荔枝與荔枝酒褐變控制

馮衛(wèi)華，林麗棉，秦 艷

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

荔枝與荔枝酒褐變控制

馮衛(wèi)華，林麗棉，秦 艷

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

以荔枝及荔枝酒為試料，研究荔枝多酚氧化酶(PPO)的酶學(xué)特性及荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中的褐變機(jī)理及控制措施。結(jié)果表明：荔枝PPO存在同功酶，荔枝PPO最適底物為沒(méi)食子酸；以沒(méi)食子酸為底物，荔枝PPO最適反應(yīng)pH值為8.0，最適反應(yīng)溫度50℃，荔枝PPO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：米氏參數(shù)(Km)為26.033mmol/L，最大反應(yīng)速度(Vmax)為34.816g/(L·min)；荔枝PPO對(duì)酸堿、對(duì)熱穩(wěn)定性較差；荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中褐變的主要原因是其PPO引起的酶促褐變。因此，低溫貯藏和高溫?zé)崽幚砜捎行б种评笾袄笾圃谫A藏和加工中酶促褐變反應(yīng)。

荔枝；荔枝酒；多酚氧化酶；酶促褐變

荔枝(Litchi chinensis Liquor)為我國(guó)亞熱帶特有水果，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，風(fēng)味獨(dú)特，素有“果中之王”之美稱。每100g荔枝果肉中含有水分84g、含碳水化合物14g(熱量64千卡)、VC 36mg、蛋白質(zhì)0.7g、脂肪0.6g、磷32mg、鈣6mg、鐵0.5mg、硫胺素0.02mg、核黃素0.04mg和尼克酸0.4mg[1-2]。由于荔枝采后極易褐變腐爛，所以荔枝的深加工迫在眉睫。目前荔枝的深加工產(chǎn)品主要有荔枝干、荔枝罐頭、荔枝果凍、荔枝濃縮汁和荔枝酒。其中，釀酒提高了荔枝的商品價(jià)值，對(duì)荔枝產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展有重要的意義[3]。

近幾年各企業(yè)紛紛推出100%荔枝汁發(fā)酵酒，其口感和工藝上都有較大的突破，但是由于技術(shù)儲(chǔ)備不夠完善，經(jīng)驗(yàn)積累不夠成熟，產(chǎn)品在裝瓶后或貨架期時(shí)仍然存在氧化褐變、失光等問(wèn)題[3]。

褐變是果蔬在貯藏、加工期間的一個(gè)突出問(wèn)題，給生產(chǎn)造成較大損失，國(guó)內(nèi)外就這一問(wèn)題成立了專門的研究機(jī)構(gòu)，關(guān)于這方面的報(bào)道也很多。果蔬貯藏加工期間褐變的原因，很多研究認(rèn)為主要是酶促褐變，即果蔬中的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶(polyphenol oxidase，E.C. 1. 14. 18. 1，PPO)的作用下被氧化的結(jié)果[4-6]。因此，酶促褐變的控制已成為食品工業(yè)研究的焦點(diǎn)[7-8]。據(jù)報(bào)道，荔枝與荔枝殼褐變其主要原因是多酚氧化酶引起的酶促褐變[9-10]，然而荔枝及其加工過(guò)程中褐變與荔枝多酚氧化酶引起的酶促褐變的相關(guān)性研究尚未報(bào)道，因而不能斷定荔枝酒加工中褐變的主要原因。本研究通過(guò)測(cè)定荔枝與荔枝酒的褐變程度及其多酚氧化酶的活性大小，考察了二者的相關(guān)性，從而確定荔枝酒褐變的主要原因；考察荔枝與荔枝酒中多酚氧化酶的最適底物、最適pH值、最適溫度以及荔枝多酚氧化酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定參數(shù)，為防治荔枝及荔枝酒貯藏與加工過(guò)程中的酶褐變提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所采用的荔枝與荔枝酒均由廣州市從化順昌源綠色食品有限公司提供。其中荔枝酒為分別發(fā)酵4、8、12、15d的樣品，樣品密封后于－25℃下保存?zhèn)溆谩Ｐ迈r的荔枝用不銹鋼刀迅速將其果皮、果肉和果心分離，迅速裝入保鮮袋中密封于－25℃下冷凍，再用不銹鋼刀將冷凍的荔枝果肉剁碎混均，迅速裝入保鮮袋中密封，于－25℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

沒(méi)食子酸、福林試劑、2,2’-d i p h e n y l-1-picrylhydrazyl(DPPH)、2,4,6-tris-2,4,6-tripyridyl-2-triazine(TPTZ)等 美國(guó) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 762紫外/可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G-A冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 荔枝果肉PPO的提取及最適底物的測(cè)定

1.3.1 荔枝果肉PPO的提取

稱取2.0g荔枝果肉，加入2mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)，冰浴研磨勻漿，然后于10000×g離心15min，收集上清液作為荔枝果肉PPO粗酶液，用于荔枝果肉PPO活性測(cè)定。

1.3.2 荔枝果肉PPO最適底物的測(cè)定

在4.0mL反應(yīng)體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)和0.2mL酶液、然后分別加入1.5mL 40mmol/L 鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、間苯二酚和沒(méi)食子酸溶液(100mmol/L pH6.8的磷酸緩沖液溶解)，分別混勻后在室溫下420nm處測(cè)定其吸光度，從0min開始記錄每分鐘反應(yīng)體系的吸光度，連續(xù)測(cè)定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻?yīng)體系。在測(cè)定條件下，以每分鐘吸光度改變0.001為一個(gè)酶活力單位(U)，酶活性表示為U/g 。

1.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)荔枝果肉PPO活性的影響

在4.0mL反應(yīng)體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)、1.5mL 40mmol/L沒(méi)食子酸溶液(100mmol/L pH6.8磷酸緩沖液溶解)和0.2mL酶液，混勻后，分別于20、25、30、35、40、45、50、55、60℃和65℃下反應(yīng)，記錄每分鐘反應(yīng)體系在420nm吸光度，連續(xù)測(cè)定10min，空白為不加酶液的反應(yīng)體系。PPO活性以其最高酶活性相對(duì)值表示，最高相對(duì)酶活性定為100%。

1.3.4 反應(yīng)pH值對(duì)荔枝果肉PPO活性的影響

首先配制100mmol/L醋酸緩沖液pH5.0及100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0、6.8、8.0和8.5)，并配制40mmol/L沒(méi)食子酸溶液(分別用不同pH值的醋酸緩沖液或磷酸緩沖液溶解)。在4.0mL反應(yīng)體系中，加入2.3mL 100mmol/L的不同pH值的緩沖液、1.5mL 40mmol/L最適底物溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應(yīng)，酶液加入后開始計(jì)時(shí)，記錄每分鐘反應(yīng)體系在420nm的吸光度，連續(xù)測(cè)定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻?yīng)體系。PPO活性以其最高酶活性相對(duì)值表示，最高酶活性定為100%。

1.3.5 荔枝果肉PPO酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與Vmax

用100mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液分別配制濃度30、50、70、90mmol/L沒(méi)食子酸溶液。在4.0mL反應(yīng)體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)、1.5mL不同濃度的沒(méi)食子酸溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應(yīng)，測(cè)定PPO的活性?？瞻诪椴患用敢旱姆磻?yīng)體系。求得荔枝果肉PPO的Vmax和Km值。

1.3.6 荔枝果肉PPO的熱穩(wěn)定性及熱失活參數(shù)

PPO熱穩(wěn)定性：將PPO酶液分別在40、50、60、70℃和80℃水浴中保溫15、30、45min和60min，迅速冰浴冷卻，然后于10000×g離心5min，收集上清液，按照酶活性測(cè)定體系測(cè)定PPO活性。PPO活性分別以其未加熱的酶活性相對(duì)值表示，未加熱的酶相對(duì)酶活定為100%。

PPO熱失活參數(shù)的計(jì)算按照Galani等的方法[11]。

1.3.7 pH值對(duì)PPO活性的影響

首先配制100mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0～5.0)及100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0～9.0)，將荔枝肉按1:1的比例分別用不同pH值的緩沖液研磨提取，于10000×g離心15min，再放入4℃左右的冰箱中保持30min，最后再離心5min，并配制40mmol/L 沒(méi)食子酸溶液(分別用不同pH值的醋酸緩沖液和磷酸緩沖液溶解)。在4.0mL反應(yīng)體系中，加入2.3mL 100mmol/L的不同pH值的緩沖液、1.5mL 40mmol/L 沒(méi)食子酸溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應(yīng)，酶液加入后開始計(jì)時(shí)，記錄每分鐘反應(yīng)體系在420nm的吸光度，連續(xù)測(cè)定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻?yīng)體系。PPO活性分別以其最高酶活性相對(duì)值表示，最高酶相對(duì)酶活定為100%。

1.3.8 荔枝酒PPO活性變化

在4.0mL反應(yīng)體系中，分別加入0.2mL不同發(fā)酵天數(shù)的荔枝酒，然后加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)和1.5mL 40mmol/L沒(méi)食子酸溶液(100mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液溶解)，混勻后于50℃條件反應(yīng)，酶液加入后開始計(jì)時(shí)，記錄每分鐘反應(yīng)體系在420nm的吸光度，連續(xù)測(cè)定10min。空白為不加荔枝酒的反應(yīng)體系。荔枝酒PPO活性以其最高酶活性相對(duì)值表示，最高相對(duì)酶活定為100%。

1.3.9 荔枝酒色澤的測(cè)定

分別取不同發(fā)酵天數(shù)的荔枝酒，用蒸餾水作空白液，在420nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定荔枝酒吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)提取試驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)測(cè)定均重復(fù)3次。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 11.5軟件的One-Way ANOVA對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析；應(yīng)用Pearson correlation test進(jìn)行變量之間的相關(guān)性分析。P＜0.05，表示差異顯著；P＜0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝果肉PPO最適底物的測(cè)定

2016年至今，王世君擔(dān)任雞東縣農(nóng)村公路縣鄉(xiāng)路網(wǎng)改造工程建設(shè)指揮部總工程師，負(fù)責(zé)農(nóng)村公路工程建設(shè)及質(zhì)量管理工作。農(nóng)村公路施工隊(duì)伍情況復(fù)雜，管理難度大，為了保證工程質(zhì)量，他從招標(biāo)履約開始，對(duì)進(jìn)場(chǎng)人員從嚴(yán)管理，對(duì)進(jìn)場(chǎng)材料嚴(yán)格把關(guān)，對(duì)施工步驟認(rèn)真監(jiān)控，對(duì)工程質(zhì)量做到達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)不驗(yàn)收、不允許進(jìn)入下道工序，在同事的支持下，克服重重困難，完美地完成了各項(xiàng)工作。

圖1 荔枝果肉PPO底物特異性Fig.1 Substrate specificity of PPO from litchi

底物不同，荔枝果肉PPO活性有很大區(qū)別。圖1結(jié)果顯示，采用沒(méi)食子酸為底物，荔枝果肉PPO活性極顯著高于鄰苯二酚、間苯二酚和對(duì)苯二酚(P＜0.01)。因此，荔枝果肉PPO的最適底物是沒(méi)食子酸。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同果蔬PPO最適底物差異很大，例如甘藍(lán)PPO最適底物為間苯三酚，茄子、生菜、蘋果PPO最適底物為綠原酸[12-15]，紫甘薯PPO最適底物是4-甲基鄰苯二酚[16]。然而，蔣世云等[10]報(bào)道，白蠟荔枝果肉多酚氧化酶最佳底物為4-甲基兒茶酚，可能荔枝品種不同，其果肉多酚氧化酶的類型存在差異，因而其果肉多酚氧化酶最適底物也有區(qū)別。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)荔枝果肉PPO活性的影響

圖2表明荔枝果肉PPO最適反應(yīng)溫度為35～50℃，其中，50℃時(shí)PPO相對(duì)酶活最大。特別是，荔枝果肉PPO活性在反應(yīng)溫度35～55℃之間出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰，分別在35℃和50℃，這表明荔枝果肉PPO有同功酶存在，已有文獻(xiàn)報(bào)道了牛蒡[17]、草菇[18]、板栗[19]等的多酚氧化酶為同功酶。

溫度對(duì)PPO的活性影響很大，一方面溫度升高，提高了反應(yīng)的活化能，因而加快了其催化反應(yīng)的進(jìn)行；另一方面，溫度升高使酶蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致酶失活，降低催化反應(yīng)速度，酶促褐變是這兩種作用的協(xié)同效果[20]。因此，低溫貯藏是延緩荔枝貯藏中酶褐變的有效方法，高溫?zé)崽幚硎且种评笾庸み^(guò)程中酶褐變的有效方法。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)PPO活性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on PPO activity

2.3 反應(yīng)pH值對(duì)荔枝果肉PPO活性的影響

圖3 pH值對(duì)PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

2.4 荔枝果肉PPO酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與Vmax

盡管PPO對(duì)于不同的底物會(huì)顯示出不同的活性，但是不能僅依此作為PPO最適底物的判定標(biāo)準(zhǔn)。PPO最適底物的選擇主要依據(jù)以下兩個(gè)因素：強(qiáng)底物結(jié)合能力和高催化效率，即低Km和高Vmax。Km是PPO對(duì)于不同底物的特征性常數(shù)，Km值越小，說(shuō)明達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需底物濃度就越少，酶對(duì)底物的親和力就越大，反之亦然。Vmax則表示當(dāng)PPO濃度不變時(shí)，PPO被底物飽和，反應(yīng)速度達(dá)到最大的狀態(tài)[19]。

由Linewear-Burk方程[23]1/V =Km/Vmax{1/[S]}＋1/Vmax([S]為沒(méi)食子酸濃度)可得到荔枝果肉PPO的Km值與Vmax值分別為(26.033±2.188)mmol/L、(34.816±3.733)g/(L·min)。

2.5 荔枝果肉PPO的熱穩(wěn)定性及熱失活參數(shù)

由圖4可見，隨著溫浴溫度的提高(40～80℃)，PPO活性下降幅度增加。溫浴溫度為8 0℃時(shí)，溫浴前15min，荔枝肉PPO相對(duì)酶活下降幅度較大(PPO相對(duì)酶活僅剩余40%左右)，溫浴60min時(shí)PPO相對(duì)酶活僅剩余20%左右。因此，果蔬生產(chǎn)中常采用的高溫短時(shí)熱處理工藝有利于抑制荔枝PPO酶活性，防止由于PPO引起的荔枝加工過(guò)程中的褐變反應(yīng)。

圖4 荔枝果肉PPO的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of PPO from litchi

按照Galani等[11]方法，荔枝果肉PPO在40、50、60、70℃和80℃條件反應(yīng)10min的熱失活參數(shù)如表1所示。在40～80℃，荔枝肉PPO熱失活的活化能(ΔE#)為4202.8J/mol，焓變(ΔH#)的平均值為1434.1J/mol，吉布斯自由能(ΔG#)的平均值為102.4kJ/mol，熵變(ΔS#)的平均值為－303.3J/(mol·K)。

表1 荔枝果肉PPO熱失活參數(shù)Table 1 Transition state parameters for heating inactivation of PPO from litchi

熱失活ΔH#表示的是PPO熱失活形成過(guò)渡態(tài)時(shí)非共價(jià)鍵的斷裂數(shù)目[24]，可用于評(píng)價(jià)PPO熱穩(wěn)定性。荔枝果肉PPO熱失活ΔH#低于西紅柿(21～29kJ/mol)[25]、蘑菇(49.8～89.3kJ/mol)[26]、紫甘薯(5.5kJ/mol)[16]等中PPO熱失活ΔH#，說(shuō)明荔枝果肉PPO熱穩(wěn)定性較差。荔枝果肉PPO熱失活參數(shù)結(jié)果再次表明，荔枝生產(chǎn)加工時(shí)可采用高溫處理來(lái)抑制荔枝果肉PPO引起的褐變反應(yīng)。

2.6 pH值對(duì)PPO活性的影響

如圖5所示，荔枝果肉PPO在pH5.0～6.0時(shí)相對(duì)酶活最小，隨著pH值的上升(pH ＞6.0)或pH值的下降(pH 4.0～5.0)，荔枝果肉PPO相對(duì)酶活相對(duì)變大，此結(jié)果與反應(yīng)pH值對(duì)荔枝果肉PPO相對(duì)酶活的影響結(jié)果相似。因此，調(diào)節(jié)pH值能有效抑制PPO相對(duì)酶活，可以減輕荔枝加工中的酶褐變的程度。在荔枝加工過(guò)程中，為了防止荔枝的酶褐變，可用適當(dāng)濃度的酸溶液護(hù)色(pH5.0～6.0)。

圖5 pH值對(duì)PPO活性的影響Fig.5 Effect of pH on PPO stability

2.7 荔枝酒PPO活性變化與荔枝酒褐變的相關(guān)性

圖6 荔枝酒PPO活性變化與荔枝酒褐變的相關(guān)性Fig.6 Correlation between the change of PPO activity and the browning of litchi wine

將荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中色澤變化與其PPO相對(duì)酶活變化如圖6所示，將荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中褐變與其PPO相對(duì)酶活變作相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，二者變化呈正相關(guān)(r =＋0.994，雙尾檢驗(yàn))，而且相關(guān)性極顯著(P＜0.01)。分析結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中荔枝酒色澤的變化是由于PPO活性的變化所致，也就是說(shuō)，荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中的褐變?cè)蛑饕褪瞧銹PO催化的酶促褐變。果蔬貯藏加工期間褐變的原因，很多研究認(rèn)為主要是酶促褐變，即果蔬中的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下被氧化的結(jié)果[2-6,8,20,27-28]。這一結(jié)果與Iyengar等[5]、郁志芳[8]、Langdon[27]及馮衛(wèi)華[28]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

荔枝PPO最適底物為沒(méi)食子酸，荔枝中PPO存在同功酶。以沒(méi)食子酸為底物，荔枝PPO最適反應(yīng)pH8.0，最適反應(yīng)溫度50℃，Km為26.033mmol/L，Vmax為34.816 g/(L·min)。荔枝PPO對(duì)酸堿、對(duì)熱穩(wěn)定性較差。因此，低溫貯藏和高溫?zé)崽幚砜捎行б种评笾υ谫A藏和加工中的PPO褐變反應(yīng)，并且荔枝加工過(guò)程中可以用酸(pH5.0～6.0)護(hù)色。荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中色澤變化與其PPO活性變化呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，荔枝酒發(fā)酵過(guò)程中的褐變主要是由荔枝PPO引起的酶促褐變。

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Browning Control of Litchi and Litchi Wine

FENG Wei-hua，LIN Li-mian，QIN Yan
(College of Light Industry and Food, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

In the present study, litchi and litchi wine were used as the materials to study the properties of polyphenol oxidase(PPO) in litchi, and explore browning mechanisms and controlling strategies of litchi wine during fermentation process. The isoenzymes of PPO were observed in litchi and the optimal substrate of PPO in litchi was gallic acid. The optimal pH and temperature for PPO from litchi were 8.0 and 50 ℃ using gallic acid as the substrate. Kinetic parameters such as Kmand Vmaxof PPO from litchi were 26.033 mmol/L and 34.816 g/(L·min), respectively. The PPO from litchi was not stable at the conditions of 50 － 80 ℃, strong acid and strong alkali. Higher PPO activity in litchi was the major browning cause of litchi wine during fermentation process. Therefore, low-temperature storage and heating treatment can effectively inhibit the browning of litchi and litchi wine.

litchi；litchi wine；polyphenol oxidase；browning

TS201.1

A

1002-6630(2011)04-0246-05

2010-04-12

國(guó)家科技部星火計(jì)劃項(xiàng)目子課題( 2007EA781003)；廣東省科技廳項(xiàng)目(2007B023001002)；廣州市科技廳項(xiàng)目(2007Z1-E0091)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009C6-I051)；仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院項(xiàng)目(G2360280)

馮衛(wèi)華(1968—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣哔A藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。E-mail：fengwh68@163.com