基于脲酶催化和酸堿指示劑變色原理的高脲乳快速檢測方法的建立

楊水云，鄭 瀟，韓 禹，隆永秋，劉永青

(西安交通大學生命科學與技術(shù)學院，線粒體醫(yī)學研究所，生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，陜西 西安 710049)

基于脲酶催化和酸堿指示劑變色原理的高脲乳快速檢測方法的建立

楊水云，鄭 瀟，韓 禹，隆永秋，劉永青

(西安交通大學生命科學與技術(shù)學院，線粒體醫(yī)學研究所，生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，陜西 西安 710049)

針對市場上存在的高脲乳(摻假和病理性)問題，建立區(qū)別于正常生理濃度范圍的快速檢測方法。檢測方法依據(jù)尿素被酶解導致的pH值升高幅度與其濃度呈正相關(guān)這一機理，對牛乳起始pH值進行優(yōu)化調(diào)整為6.8時，選擇溴百里酚藍作為指示劑，可以使乳脲含量達40mg/100mL生理上限卡切值以上時變色，從而區(qū)別檢出高脲問題乳。研究表明，依此組裝的高脲乳檢測試劑盒，可用于生產(chǎn)實踐。

尿素摻假乳；病理性高脲乳；檢測試紙；檢測試劑盒；脲酶；乳脲氮

尿素，別名脲，碳酰胺，是含氮化合物在哺乳動物肝臟內(nèi)經(jīng)由尿素循環(huán)產(chǎn)生，之后融入血液，最后通過腎臟由尿排出體外。在體內(nèi)，血尿素可以擴散進入動物乳中，因此是乳正常組分之一。通常稱作乳脲氮或MUN(milk urea nitrogen)，以乳液中的尿素含量/(mg/100mL)表示[1-2]。雖然尿素是低毒的，在體內(nèi)可達很高濃度水平，但是若超過生理上限卡切值，則會引起人體嚴重的健康問題，如消化不良、酸血癥、胃潰瘍、腎功能異常甚至癌癥等[3]。

近些年來，乳脲的檢測方法研究越來越受到重視。導致乳脲含量升高的因素有2個，一方面因奶牛的營養(yǎng)不平衡或者病理性乳牛造成的生理性高尿素含量，另一方面來源于人為的尿素或者牛尿摻假。研究表明，原料乳中尿素的正常生理濃度通常情況下應介于30～36mg/100mL[4]之間，若超過40mg/100mL則視為高脲乳或不合格牛乳[5]。人體血脲正常參考范圍為 2.8～8.2mmol/L(17～49mg/100mL)[6]。但尿素摻假或者病理性高脲乳的尿素濃度則遠遠超過這個上限，可見，開發(fā)一種簡單快速的區(qū)別檢測方法對高脲乳進行篩檢是非常必要的。

鑒于本研究推出的快速檢測試紙條可能進入家庭使用，因此有必要考慮檢測結(jié)果對使用者飲食心理的影響，沒必要甚至不能指示出正常生理范圍內(nèi)存在的尿素而造成某些人群的飲食壓力甚至導致厭食后果，這樣則希望檢測方法的靈敏度不要太高，能滿足檢測要求便可。但符合這樣要求的人性化檢測方法尚未見報道。

早期報道的乳脲含量測定方法很多[7-8]，其中也不乏用于尿素摻假乳的檢測，但這些研究幾乎都追求高度的檢測敏感度，但因乳品的不透明性和脂肪含量不穩(wěn)定性等，目前還未形成一種為大家共同接受的方法[3,8]。此外這些測定多采用傳感器對尿素經(jīng)酶解產(chǎn)生的銨根或二氧化碳進行定量測定[9-10]需要借用復雜的儀器設備，也不可能開發(fā)為便攜式現(xiàn)場快速檢測方法。尿素在脲酶的催化下釋放出氨和二氧化碳，導致pH值升高，而升高的ΔpH值與體系尿素含量呈正相關(guān)。而不同的酸堿指示劑具有不同的pKHIn值，會在不同的pH值處變色。依此可以選擇合適的酸堿指示劑使其能夠在合適的尿素濃度處變色，也可以通過調(diào)整起始pH值達到相同目的。

前期有研究[11]將脲酶固定于試紙上制成檢測試紙的思路對本實驗很有啟發(fā)。本研究目的是在前人研究基礎(chǔ)上，以消除本底脲的鮮乳為材料，實現(xiàn)乳脲真實含量的定量測定，篩選合適的酸堿指示劑，優(yōu)化起始pH值條件，開發(fā)用于高脲乳檢測的簡單便攜式檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

生鮮牛乳由合作企業(yè)提供，實驗用脲酶以刀豆(jack bean)磨成細粉替代，刀豆購于種子公司，無特殊要求；標準脲酶(urease，EC：3.5.1.5) 美國Sigma公司。

1U/mL的脲酶母液(純水配制，商品脲酶比活為33 U/mg)和質(zhì)量濃度為1g/mL尿素溶液母液；質(zhì)量濃度為1g/L的指示劑溶液用體積分數(shù)為20%的乙醇溶液配制。

標準型PB-10 pH計 德國賽多利斯公司。

1.2 方法

1.2.1 尿素檢測試紙制作

由于脲酶抑制劑種類多樣，常因緩沖液的使用而失活，如磷酸鹽緩沖液的抑制[12-13]，因此有人主張脲酶使用中采用無緩沖液的體系[14-15]，實驗也證明，脲酶在無緩沖液體系中具有正常的催化活性，因此本實驗采用無緩沖體系進行刀豆粉末的配制。首先將刀豆磨粉過120目篩獲得細粉末，將其分別加入1mg/mL的苯酚紅和溴百里酚藍溶液中使刀豆粉末質(zhì)量濃度為2g/100mL，即為含有指示劑的脲酶溶液。將普通的定量濾紙置于脲酶溶液中浸泡，反轉(zhuǎn)使試劑均勻附著在試紙兩面，用鑷子夾起紙片一端，瀝去多余汁液，懸掛陰干，即成尿素檢測試紙。試紙可以用手接觸像pH試紙一樣使用；也可裁成小片、固定在較硬載體上，接上手柄成檢測試紙條。

1.2.2 乳本底脲清零

按照5U/L的添加量，給鮮乳中加入商品脲酶，50℃水浴溫育降解乳中本底脲，同時用pH計監(jiān)測鮮乳pH值變化，在pH值開始上升并恒定不變后說明尿素不再水解，繼續(xù)延長10min，使乳中本底脲水解完全，稱為“消脲乳”。沸水浴30min滅活脲酶[16]，同時揮去乳液中的氣體。用HCl溶液調(diào)節(jié)消脲乳起始pH值，并用其制備標準濃度尿素的乳液，使尿素的質(zhì)量濃度范圍為0～100mg/100mL，用于指示劑和起始pH值優(yōu)化條件的篩選。

1.2.3 牛乳起始pH值的調(diào)整與優(yōu)化

由于本方法原理基于pH值變化，而正常鮮乳的pH值范圍介于6.3～6.8，數(shù)據(jù)隨樣品而異，本法制備的消脲乳，其pH值更高，常常達到pH8以上。為了保證檢測準確性和不同批次牛乳檢測結(jié)果的可比性，本方法要求在檢測之前調(diào)整牛乳起始pH值達到統(tǒng)一標準。另一方面，檢測起始pH值越高，同一指示劑變色所需要的尿素量就越少，反之亦然，因此可通過起始pH值調(diào)整，優(yōu)化指示劑的顯色范圍。考慮脲酶活性范圍(pH6～8)，起始pH值調(diào)節(jié)不應超出此范圍。不同起始pH值的標準乳脲液配制方法：首先用水配制尿素母液，并調(diào)節(jié)其pH值為7.0。再取較大量消脲乳調(diào)節(jié)其pH值，并用此pH值的消脲乳稀釋中性尿素母液，則成為相應pH值條件下系列濃度的標準乳脲液。實驗分別制備了6組pH6.5～7.0之間的標準乳脲液，每組pH值相差0.1個pH值單位，用于起始pH值的優(yōu)化實驗。

1.2.4 指示劑的選擇

考慮牛乳對顏色變化的遮蓋作用，所選指示劑在變色前后的顏色對比度要盡可能大?？紤]脲酶最適pH值為6～8，指示劑pKHIn不應超過pH8。符合該條件的常見指示劑為中性紅、溴百里酚藍和苯酚紅，其性質(zhì)列于表1，鑒于中性紅變色前后為紅-黃橙難以辨認，因此選用溴百里酚藍和苯酚紅作為候選指示劑。

表1 實驗相關(guān)候選指示劑Table 1 Relevant acid-base indicators

1.2.5 檢測條件的優(yōu)化與加樣方法

取含有苯酚紅和溴百里酚藍的脲酶試紙給其上滴加起始pH值不同的、已知質(zhì)量濃度的含脲乳液，觀察顏色變化，比較不同指示劑試紙在不同起始pH值條件下顏色變化，選擇正好能在40～50mg/100mL乳脲范圍內(nèi)變色的指示劑和起始pH值。

為了降低牛乳對顏色變化的遮蓋作用，實驗室中加樣采用在試紙一旁滴加乳液一滴，令其靠試紙的毛細作用滲透吸收乳液，濕潤試紙即可。若制備成帶有手柄的試紙條，則可采用在檢測窗口加樣濕潤試紙后，立即甩去窗口上的多余乳液，待其顯色。實踐證明十分方便并有效。

1.2.6 比色卡制作與試劑盒的組裝

以實驗室制備消脲乳配制的標準尿素質(zhì)量濃度乳液為參比，采用其含量為0(陰性對照)、40mg/100mL (牛乳生理上限)和50mg/100mL(人血脲氮上限)標準含脲乳，在顯色最適pH值條件下的顯色深度作為顏色卡切標準，采集其顏色制備成比色卡。樣品檢測結(jié)果可以跟比色卡對比，以判定MUN是否超過40mg/100mL和50mg/100mL這2個卡切值。

按照優(yōu)化后的檢測方案組裝試劑盒，組分包括：配有比色卡的溴百里酚藍脲酶試紙條若干，含0.1mol/L疊氮化鈉防腐劑的消脲乳(陰性對照)1瓶，調(diào)節(jié)牛乳起始pH值用0.5mol/L鹽酸和氫氧化鈉溶液各1瓶。視需要配備滴管和小燒杯，一次性配備pH計1臺。

試劑盒使用方法為：1)取待檢樣于小燒杯中，使用pH計精確調(diào)節(jié)樣品pH值至6.8；2)取檢測試紙2張，分別在其窗口上滴加一滴陰性對照和調(diào)好pH值的待檢樣，2～3s試紙吸飽水分后，甩去奶液，等待顏色穩(wěn)定、顯色完全；3)與比色卡進行對照，判定被檢樣的MUN含量范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解法制備消脲乳及其意義

由于乳脲含量日間差異很大，不同來源不同批次的生鮮乳，含尿素的量也各不相同，按照現(xiàn)有實驗方法[8]，給標準含脲乳體系的建立帶來很大麻煩。

本實驗采用脲酶降解法消除本底乳脲再采用沸水浴滅活脲酶。對脲酶處理過的乳液采用參文描述方法[6]，未測到有尿素存在。證明尿素徹底被水解，成功制備了尿素含量為零的“消脲乳”。借此可配制任意已知濃度的乳脲液，大大方便了實驗的進行。

2.2 牛乳緩沖性能及其對檢測結(jié)果的影響分析

研究報道[3]牛乳在pH5.3～5.4狹窄范圍內(nèi)具有較大緩沖容量(也稱緩沖指數(shù)，定義為使1mL牛乳的pH值改變1個單位所須加入的強堿或強酸物質(zhì)的毫摩爾數(shù))，而在其他pH值范圍，牛乳的緩沖容量很低且相當，因此采用酸堿調(diào)節(jié)牛乳pH值是有效的，不同樣品調(diào)整的pH值是可比的。依此，本檢測中，只要所優(yōu)化的起始pH值不在pH5.3～5.4范圍內(nèi)，本檢測方法預調(diào)起始pH值的結(jié)果就是可信的，不會影響檢測結(jié)果，也基于此依據(jù)，借用強酸堿調(diào)節(jié)乳品pH值進行的相關(guān)研究報道屢見不鮮[17-18]，也才有不少基于脲酶催化尿素檢測pH值變化的研究思路[11,19]。

2.3 不同質(zhì)量濃度乳脲使2種指示劑在起始pH6.5條件下的變色結(jié)果

用起始pH6.5的標準乳脲液檢測了2種指示劑的脲酶試紙的變色情況，用不同批次的脲酶試紙平行檢測3次以上。變色結(jié)果如圖1所示。

圖1 起始pH6.5時2種脲酶試紙變色的3組結(jié)果Fig.1 Color development of two types of urease-test-strips at initial pH 6.5 in triple parallel experiments

從圖1兩種試紙的分別3次的實驗結(jié)果可見，2種指示劑變色現(xiàn)象不同。苯酚紅試紙的變色特點是，從理論上的黃色向紅色變化過程中，出現(xiàn)了緩慢過渡的橙色，從顯色結(jié)果估計其變色的M U N范圍為20～40mg/100mL，但變色點難以辨認，不符合檢測要求，因此放棄對苯酚紅指示劑顯色條件的繼續(xù)優(yōu)化。而溴百里酚藍試紙變色點明顯，直接從棕黃色變成藍綠色，容易辨別。因此選定溴百里酚藍作指示劑繼續(xù)優(yōu)化。在起始pH6.5條件下，溴百里酚藍試紙變色點在MUN 70mg/100mL，需通過提高起始pH值來矯正變色時的MUN濃度，使其顯色點降低到MUN 40～50mg/100mL范圍。

2.4 溴百里酚藍脲酶試紙檢測起始pH值條件的優(yōu)化

圖2 不同起始pH值條件下溴百里酚藍試紙變色點處的MUN質(zhì)量濃度Fig.2 Color development of BTB-UTP at different initial pH. BTBUTP: bromothymol blue-urease test paper

按照1.2.3節(jié)實驗方法配制不同pH值的標準乳脲液，用溴百里酚藍脲酶試紙對其進行檢測，顯色結(jié)果如圖2所示。可見在不同起始pH值條件下，該試紙的變色點是不同的。調(diào)整的起始pH值越低，顯色點處的MUN質(zhì)量濃度越高，反之亦然。當起始pH值在6.8時，溴百里酚藍脲酶試紙的變色點位于乳脲氮生理上限卡切值40mg/100mL附近，滿足檢測要求。

該實驗結(jié)果也說明，由乳脲引起的pH值變化只是一個小范圍的pH值改變，起始pH值對檢測結(jié)果起著決定性作用，因此要求用精密pH計進行準確調(diào)節(jié)。

2.5 起始pH6.8時溴百里酚藍脲酶試紙的顯色效果及穩(wěn)定性

采用3個不同批次制備的溴百里酚藍脲酶檢測試紙對pH6.8條件下的標準乳脲液進行測定，表明顯色效果十分穩(wěn)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 起始pH6.8時溴百里酚藍脲酶試紙變色的3組結(jié)果Fig.3 Color development of BTB-UTP at optimal initial pH 6.8 by triple parallel experiments. BTB-UTP: bromothymol blue-urease test paper

從圖3可見，MUN含量低于40mg/100mL者，其顯色棕黃色，接近陰性對照，而當MUN含量高于40mg/100mL時顯色為藍綠色，且隨著MUN含量的升高，藍綠色顏色加深。MUN含量等于40mg/100mL時，顯色介于過度狀態(tài)。實驗表明其再現(xiàn)性良好。因此所優(yōu)化的條件和方法可以指示MUN超生理上限的高脲乳或者尿素摻假乳。

2.6 比色卡和試劑盒及其對市售幾種品牌鮮乳的檢測

圖4 按照比色卡對市售不同品牌牛乳的檢測結(jié)果Fig.4 Color chart and test results of market-available milk from 6 kinds of brands

采用實驗室標準MUN的顯色結(jié)果，制備包括0、40、50mg/100mL三個卡切值的比色卡如圖4a。按照比色卡顏色深度，凡是顯色深度淺于40mg/100mL的樣品均可視為正常乳品；顏色深度超過40mg/100mL標準色卡的，均可判定為尿素超標乳；若顏色深度超過50mg/100mL標準色卡者，此時尿素含量已超過人體內(nèi)血脲氮含量上限，不建議飲用。

用自制的溴百里酚藍-脲酶試紙條，以消脲乳作陰性對照，取市售6種不同品牌的牛乳各1袋，分為2份，隨機編號，采用單盲法對2份6個牛乳分別用制備的試紙條和試紙小片進行了MUN含量估計，檢測結(jié)果如圖4 b所示。

圖4b檢測結(jié)果顯示，6個鮮乳樣品的檢測顯色結(jié)果是各不相同的，說明試劑盒能夠區(qū)別檢測不同樣品；2組檢測結(jié)果幾乎完全一致，說明檢測試紙條和試紙片具有同樣的適用性，且重復性良好；在檢測的6個鮮乳樣品中，只有2個樣品(S1、S2)的乳脲含量低于正常上限卡切值40mg/100mL，而其他4個樣品(S3～S6)MUN含量都高于上限卡切值，其中2個還高于人血脲氮水平50mg/100mL。可見市售鮮乳尿素超標普遍，值得給與重視和關(guān)注。

3 結(jié) 論

3.1 采用脲酶對牛乳中的本底脲進行消除再對脲酶進行滅活，可以制備乳脲含量為零的消脲乳，大大方便了實驗研究，解決了乳脲測定研究中難以取得空白對照的困難。

3.2 在幾種常見指示劑中，溴百里酚藍的酸堿色差大，滿足實驗要求。對牛乳起始pH值進行優(yōu)化，當起始pH值被調(diào)整為6.8的時候，溴百里酚藍正好在乳脲上限卡切值(40mg/100mL)處變色。

3.3 按照標準濃度的乳脲濃度顯色結(jié)果制備了標準比色卡；研究形成了便攜式快速檢測高脲乳的方法，可以組裝成尿素檢測試劑盒，試劑盒可方便應用于實踐檢測中。

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Rapid Detection Method for High-Urea Milk Based on Urease Catalysis

YANG Shui-yun，ZHENG Xiao，HAN Yu，LONG Yong-qiu，LIU Yong-qing
(Key Laboratory of Biomedical Information Engineering, Ministry of Education, Institute of Mitochondrial Biology and Medicine,School of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

The objective of this study is to establish a rapid detection method for milk with urea content exceeding physiological range. Based on the fact that pH increase could result from urea enzymolysis positively correlated with urea concentration.Bromothymol blue was chosen as the acid-base indicator to determine high-urea milk. The indicator can develop color from yellow-brown to green-blue when urea content was higher than 40 mg/100 mL. On the basis of our present study, the developed reagent kit for the determination of high-urea milk is useful for practical application.

adulterated milk；pathological high-urea milk；test paper；milk-urea reagent kit；urease；milk urea nitrogen

TS201.6

A

1002-6630(2011)10-0222-05

2010-08-11

楊水云(1962—)，女，副教授，博士，研究方向為分子生物學技術(shù)和食品安全監(jiān)測技術(shù)。E-mail：shyyang@mail.xjtu.edu.cn