直接競爭化學發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

楚金申，許 楊*，何慶華，王劉花，盧 江

(食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

直接競爭化學發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

楚金申，許 楊*，何慶華，王劉花，盧 江

(食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

建立一種檢測豬肉中磺胺嘧啶的簡便、快速、高特異性的直接競爭化學發(fā)光酶免疫法。采用改良的過碘酸鈉法制備酶標抗體，以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫作為化學發(fā)光體系。經優(yōu)化該方法檢測條件為：利用檸檬酸緩沖液稀釋抗原包被質量濃度為0.8μg/mL，酶標抗體2000倍稀釋，競爭反應25min；所建立的方法分析靈敏度為2.96ng/mL，批內變異系數(shù)小于8.32%，批間變異系數(shù)小于13.4%，以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%～103.7%，與其他結構類似物未見明顯交叉，所建立的標準曲線相關系數(shù)為0.9922、檢測線性范圍為4.14～244ng/mL、檢測時間為25min，可在實際生產中應用。

磺胺嘧啶；直接競爭化學發(fā)光酶免疫法；辣根過氧化物酶；豬肉

磺胺類藥物是人工合成的一類具有對氨基苯磺酰胺共同母核結構的廣譜抗菌藥物，廣泛應用于畜禽抗感染治療，有時也作為動物飼料添加劑促進生長[1]。該類藥物的毒副作用非常明顯，據(jù)報道它與痘瘡的發(fā)病緊密相關，具有腎毒性[2]，而且可以在動物體內殘留，通過動物源性食品進入食物鏈直接威脅人類的身體健康。磺胺嘧啶是磺胺類藥物殘留物中典型的一種[3]，其分子結構式如圖1所示。我國與歐盟規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物總量的最高殘留限量為100μg/mL[4-5]。

圖1 磺胺嘧啶結構式Fig.1 Chemical structure of sulfadiazine

目前常用的檢測磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)的方法主要有高效液相色譜(high performance liquidchromatography，HPLC)法[6]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)[7]和酶聯(lián)免疫吸附法(engyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)[8]等。前兩種方法靈敏、準確，但耗時、費力、成本高且需要昂貴的設備和專業(yè)的人員操作；酶聯(lián)免疫吸附法快速、特異性好，但靈敏度不夠高。直接競爭化學發(fā)光酶免疫法省略了間接競爭方法中加二抗的步驟，節(jié)約檢測時間，既具有放射免疫法的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫法操作簡便、快速的特點，線性范圍寬、測試中無需使用對人體有害的試劑[9]。

本研究制備抗磺胺嘧啶酶標抗體，建立直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(direct competitive-engyme-linked immunosorbent assay，DC-ELISA)，并采用魯米諾化學發(fā)光體系建立直接競爭化學發(fā)光酶免疫法(direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay，DC-CLEIA)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肌肉 市購。

磺胺嘧啶單克隆抗體腹水 自制；磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine，SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine，SMM)、磺胺甲噁唑(s u l f a m e t h o x a z o l e，S M Z)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline，SQ)、對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid，PABA)、磺胺甲二唑(sulfamethizole，SMT)、磺胺吡啶(sulphapyridine，SP)、慶大霉素(gentamicin，GTM)、氯霉素(chloramphenicol，CAP) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺(sulfanilamide，SN)、對氨基苯磺酸(sulfanilic acid，p-ASA) 阿拉丁試劑(上海)有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(RZ＞3)上海生工生物工程技術服務有限公司；化學發(fā)光底物液美國Pierce公司。

化學發(fā)光檢測儀、酶標儀 美國Thermo公司；96孔化學發(fā)光板條 深圳金燦華有限公司；Ultrospec紫外分光光度計 美國Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體的純化及鑒定

采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法[10]對腹水進行初步純化。采用Protein G親和層析柱進一步純化后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其純度，稀釋n倍，紫外分光光度計分別測定OD280nm和OD260nm，根據(jù)式(1)計算IgG含量：

1.2.2 酶標抗體的制備

采用改良的過碘酸鈉法[11]將HRP與已純化的單抗相連制備酶標抗體IgG-HRP。用紫外分光光度計分別測定OD403nm和OD280nm，根據(jù)公式計算酶量、抗體量和克分子比：

1.2.3 直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(DC-ELISA)

用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至1.2μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃過夜包被，PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩去封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中分別加入SD標準品或樣品50μL，酶標抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育35min，洗滌4次，拍干，加100μL TMB顯色液，顯色反應5min后加 2mol/L硫酸50μL終止反應，并于450nm波長處檢測光密度(OD450nm)。未加SD標準品孔的OD450nm值為B0，添加了SD標準品孔的OD450nm值為B，按式(2)計算結合率，結合率為50%時所對應的SD標準品質量濃度即是IC50。

1.2.4 直接競爭化學發(fā)光免疫法(DC-CLEIA)

用0.06mol/mL檸檬酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至0.8μg/mL向微孔板中每孔加100μL，4℃過夜包被，然后用PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩棄封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中加入SD標準品或樣品50μL，酶標抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育25min，洗滌4次，拍干，每孔加發(fā)光底物液100μL，用化學發(fā)光檢測儀測量相對發(fā)光強度單位(relative light units，RLU)。未加SD標準品孔的RLU值為B0，添加了SD標準品孔的RLU值為B，IC50的計算同1.2.3節(jié)。

1.2.5 檢測條件的確定

采用方陣滴定[12]確定DC-ELISA抗原和抗體反應的稀釋倍數(shù)。

文獻[13]表明，RLUmax/IC50越大，DC-CLEIA的靈敏度和重復性越好，因此引入RLUmax/IC50評價各種因素的影響。按照1.2.4節(jié)方法分別對抗原包被液及包被質量濃度、酶標抗體稀釋倍數(shù)和競爭反應時間優(yōu)化。

1.2.6 樣品提取

參照國家標準[15]。HPLC方法的樣品提取參照測定標準[14]。

1.2.7 方法學分析

標準曲線：稱取4mg SD標準品溶于1mL 蒸餾水配制成4mg/mL SD標準品母液，將SD標準品母液分別稀釋至終質量濃度為5、10、20、50、100、200、500ng/mL，參照文獻[12]的方法建立DC-ELISA標準曲線，參照文獻[13]的方法建立DC-CLEIA 標準曲線。將SD標準品母液分別稀釋至終質量濃度為10、25、50、100、200、400、800、2000、4000ng/mL，參照文獻[14]用HPLC分別測定計算峰面積，并建立HPLC標準曲線。

靈敏度：對零標準點平行測定10次，計算發(fā)光或OD450nm平均值及其標準偏差，再由平均值減去兩倍標準偏差后的值代入校準曲線所求得的質量濃度即是靈敏度，重復實驗3次，計算平均靈敏度。HPLC方法的靈敏度為以色譜峰面積響應值等于3倍信噪比的進樣量計算，求出靈敏度。

批內批間變異：隨機抽取板條分別進行3個批次的包被，每批次6個平行進行測定，分別計算IC50的批內及批間變異。

回收率：在經HPLC檢測為陰性豬肉樣品中分別添加 40、80、120μg/kg的SD標準品，依照1.2.6節(jié)進行樣品提取，分別用DC-ELISA和DC-CLEIA檢測樣品質量濃度。

特異性：本研究選取與SD結構類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM)，采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應率，交叉反應率按式(3)計算：

2 結果與分析

2.1 抗體的純化與鑒定

圖2 抗體純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of purified anti-SD McAb

腹水經純化后通過SDS-PAGE檢測純度，結果如圖2所示。未純化的抗體雜蛋白帶較多，使用辛酸-硫酸銨沉淀法提取純化的抗體仍然有一些雜質蛋白，而經過Protein G親和層析柱純化的抗體IgG有兩條清晰的條帶：一條為輕鏈，約25kD；另一條為重鏈，約50kD，純度較好。

2.2 酶標抗體的制備

采用改良的過碘酸鈉法將制備好的單抗和HRP連接制備酶標抗體IgG-HRP，調整HRP/IgG物質的量投料比為1:1、2:1、4:1獲得3組酶標抗體，經計算得它們的HRP/IgG克分子比分別為1.04、1.22、0.84，它們的效價如圖3所示。

圖3 不同HRP/IgG物質的量投料比酶標抗體的效價Fig.3 The titers of IgG-HRP at different HRP/IgG molecular ratios

由圖3可知，HRP/IgG物質的量投料比為2:1時效價最高，達到1:25600以上。

2.3 化學發(fā)光免疫分析法的建立

2.3.1 抗原包被液的選擇

分別使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及碳酸緩沖液稀釋抗原至0.8μg/mL進行包被，其他步驟參照1.2.4節(jié)，實驗結果如圖4所示。經計算用3種緩沖液包被時IC50分別為53.5、36.6、37.8ng/mL，可見，檸檬酸緩沖液包被時，標準品競爭抑制效果最好，因此選擇檸檬酸緩沖液作為包被緩沖液。

圖4 抗原稀釋液的選擇Fig.4 Screening of optimum dilution buffer for coating antibody

2.3.2 抗原包被質量濃度的選擇

采用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗原至1.2、1.0、0.8、0.6μg/mL，其他步驟參照1.2.4節(jié)，結果如圖5所示。IC50隨著抗原包被質量濃度的增大而增大，RLUmax/IC50隨著抗原質量濃度的增大先是增大然后減小，在抗原質量濃度為0.8μg/mL時達到最大，因此選用0.8μg/mL作為抗原包被質量濃度。

圖5 DC-CLEIA抗原包被質量濃度的優(yōu)化Fig.5 Screening of optimum coating antibody concentration

2.3.3 酶標抗體稀釋倍數(shù)的選擇

用磷酸緩沖液將酶標抗體分別稀釋1000、1500、2000、3000倍，其他步驟參照1.2.4節(jié)，結果如圖6所示。隨著酶標抗體稀釋倍數(shù)的增大，IC50逐漸減小并趨于恒定，RLUmax/IC50也逐漸減小。綜合考慮IC50與RLUmax/IC50，將酶標抗體的稀釋倍數(shù)定為2000倍。

圖6 DC-CLEIA酶標抗體稀釋度的優(yōu)化Fig.6 Screening of optimum IgG-HRP concentration

2.3.4 酶標抗體競爭反應時間的選擇

圖7 DC-CLEIA抗原包被質量濃度的優(yōu)化Fig.7 Screening of optimum reaction time

按照1.2.4節(jié)操作步驟分別選擇競爭反應時間為10、15、20、25、30、35min進行實驗，結果如圖7所示。隨著溫育時間的延長，IC50呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，RLUmax/IC50在25min時達到最大，選定25min作為競爭反應時間。

2.4 DC-ELISA與DC-CLEIA的方法學評價

2.4.1 標準曲線

采用方陣滴定法確定最佳抗原包被質量濃度為1.2 μg/mL，酶標抗體的稀釋倍數(shù)為1:3200，建立DC-ELISA標準曲線線性回歸方程為Y=－15.1829lnX+117.31(R2=0.9982)，IC50=84.21ng/mL，檢測范圍(IC20～IC80)為11.67～607.4ng/mL。

按照1.2.7節(jié)繪制DC-CLEIA標準曲線見圖8。線性回歸方程為Y=－14.717lnX+100.94(R2=0.9922)，IC50=31.87ng/mL，檢測范圍(IC20～IC80)為 4.14～244.6ng/mL。

圖8 DC-CLEIA的標準曲線Fig.8 Standard calibration curve of the DC-CLEIA

2.4.2 靈敏度和精密度

按照1.2.7節(jié)計算的DC-ELISA平均靈敏度為8.41ng/mL，DC-CLEIA平均靈敏度為2.96ng/mL，較DC-ELISA提高了2.84倍。

按照1.2.7節(jié)分別計算IC50的批內及批間變異，結果見表1。

表1 兩種檢測方法對SD測定的精密度(n=6)Table 1 Precision of DC-CLEIA and DC-ELISA (n=6)

2.4.3 回收率

1.2.7節(jié)的回收率檢測實驗結果見表2。與DC-ELISA相比，DC-CLEIA的加標回收率較高。

表2 兩種檢測方法對SD測定的加標回收率(n=3)Table 2 Recoveries of SD from spiked blank pork (n=3)

2.4.4 特異性實驗

本研究選取與SD標準品結構類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM)，采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應率，結果(表3)未見有交叉反應。

表3 DC-ELISA與DC-CLEIA兩種方法的交叉反應率Table 3 Cross-reactivities to SD analogues analyzed by DC-ELISA or DC-CLEIA

2.5 DC-CLEIA樣品測定與HPLC的比較

按照1.2.7節(jié)中方法進行HPLC測定發(fā)現(xiàn)，在10～4000μg/kg范圍內，線性關系良好，線性回歸方程為Y=0.063X－0.048，線性相關系數(shù)為0.999，靈敏度為10 μg/kg。與DC-CLEIA方法相比，線性范圍較寬，但靈敏度較大。

分別采用DC-CLEIA和HPLC測定市場上隨機購買的26份豬肌肉樣品，兩種方法的所測結果見表4，以DC-CLEIA的測定值為X軸、HPLC測定值為Y軸作圖得相關曲線如圖9所示，線性擬合的方程為Y=0.7498X－3.788，相關系數(shù)為0.956。

表4 DC-CLEIA和HPLC的樣品測定結果Table 4 SD concentrations in real samples analyzed by DC-ELISA and DC-CLEIA

圖9 DC-CLEIA的測定值與HPLC測定值的相關性Fig.9 Correlation between DC-CLEIA and HPLC results

3 結 論

3.1 采用Protein G親和層析柱對腹水進行純化，得到純度比較高的單抗，通過改良的過碘酸鈉法制備了酶標抗體，抗體效價達到 1:25600。

3.2 優(yōu)化了化學發(fā)光酶免疫反應的各種條件，采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學發(fā)光體系，建立了一種測定豬肉中SD化學發(fā)光酶免疫分析方法，方法分析靈敏度為2.96ng/mL，批內變異系數(shù)小于8.32%，批間變異系數(shù)小于13.4%，以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%～103.7%，與其他結構類似物未見明顯交叉，所建立的標準曲線相關系數(shù)為0.9922，檢測線性范圍為4.14～244ng/mL，樣品檢測時間僅為25min。

3.3 建立的DC-CLEIA與DC-ELISA相比靈敏度提高了2.84倍。采用DC-CLEIA和HPLC測定了26份市場樣品，并進行對照，兩者的線性相關系數(shù)為0.956。

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Determination of Sulfadianzine Residues in Pork by Direct Competitive Chemiluminescence Enzyme Immunoassay

CHU Jin-shen，XU Yang*，HE Qing-hua，WANG Liu-hua，LU Jiang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

A direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay (DC-CLEIA) was developed to determine sulfadiazine (SD) residues in pork. Assay parameters including coating antigen (OVA-SD) and enzyme labeled antibody concentrations concentrations and reaction time were optimized to be 0.8 μg/mL, 2000-fold dilution and 25 min, respectively. The analytical sensitivity of the developed method was 2.96 ng/mL, and the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 8.32% and 13.4%, respectively. The recoveries for SD in negative pork spiked at three levels ranged from 75.6% to 103.7%. The McAb had no noticeable cross-reactivity to SD analogues. The standard curve displayed good linearity over the range of 4.14 to 244 ng/mL with a correlation coefficient of 0.9922. This DC-CLEIA may be used for routine detection and monitoring of SD in pork.

sulfadiazine；direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay；horseradish peroxidase；pork

TS207.3

A

1002-6630(2011)10-0124-06

2010-07-23

江西省科技支撐計劃項目(2007BS12501)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)

楚金申(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物。E-mail：chujinshen@126.com

*通信作者：許楊(1951—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xuyang1951@163.com