鈰代替鉛電鏡酶組織化學(xué)顯示培養(yǎng)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 TMP活性

劉冬娟 徐彥平 石玉秀

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電子顯微學(xué)研究室,沈陽 110001)

鈰代替鉛電鏡酶組織化學(xué)顯示培養(yǎng)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 TMP活性

劉冬娟 徐彥平 石玉秀＊

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電子顯微學(xué)研究室,沈陽 110001)

目的 探討鈰法顯示脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元初代培養(yǎng)細(xì)胞的 TMP(三偏磷酸酶)活性。方法 應(yīng)用電鏡酶組化技術(shù),以鈰作為捕捉劑代替常規(guī)以鉛作為捕捉劑來檢測觀察脊神經(jīng)節(jié)初代培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)溶酶體的 TMP活性。結(jié)果 脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元初代培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)存在 TMP陽性的溶酶體,其 TMP陽性反應(yīng)顆粒較常規(guī)以鉛作為捕捉劑來顯示溶酶體不僅孵育液充分溶解呈清亮透明,電鏡下反應(yīng)產(chǎn)物顆粒也微細(xì)均勻,而且避免了反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散及非特異性沉淀。結(jié)論 以鈰作為捕捉劑來檢測溶酶體的 TMP活性用于電鏡下觀察,其方法穩(wěn)定、易行,是一種能很好顯示溶酶體標(biāo)記酶的電鏡酶組化技術(shù)方法。

鈰; 脊神經(jīng)節(jié); 神經(jīng)元; 三偏磷酸酶; 電鏡組織化學(xué)

酶組織化學(xué)具有將形態(tài)學(xué)、生化學(xué)或生理學(xué)聯(lián)系起來的獨(dú)特特點(diǎn),在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域日益發(fā)揮著重要的作用。它是利用酶化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物,在顯微鏡下被識(shí)別,借以從形態(tài)學(xué)角度判定酶在組織細(xì)胞內(nèi)的存在和部位[1]。目前在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上能夠定位的酶約有80多種,用鉛法檢測酶的活性還是比較常用的方法。而用鋇、鈷、鍶及鈰代替鉛的方法也有報(bào)告[1],并且應(yīng)用在檢測部分酶的活性上。三偏磷酸酶 (thiamine monophosphatase,TMP)作為溶酶體的標(biāo)志酶,是溶酶體的蛋白水解酶[2],其活性變化直接體現(xiàn)溶酶體的功能狀態(tài)[3]。鈰法能否在脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元初代培養(yǎng)細(xì)胞中檢測出溶酶體的TMP活性?目前還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電鏡酶組化技術(shù),以鈰作為捕捉劑來檢測觀察脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元初代培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)溶酶體的 TMP活性,以及溶酶體的形態(tài)和分布,進(jìn)而為應(yīng)用電鏡酶組化技術(shù),研究溶酶體的細(xì)胞生物學(xué)特性提供新的方法。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供出生12h內(nèi)的 Wistar大鼠,雌雄兼用。取胎鼠4只,超凈臺(tái)下無菌操作,摘取脊神經(jīng)節(jié)浸泡于 Hanks液中,剪碎脊神經(jīng)節(jié)至1mm3大小,吸入離心管中;加入20-30倍的0.25%胰酶37℃下消化30min;加入胎牛血清 1滴終止消化,1000rpm/min離心10min;棄上清加入DMEM 至 10ml,吹打過濾,濾液為脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的單細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定所得細(xì)胞活性后,將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml,種植在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的內(nèi)置ACLAR膜(聚苯乙烯薄膜)的6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2ml,37℃下5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中孵育;48h后每孔用DMEM 1/2量換液,即換入DMEM 1ml,同時(shí)每孔加入阿糖胞苷16μg,以抑制非神經(jīng)元的過度增殖。然后每2d換液1次,每孔換2/3量的DMEM。

2.TMP染色及電鏡標(biāo)本制備

將培養(yǎng)7d的使用聚苯乙烯薄膜(ACLAR)細(xì)胞觀察存活后從培養(yǎng)孔內(nèi)取出,用0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(PH7.4)配制含4%多聚甲醛和0.25%戊二醛的固定液固定1h,經(jīng)0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗1h。置于下述孵育液中,孵育液配方:0.05mol/L 醋酸緩沖液 20ml(p H3.9)、氯化鈰35.405mg(用 4 ml DH2O 調(diào)制)、三偏磷酸酶15.29g、蔗糖 2.5g、TritonX-100 0.000075 ml、DH2O 26 ml、總量為 50 ml最終 p H3.9,室溫孵育 80 min。對(duì)照組則加入去除底物三偏磷酸酶的反應(yīng)液,同樣反應(yīng)。用0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗2次,經(jīng)1%鋨酸固定30 min,酒精、丙酮梯度脫水,Epon812浸透并在ACLAR膜上原位倒扣包埋,聚合后剝離ACLAR膜,在解剖顯微鏡下進(jìn)行脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元定位、修塊,超薄切片厚度70nm,經(jīng)醋酸鈾染色,J EM-1200EX透射電鏡下觀察、拍片。

結(jié) 果

透射電鏡下TMP陽性反應(yīng)產(chǎn)物為高電子密度的黑色磷酸鈰鹽細(xì)小顆粒沉淀,分布于脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的圓形溶酶體和線狀溶酶體上。TMP反應(yīng)產(chǎn)物顆粒均勻、微細(xì),末見擴(kuò)散及非特異性沉淀(圖1),細(xì)胞核呈陰性。而用鉛作捕捉劑顯示脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)溶酶體的 TMP活性陽性反應(yīng)產(chǎn)物顆粒較粗大(圖2),并見有非特異反應(yīng)產(chǎn)物的遮隱,有的核被染色。對(duì)照組脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)溶酶體上未見 TMP活性陽性反應(yīng)物顆粒,呈陰性反應(yīng)(圖 3)。

討 論

酶組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是通過酶的特異組織化學(xué)反應(yīng)顯示酶在細(xì)胞內(nèi)定位,它已成為細(xì)胞的物質(zhì)交換、神經(jīng)傳導(dǎo)、信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、激素作用、細(xì)胞識(shí)別、免疫、藥物治療、癌變機(jī)理等方面分子水平上結(jié)構(gòu)和功能研究的重要手段之一。在電鏡水平上顯示酶的組織化學(xué)方法都是以孵育階段為中心,在所有的水解酶組織化學(xué)技術(shù)中,孵育液中都含有酶的底物和捕捉劑。常用的捕捉劑有鉛、鈷等,Saito等、Rechardt和 Hervonen報(bào)告了用鈰作為捕捉劑的檢測方法[1],并且已經(jīng)用在了檢測5-核苷酸的活性上。顯示磷酸酶的捕捉因子,一直常用鉛鹽,但它有孵育液配制易混濁或非特異性染色等缺點(diǎn),會(huì)使酶活性的確認(rèn)發(fā)生困難。為了改善這種狀況,我們嘗試用氯化鈰代替了鉛鹽作為捕捉劑,在 TMP酶活性檢測上,獲得了很好的效果。TMP是溶酶體的蛋白水解酶[2],可用來顯示溶酶體。

溶酶體是一種形態(tài)可變的細(xì)胞器,內(nèi)含70多種水解酶,在細(xì)胞內(nèi)可以移動(dòng)、變形,參與細(xì)胞的自身吞噬和異體吞噬,是細(xì)胞的消化器[4]。1973年Backley[5]首先發(fā)現(xiàn)呈酸性磷酸酶陽性的管狀結(jié)構(gòu)沿細(xì)胞的邊緣存在,稱其為線狀溶酶體。溶酶體的存在有兩種形式,即線狀溶酶體(nematolysosome,NL Y)和圓形溶酶體(spherical lysosome,SL Y)[6]。NL Y和SL Y的形態(tài)可以相互轉(zhuǎn)換,共同參與細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。用 TMP來顯示溶酶體,其組織化學(xué)反應(yīng)原理為:TMP以三偏磷酸鈉為水解底物,在p H4左右的條件下三偏磷酸鈉被 TMP水解并釋放出磷酸,后者與捕捉劑氯化鈰的Ce3+直接捕獲形成CePO4沉淀,既最終反應(yīng)產(chǎn)物。將孵育液中的Pb2+換成Ce3+,其孵育液比較穩(wěn)定,不會(huì)出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,結(jié)果在脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元初代培養(yǎng)細(xì)胞的線狀溶酶體和圓形溶酶體上,得到了均勻的富有連續(xù)性的 TMP反應(yīng)產(chǎn)物。其 TMP陽性反應(yīng)產(chǎn)物為呈高電子密度的微細(xì)顆粒,而且反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散及非特異性沉淀都極少。

以鈰作為捕捉劑來檢測溶酶體的 TMP活性用于電鏡下觀察,不僅提高了檢測的敏感性,還能比較準(zhǔn)確地判定其活性部位。其方法穩(wěn)定、易行,是一種能很好顯示溶酶體標(biāo)記酶的電鏡酶組化技術(shù)方法。與用鉛作捕捉劑顯示TMP活性相比較陽性反應(yīng)產(chǎn)物更為微細(xì),同時(shí)也減少了非特異反應(yīng)產(chǎn)物的遮隱,很少有核染色。值得注意的是在配制孵育液時(shí),首先所用器皿一定要雙蒸水沖洗潔凈,試劑要按順序依次加入,必須在前一種完全溶解后方可加入第二種,這樣配制的孵育液最終能清徹透明,短暫放置亦不會(huì)變混濁。

[1]小川和郎,中根一穗.酶組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù),上海,上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1989:1-153

[2]Doty S B,Smith C E,Hand AR,et al.Inorganic trimetaphosphatase as a histochemical marker for lysosomes in light and electron microscopy.J Histochem Cytochem,1977,25(12):1381-1384

[3]丁春蘭,韓芳,石玉秀.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡及三偏磷酸酶活性的變化.解剖學(xué)雜志,2009,32(1):19-22

[4]沈雪莉,商秀麗,石玉秀.神經(jīng)干細(xì)胞定向分化過程中溶酶體表達(dá)變化的研究.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(6):691-694

[5]Backley IK.The lysosome of cultured chick embryo cells:a correlated light and electron microscopic study.Lab Invest,1973,29(4):411-421

[6]王春芳,石玉秀,榮明.電鏡觀察脊髓神經(jīng)元溶酶體的形態(tài)及影響因素.解剖科學(xué)進(jìn)展,2003,9(2):109-112

圖 版 說 明

圖1 鈰法顯示培養(yǎng)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體 TMP呈陽性分布反應(yīng)產(chǎn)物顆粒均勻、微細(xì),細(xì)胞核呈陰性?！?8000

圖2 鉛法顯示培養(yǎng)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體 TMP呈陽性分布反應(yīng)產(chǎn)物顆粒較粗大,胞質(zhì)內(nèi)有擴(kuò)散的顆粒?！?8000

圖3 對(duì)照組培養(yǎng)脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體 TMP呈陰性反應(yīng)?！?2000

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Cerium method showed in the lysosomes of the spinal ganglion cell fine and homogenously distributed TMP positive reaction particles,the nucleaus(Nu)was negative. ×18500

Fig.2 Lead method showed in the lysosomes of the spinal ganglion cell relatively rough TMP positive particles,there was also diffusion in the cytoplasma. ×18000

Fig.3 In the control group,the the lysosomes of the spinal ganglion cell were TMP negative. ×12000

Etectron microscopic enzyme histochemistry using cerium as a substitule for lead to demonstrate TMP activity in the spinal ganglionic neurons

Liu Dongjuan,Xu Yanping,Shi Yuxiu＊

(Department ofElectron Microscopy,China Medical University,S henyang110001,China)

Objective To investigate the cerium method showing the TMP(thiamine monophosphatase)positive neurons in the primative culture of spinal ganglion cells.Methods Applying electron microscopic histochemistry,we used cerium instead of conventional lead as the capture agent to detect the TMP activity in the lysosome of cultured ganglion neurons.Results In the spinal ganglion cells,lysosomes were positively stained with TMP. The novel cerium agent was completely soluable in the culture medium.The particles under the microscope were also finer and more uniform than the conventional lead product.This indicated that by using the new cerium agent,diffusion and unspecific precipitation was avoided in the experiment.Conclusion Using cerium as the capture agents to detect lysosomal TMP activity under electron microscopy is a stable and feasible method,with is a better histochemical way for the demonstration of lysosomal enzyme activity than the conventional lead.

Cerium; Cerebrospinal ganglia; Neuron; Thiamine monophosphatase; Electron microscopic histochemistry

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.012

2010-02-10

2010-04-01

劉冬娟,女(1962年),漢族,副主任技師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)