超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測定食用植物油中痕量Δ9-四氫大麻酚

張愛芝，王全林*

(寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，浙江 寧波 315041)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測定食用植物油中痕量Δ9-四氫大麻酚

張愛芝，王全林*

(寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，浙江 寧波 315041)

以電噴霧離子源(ESI)為電離源，在負(fù)離子采集模式下建立食用植物油中Δ9四氫大麻酚(Δ9-THC)超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取劑，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化、Waters ACQUITYTMUPLC BEH-C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色譜柱分離后以UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行分析。方法檢出限和定量限分別為0.15μg/kg和0.45μg/kg。實(shí)驗(yàn)以Δ9-氘代四氫大麻酚(Δ9-THC-D3)為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。3個添加水平，平均回收率為68.0%～110.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.8%～18.1%。本方法能夠滿足食用植物油中Δ9-四氫大麻酚痕量檢測的要求。

食用植物油；Δ9-四氫大麻酚；超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜；負(fù)離子模式

Δ9-四氫大麻酚(delta 9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)，主要來源于大麻，是精神活性物質(zhì)，對中樞神經(jīng)有明顯作用，并可產(chǎn)生依賴成癮性。高含量的THC相關(guān)的物質(zhì)在全球范圍內(nèi)被定性為毒品。我國纖用大麻種植面積高達(dá)成千上萬畝，作為副產(chǎn)物，大麻籽經(jīng)常被用來榨油，但由于大麻籽油中含有四氫大麻酚，我國食用植物油標(biāo)準(zhǔn)體系[1]將大麻油列為非食用油的范疇，并禁止將其摻雜到其他食用油中。然而，為了追求經(jīng)濟(jì)利益，未經(jīng)處理、含有四氫大麻酚的大麻仁油會被不法的生產(chǎn)商摻入食用植物油中。食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[2]鑒別食用植物油中是否摻雜有大麻油的標(biāo)準(zhǔn)方法是以Δ9-四氫大麻酚為特征指標(biāo)，采用薄層色譜法進(jìn)行分析檢測。薄層色譜法操作繁瑣，并且胡麻油、芝麻油和牢固藍(lán)鹽B會干擾測定，容易出現(xiàn)假陽性，給食品安全監(jiān)管造成困難。因此，開發(fā)靈敏、可靠的測定食用植物油中Δ9-THC的檢測技術(shù)，對于保障人民身體健康具有重要意義。

目前，國內(nèi)外有關(guān)Δ9-THC檢測方法的研究主要集中在毒品吸食者、試驗(yàn)動物的血液、尿液、唾液等生物樣品[3-10]。大麻籽及其油品中Δ9-THC檢測方法研究報(bào)道的主要有氣相色譜及液相色譜法[11-14]。然而，因摻雜了大麻油的食用植物油中Δ9-THC含量相對較低，這些方法難以滿足測定靈敏度的要求。本實(shí)驗(yàn)建立食用植物油中分析測定Δ9-THC的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該法操作簡便、分析時間短、檢出限低，可用于摻雜有大麻籽油的食用植物油中Δ9-THC的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆油 上海市購。

甲醇(色譜純) 德國Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(Millipore公司超純水器制備，電阻率為18.2MΩ·cm)。Δ9-四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC，1.0mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；氘代四氫大麻酚(Δ9-THC-D3，100μg/mL) 美國Cerilliant公司。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：以體積分?jǐn)?shù)87%的甲醇溶液配制Δ9-四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物Δ9-氘代四氫大麻酚質(zhì)量濃度均為10ng/mL。

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、Quattro Premier XE質(zhì)譜儀 美國Waters公司；超聲波清洗器 寧波海曙超聲儀器公司；TG16-WS 高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SC-8L-150數(shù)控固相萃取儀 廣州智真生物科技有限公司；氮吹儀 上海安譜儀器公司。SupelcleanTMLC-Alumina-N 固相萃取柱(1g/3mL) 美國Supelco公司。

1.2 UPLC-MS/MS分析條件

超高效液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱溫：40℃；樣品溫度：20℃；進(jìn)樣體積：10μL。流動相A為水，流動相B為甲醇，實(shí)驗(yàn)采用87% B－13% A等度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離(ESI－)；毛細(xì)管電壓：3.50kV；射頻透鏡1(RFlens 1)和射頻透鏡2(RF lens 2)的電壓分別為15.0V和13.0V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：600L/h。采用MRM監(jiān)測模式，優(yōu)化采集參數(shù)見表1，帶下劃線的離子為定量離子。

表1 Δ9-THC和Δ9-THC-D3的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters for THC and THC-D3

1.3 試樣前處理

稱取1.00g食用植物油，準(zhǔn)確至0.01g，置于10mL具塞塑料離心管中，加入50μL質(zhì)量濃度為1μg/mL的Δ9-THC-D3大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(用于加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的樣品，加入一定量的標(biāo)液)，5mL甲醇，超聲提取10min，8000r/min離心3min，吸取上清液于50mL小燒杯中，提取過程重復(fù)3次，在不高于40℃條件下N2吹至約0.5mL。5mL石油醚溶解，待凈化。

SupelcleanTMLC-Alumina-N固相萃取柱(Supelco 1g/3mL)以3mL石油醚活化平衡。將小燒杯中的試液全部上柱并接收上柱液，而后石油醚洗脫，共接收石油醚40mL，洗脫液于40℃條件N2吹干。加入5mL體積分?jǐn)?shù)87%的甲醇溶液，超聲溶解30s，過0.2μm濾膜，上機(jī)分析。

1.4 測定

定性需滿足：1)空白樣品中不出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰；2)特征離子色譜峰的信噪比(RSN)都在3:1以上；3)試樣色譜峰的保留時間，應(yīng)與校正溶液的相對保留時間一致，容許偏差為±2.5%；4)檢測到的離子的相對豐度與校正溶液的相對豐度一致，容許偏差滿足2002/657/EC中的要求。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的確定

長期以來，我國對于養(yǎng)老服務(wù)機(jī)構(gòu)的認(rèn)識局限于只能是非營利性，非企業(yè)性，政策支持上自然也僅限于此。雖然近年我國開始轉(zhuǎn)變觀念，政策上允許并鼓勵支持營利性養(yǎng)老服務(wù)機(jī)構(gòu)的建設(shè)和發(fā)展，但許多職能部門的觀念并沒有及時調(diào)整和轉(zhuǎn)變過來，從而造成國家與地方之間、部門與部門之間在政策上、做法上還有許多的不統(tǒng)一，某些基層部門常以上級部門還未發(fā)文為由延緩或阻礙政策的執(zhí)行，一定程度上阻礙了營利性養(yǎng)老服務(wù)機(jī)構(gòu)的建設(shè)與發(fā)展。

2.1.1 提取劑的確定

Δ9-THC的提取多采用甲醇和乙腈為提取劑[3,13,15-17]，實(shí)驗(yàn)考察兩種提取劑對目標(biāo)物提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論采用哪種提取劑，都存在一定的基質(zhì)干擾，以基質(zhì)匹配單點(diǎn)法定量，兩者提取效果無明顯差異。實(shí)驗(yàn)選用甲醇為提取劑。

2.1.2 提取方法的確定

已見報(bào)道的Δ9-四氫大麻酚檢測的提取方法主要有4種：取少量樣品直接以甲醇溶解后進(jìn)行分析[15]、傳統(tǒng)液液萃取[16]、超聲波萃取[13]、堿性水解后再進(jìn)行提取[17]等方法。比較了各提取方式對回收率的影響。直接溶解分析方法檢出限較高，不能滿足痕量殘留檢測的需要；分液漏斗進(jìn)行液液萃取回收率較低，且需大量有機(jī)溶劑；堿性水解后再進(jìn)行提取方法操作繁瑣且過程中會有部分Δ9-四氫大麻酚分解損失；比較而言，超聲波萃取方法簡單且回收率較高，因而本實(shí)驗(yàn)選用超聲波提取方式進(jìn)行。

2.1.3 固相萃取凈化柱的選擇

痕量或殘留分析中，采取固相萃取技術(shù)對分析液進(jìn)行凈化已成為分析者普遍采用的技術(shù)。已見報(bào)道的分析測定四氫大麻酚文獻(xiàn)中采用的固相萃取凈化小柱有C18[3]、Bond Elute Certify Ⅱ[18]及 LC-Alumina-N[12]。實(shí)驗(yàn)研究了Δ9-THC在3種柱子上的保留行為，發(fā)現(xiàn)Δ9-THC在 C18及LC-Alumina-N柱上的保留較強(qiáng)，在CertifyⅡ柱上的保留相對較弱?？疾炝?種固相萃取小柱對分析液凈化效果的影響(以分析液中Δ9-THC響應(yīng)強(qiáng)度衡量)，由圖1可以看出，LC-Alumina-N 固相萃取小柱的凈化效果較好。

圖1 不同固相萃取小柱凈化效果圖Fig.1 Clean-up efficiency of different SPE columns

2.1.4 LC-Alumina-N過柱條件的優(yōu)化

圖2 不同洗脫劑對Δ9-THC回收率的影響Fig.2 Effect of eluent on recovery rate of THC

2.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 電離模式的選擇

從Δ9-THC的分子結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)本身既含有酚羥基又在環(huán)結(jié)構(gòu)中含有氧，這表明Δ9-THC可能既可以采用正離子電離模式也適合采用負(fù)離子采集模式進(jìn)行分析，但目前基本上所有有關(guān)分析測定Δ9-四氫大麻酚的文獻(xiàn)都是采用正離子采集模式進(jìn)行分析的[4,10]。實(shí)驗(yàn)詳細(xì)考察兩種電離模式對目標(biāo)化合物靈敏度的影響。在甲醇-水流動相體系下，實(shí)驗(yàn)同時采用正離子模式及負(fù)離子模式對Δ9-四氫大麻酚進(jìn)行了采集，發(fā)現(xiàn)用負(fù)離子模式進(jìn)行采集，Δ9-四氫大麻酚母離子較穩(wěn)定且響應(yīng)強(qiáng)度較高，因而實(shí)驗(yàn)選用負(fù)離子電離模式。

2.2.2 流動相的選擇與優(yōu)化

流動相的組成不僅會影響到目標(biāo)化合物的保留時間和峰形，最重要的是還會影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而最終影響靈敏度。液質(zhì)聯(lián)用采用的流動相的基礎(chǔ)體系是甲醇-水及乙腈-水體系。為提高離子化效率，在采用負(fù)離子電離模式時通常選用乙腈-水體系。實(shí)驗(yàn)考察兩種流動相體系對目標(biāo)化合物響應(yīng)靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)在兩種流動相體系下目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度相差不大，實(shí)驗(yàn)采用以甲醇-水作為流動相并詳細(xì)優(yōu)化了洗脫梯度，結(jié)果表明用體積分?jǐn)?shù)87%的甲醇溶液等度洗脫時，5min內(nèi)即可完成對Δ9-四氫大麻酚的分析測定。圖3是在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次Δ9-四氫大麻酚和Δ9-氘代四氫大麻酚的總離子流圖疊加圖，6次的變異系數(shù)為3.3%，表明在優(yōu)化條件下，測定方法穩(wěn)定。圖4是Δ9-四氫大麻酚和氘代四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。依據(jù)選定的實(shí)驗(yàn)方法，測試陰性空白大豆食用油樣品提取測試液(圖5，圖中箭頭標(biāo)示的出峰位)和陰性加標(biāo)樣品提取測試液(圖6，加標(biāo)2.0μg/kg)中目標(biāo)物的MRM色譜圖?？梢钥闯?，Δ9-四氫大麻酚在實(shí)際樣品測定中不受復(fù)雜的樣品基質(zhì)的干擾。

圖3 Δ9-四氫大麻酚和Δ9-氘代四氫大麻酚的總離子流圖疊加圖(n=6)Fig.3 Stability of the developed method (n=6)

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of standard solutions of THC-D3 and THC

圖5 空白樣品MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of blank sample

圖6 加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of the spiked sample with THC at the concentration of 2.0μg/kg

2.3 檢出限、定量限

采用向陰性樣品中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。以3倍信噪比(RSN=3)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以10倍信噪比(RSN=10)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限，得到Δ9-THC的方法檢出限和定量限分別為0.15μg/kg 和0.45μg/kg。

2.4 校準(zhǔn)曲線、回收率及精密度

配制Δ9-THC質(zhì)量濃度為0.5～40.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)物Δ9-THC-D3質(zhì)量濃度恒定為10μg/L以Δ9-THC的定量離子色譜峰面積與Δ9-THC-D3的定量離子色譜峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)、分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.109564X＋0.00935539，R2=0.996581，大于0.99，截?fù)?jù)斜率之比小于0.1，表明Δ9-THC在質(zhì)量濃度0.5～40.0μg/L內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，且無背景干擾。

添加水平為0.50、2.00μg/kg及10.00μg/kg時的回收率及精密度見表2。由數(shù)據(jù)可以看出，Δ9-THC在3種加標(biāo)水平下平均回收率為68.0%～110.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.8%～18.1%，能夠滿足殘留檢測需要。

表2 不同添加水平下THC的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average recovery rate and relative standard errors of THC at different spiked levels (n=6)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS法測定食用植物油中痕量Δ9-THC的分析方法。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了提取劑、提取方法、凈化方法對測定結(jié)果的影響，確定了甲醇超聲提取、中性氧化鋁固相萃取小柱凈化富集的前處理方法；詳細(xì)優(yōu)化超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MSMS)法的儀器條件，比較了正、負(fù)電離模式對Δ9-THC響應(yīng)靈敏度的影響，在負(fù)離子采集模式下以多反應(yīng)檢測模式進(jìn)行分析；在3個添加水平下對食用植物油中的Δ9-THC進(jìn)行檢測，以內(nèi)標(biāo)法定量，平均回收率為68.0%～110.0%。本方法操作簡便、分析時間短、檢出限低，有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Determination of THC in Edible Vegetable Oil by Ultra-high Performance Liquid Chrmatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Ai-zhi，WANG Quan-lin*
(Ningbo Academy of Product Quality Supervision and Inspection, Ningbo 315041, China)

A determination method for Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) in edible vegetable oil was developed on the basis of ultra-high performance liquid chrmatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) under negative ion mode using electrospray ionization (ESI) source. THC was extracted with methanol and then purified by LC-alumina-N solid phase extraction column. Qualitative and quantitative analysis were carried out for the analyte under a MRM mode after THC was separated on Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 (1.7 μm, 2.1 mm×100 mm) column. The limit of detection (LOD) of the developed method was 0.15 μ g/kg and the limit of quantification (LOQ) was 0.45 μ g/kg for THC. Quantitative analysis was corrected by internal standard method using delta 9-THC-D3 as internal standard. Average recovery rate of THC varied from 68.0%－110.0% with relative standard deviation ranging from 8.8%－18.1% at three spiked levels. Therefore, the developed method meets the requirements for the determination of THC in edible vegetable oil.

edible vegetable oil；Δ9-Tetrahydrocannabinol；ultra-high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；negative ion mode

TS201；O657

A

1002-6630(2011)10-0194-05

2010-07-21

浙江省質(zhì)檢系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(20080228)

張愛芝(1981—)，女，碩士，主要從事食品安全檢測技術(shù)研究。E-mail：zhangaizhi1981@163.com

*通信作者：王全林(1962—)，男，教授級高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail：quanlinwang@163.com