kim G H，et al.An industrial medium for improved production of carotenoids from a mutant strain of Phaffia rhodozyma［J］.Bioprocess Eng，1998，19:165-170.

［9］Florencio J A，Soccol C R，F(xiàn)urlanetto L F，et al.A Factorial approach for a sugarcane juice-based low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by the red yeast Phaffia rhodozyma［J］.Bioprocess Eng，1998，19:16l-164.

［10］杜似鵑，梅艷珍，胡耀輝，等.紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)條件研究［J］.食品科學，2008，29(8):441-444.

Fermentation conditions optimization of the astaxanthin production for pineapple peel by Phaffia rhodozyma

YANG Rui，ZHAI Hai-rui，YANG Jin-song*
(College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China)

Pineapple peel as main raw material was fermented with Phaffia rhodozyma to produce astaxanthin. Response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions for astaxanthin production.First，used Plackett-Burman design to select the most important fermentation conditions which affecting the growth of Phaffia rhodozyma.Then，the steepest ascent was used to approach region of the fermentation conditions.The optimal fermentation conditions were determined by a central composite design and response surface analysis. And the optimal conditions follows:temperature 20.0℃，initial pH 5.29，sugar content 6.1%，yeast extract 2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，seed age 36h.Using the optimal fermentation conditions to culture Phaffia rhodozyma，the yield of astaxanthin could be up to 6.5751mg/L.

astaxanthin;Phaffia rhodozyma;pineapple peel;response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0261-04

蝦青素(Astaxanthin)是一種天然類胡蘿卜素，主要存在于水生動物、藻類、酵母、細菌等生物類群中。在動物體內，蝦青素具有特殊的著色功能，可以使蝦殼和家禽的表皮及卵黃著色，使其色澤鮮艷［1-2］，最初作為色素而被用作水產(chǎn)業(yè)的餌料添加劑。近幾年的研究表明，蝦青素具有較強的抗氧化、清除自由基、增強宿主免疫力等功能，因此在飼料、食品、化妝品及醫(yī)藥等領域有廣闊的應用前景［3-4］。法夫酵母是一種產(chǎn)蝦青素的酵母，它具有生長速度快、發(fā)酵周期短、能利用大多數(shù)糖、可在發(fā)酵罐中實現(xiàn)高密度培養(yǎng)等特點，是一種極具產(chǎn)業(yè)化前景的天然類胡蘿卜素資源。但由于原始分離的法夫酵母蝦青素產(chǎn)量水平不高，要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)必須設法提高產(chǎn)量。楊勁松等對法夫酵母菌株進行復合誘變，將蝦青素產(chǎn)量提高到7.26mg/L［5］。朱曉立等通過對法夫酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化使蝦青素產(chǎn)量達到15.28mg/L［6］。另外，選用有效、價廉易得的發(fā)酵底物也是降低成本的一個重要方面，如以桉樹木水解液［7］、谷物水解物［8］、甘蔗汁［9］為發(fā)酵底物已有報道。菠蘿果實加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物—果皮渣，菠蘿皮渣中含有糖分、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質，能夠為法夫酵母生長提供一定的營養(yǎng)成分。本研究以菠蘿皮渣的汁為主要原料，研究其最優(yōu)培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件，在提高產(chǎn)品附加值的同時還可以保護環(huán)境。

2010-08-30 *通訊聯(lián)系人

楊瑞(1984-)，女，在讀碩士，研究方向:食品科學與工程、應用微生物。

國家科技計劃支撐項目(2007BAD76B04)。