轉(zhuǎn)基因玉米59122品系的特異性檢測

許文濤，楊 蓉，陸 姣，張 南，羅云波，何 景，黃昆侖,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)監(jiān)督測試中心(北京)，北京 100083)

轉(zhuǎn)基因玉米59122品系的特異性檢測

許文濤1,2，楊 蓉2，陸 姣1，張 南1,2，羅云波1，何 景1,2，黃昆侖1,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)監(jiān)督測試中心(北京)，北京 100083)

使用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆了轉(zhuǎn)基因玉米59122的外源基因與玉米基因組之間的兩段側(cè)翼序列，并據(jù)其左側(cè)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了具品系特異性的引物，運(yùn)用半巢式PCR技術(shù)建立了59122的品系特異性二重PCR檢測方法，擴(kuò)增片段100bp，橫跨pat終止子與轉(zhuǎn)基因玉米側(cè)翼基因之間。以轉(zhuǎn)基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603，轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready和轉(zhuǎn)基因油菜GT73等為材料，證明本方法與其他轉(zhuǎn)基因作物具有高特異性。本方法在檢測59122時(shí)，確定出連接體系中線性DNA的最佳質(zhì)量濃度為1ng/μL左右，檢出限達(dá)到0.1%，靈敏度為38個(gè)單倍體基因組拷貝數(shù)。因此可準(zhǔn)確、快速、高效地檢測轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品，或作為常規(guī)PCR定性檢測后的驗(yàn)證方法。

轉(zhuǎn)基因作物；品系特異性檢測；半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；二重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

隨著轉(zhuǎn)基因作物的不斷商業(yè)化，新型轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題逐漸成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。為此，各國都加強(qiáng)了管理[1]。除了向公眾公布相關(guān)信息、增加透明度外，關(guān)鍵問題是建立相應(yīng)的科學(xué)檢測方法來分析鑒別轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)[2]很多，分為基于核酸水平的檢測技術(shù)、基于蛋白水平的檢測技術(shù)以及其他檢測技術(shù)。在定性檢測中基于蛋白水平的檢測[3]不能區(qū)別轉(zhuǎn)入同一蛋白的兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)于經(jīng)過深加工、抗原發(fā)生變性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也無法檢測，通常不作為首選方法。而基因芯片[4]這一類檢測技術(shù)尚處研究階段并不成熟。因此，應(yīng)用最廣的為基于核酸水平的PCR定性檢測技術(shù)，包括對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用元件檢測的篩查法[5]，對(duì)目的基因進(jìn)行檢測的基因特異性方法[6]，對(duì)轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行檢測的構(gòu)建特異性方法[7]以及對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中側(cè)翼序列進(jìn)行檢測的轉(zhuǎn)化事件特異法[8]。與轉(zhuǎn)化事件特異法相比，前3種方法的特異性都比較低，多會(huì)出現(xiàn)假陽性以及無法辨別具有相同外源DNA的不同轉(zhuǎn)基因作物等問題。另外在進(jìn)出口貿(mào)易中，除了要確定送檢商品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，還要確定該成分是否被輸入國所批準(zhǔn)，即進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件鑒定，該項(xiàng)檢測內(nèi)容已經(jīng)成為國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢[2]。

轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化的主要改良性狀為抗蟲和耐除草劑等[1,8]，轉(zhuǎn)基因玉米59122兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特異性轉(zhuǎn)化事件，是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將質(zhì)粒載體PHP17662導(dǎo)入玉米轉(zhuǎn)化事件Hi-Ⅱ基因組篩選得到的基因改造玉米。PHP17662包含選自Bacillus thuringiensis strain PS149B1的cry34Ab1與cry35Ab1(delta-endotoxin)抗蟲基因以及抗除草劑pat(phosphinothricin-N-acetyltransferase，膦酸乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GeneBank中獲得的ubiquitin啟動(dòng)子(登錄號(hào)CS165465)和pat(登錄號(hào)DQ156557)基因序列，利用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(inverse polymerase chain reaction，I-PCR)來確定轉(zhuǎn)基因玉米59122的側(cè)翼序列。隨后，在側(cè)翼序列相鄰的T-DNA(轉(zhuǎn)基因載體)和玉米基因組上各設(shè)計(jì)一條引物，此對(duì)引物就可以對(duì)該轉(zhuǎn)基因玉米59122進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件特異性檢測。建立定性檢測體系，并驗(yàn)證該檢測方法的特異性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

轉(zhuǎn)基因玉米59122及其非轉(zhuǎn)基因親本 美國DuPont公司；轉(zhuǎn)基因玉米MON8 63、MON8 10、GA21、NK603、轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready、轉(zhuǎn)基因油菜GT73孟山都公司；限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP 大連寶生物工程有限公司；Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶 美國Promega公司；RNase A酶、DNA Marker DL 2000、CTAB、Tris、EDTA、IPTG、氨芐青霉素等 美國Sigma公司；蛋白胨、酵母粉等制備細(xì)菌培養(yǎng)基試劑 鼎國公司；DNA回收試劑盒 北京佰億新創(chuàng)科技有限公司。

DU 640核酸蛋白分析儀 美國Beckman Coulter公司；UV-2450 紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；GelDoc-It 紫外凝膠成像儀 美國UVP公司。

1.2 制備不同轉(zhuǎn)基因含量的59122玉米樣品

將轉(zhuǎn)基因玉米59122和其非轉(zhuǎn)基因親本按質(zhì)量比相混合，制成6個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量(10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%)的樣品。

1.3 基因組DNA的提取[3]

稱取100mg于液氮中研磨成粉末狀的種子材料，按CTAB法提取樣品總DNA。提取的總DNA溶于30～50μL ddH2O中，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定其濃度，最終稀釋成100ng/μL和50ng/μL備用。用紫外分光光度計(jì)測定DNA溶液的OD260與OD280，并計(jì)算OD260/OD280的比值來評(píng)價(jià)提取的質(zhì)量，本研究中所用DNA其OD比值均在1.6～1.9范圍。

1.4 反向PCR(I-PCR)

1.4.1 總DNA的酶切與酶切片段的環(huán)化

取約1μg基因組DNA加入1×緩沖液和10U限制性內(nèi)切酶形成60μL的反應(yīng)體系，選擇在ubiquitin內(nèi)含子內(nèi)部沒有酶切位點(diǎn)的常用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ以及在pat基因序列中沒有酶切位點(diǎn)的常用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ，分別于37℃消化玉米基因組3h，接著用酚-氯仿/異戊醇(Tris-飽和酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1)抽提法純化DNA(除去由限制性內(nèi)切酶釋放的短的寡聚核苷酸)，最后將基因組DNA溶于25μL ddH2O中。此后向含約16ng經(jīng)過消化的基因組DNA中加入1×緩沖液，6U T4連接酶形成50μL反應(yīng)體系，在T4連接酶的作用下于4℃過夜連接成環(huán)。于75℃處理15min后洗滌沉淀溶于20μL ddH2O中。

1.4.2 反向PCR引物

圖1 59122玉米基因整合圖譜Fig.1 Schematic diagram of the genomic arrangement of event 59122 maize

反向PCR的引物Ubi-F1/R1/R2和Pat-F1/R1/R2分別根據(jù)玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子和pat基因設(shè)計(jì)；由ABI Prism Primer Express Version 2.0軟件設(shè)計(jì)，寶生物工程(大連)有限公司合成。Ubi-F1/R1/R2用以擴(kuò)增右邊側(cè)翼序列，Pat-F1/R1/R2用以擴(kuò)增左邊側(cè)翼序列。玉米自身Ivr[9]基因作為內(nèi)源參照。

1.4.3 反向PCR

反應(yīng)體系(30μL)：1×Pyrobest緩沖液；0.2mmol/L dNTP mix；0.3μmol/L正向引物和反向引物；2.5U Pyrobest DNA 聚合酶；2μL連接成環(huán)的DNA。

第一輪反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。第二輪反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火40s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

取兩次PCR產(chǎn)物各10μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(含有0.1μg/mL EB)，用凝膠成像儀掃描并進(jìn)行TIFF圖像分析。

1.4.4 PCR產(chǎn)物測序

為保證測序結(jié)果的真實(shí)性，本實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T Easy載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定等幾個(gè)步驟后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果之后，送于寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.5 轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測

根據(jù)左邊側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)D-F1/R1，其中LD-F1位于CaMV35S終止子內(nèi)部，LD-R1位于玉米基因組內(nèi)部，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100bp。同時(shí)以玉米自身Ivr[9]基因作為內(nèi)源參照，建立二重PCR體系對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米59122進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件特異性定性檢測。

二重PCR反應(yīng)體系(30μL)：1×PCR緩沖液；0.2mmol/L dNTP mix；2.5U Taq DNA聚合酶；1.5mmol/L MgCl2；引物Ivr-F1與引物Ivr-R1各0.3μmol/L；引物L(fēng)D-F1與引物L(fēng)D-R2各0.6μmol/L；100ng模板DNA。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性10s，59℃退火20s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。所有PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定側(cè)翼序列

基因組DNA經(jīng)四種限制性內(nèi)切酶消化后，分別用半巢式引物Ubi-F1/R1/R2和Pat-F1/R1/R2擴(kuò)增。結(jié)果表明，基因組DNA用BamHⅠ和Hind Ⅲ消化后，經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增和電泳檢測沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶；而基因組經(jīng)SacⅠ消化，用半巢式引物Ubi-F1/R1/R2擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)得到大于3kb的條帶。與此同時(shí)，經(jīng)EcoRⅠ消化的基因組，以Pat-F1/R1/R2為引物擴(kuò)增，電泳檢測出大于2kb的一條帶。

回收擴(kuò)增條帶，分別將兩個(gè)片段克隆到pGEM T-Easy載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過篩選、酶切鑒定、測序分析后結(jié)果表明，基因組經(jīng)SacⅠ消化，反向引物Ubi-F1/R1/R2擴(kuò)增后，獲得3388bp片段，經(jīng)EcoRⅠ消化，反向引物Pat-F1/R1/R2擴(kuò)增后，獲得2525bp片段。

通過DNAMAN軟件和NCBI數(shù)據(jù)比對(duì)所測序列，分析S a cⅠ酶切位點(diǎn)前后的序列，推測出酶切位點(diǎn)前1361～1643總共282個(gè)堿基序列來自未知的玉米基因組。測序及分析見圖2。

圖2 反向PCR(I-PCR)擴(kuò)增右邊側(cè)翼序列Fig.2 Inverse PCR (I-PCR) amplified right flanking sequence

用同樣的分析方法分析左側(cè)翼序列，推測出酶切位點(diǎn)后783～1896之間的1114個(gè)堿基序列來自未知的玉米基因組。測序及分析見圖3。

圖3 反向PCR(I-PCR)擴(kuò)增左邊側(cè)翼序列Fig.3 Inverse PCR (I-PCR) amplified left flanking sequence

為了得到連接體系中線性DNA的最佳質(zhì)量濃度，本實(shí)驗(yàn)在連接體系中了添加不同量的線性DNA。通過后續(xù)的PCR確定線性DNA的適宜質(zhì)量濃度為1ng/μL左右。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米59122轉(zhuǎn)化事件特異性定性檢測

為了檢測體系的特異性，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以轉(zhuǎn)基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603、轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready和轉(zhuǎn)基因油菜GT73為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，大小為100bp的轉(zhuǎn)化事件特異性擴(kuò)增產(chǎn)物僅在以轉(zhuǎn)基因玉米59122為模板時(shí)出現(xiàn)，而以其他轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件，轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready和轉(zhuǎn)基因油菜GT73為模板時(shí)沒有擴(kuò)增出現(xiàn)該特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)，大小為226bp的玉米內(nèi)源參照基因Ivr[9]的擴(kuò)增條帶在所有以玉米為模板的擴(kuò)增中均出現(xiàn)，這說明PCR反應(yīng)體系沒有受到抑制(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)化事件特異性定性檢測體系的特異性Fig.4 Specificity of event-specific qualitative detection

此外，為了驗(yàn)證該檢測體系的靈敏度。以按質(zhì)量比混合制備所得的6種不同轉(zhuǎn)基因含量(10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%)的樣品DNA為模板進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，Ivr[9]基因在所有的樣品中均可以檢測到，側(cè)翼序列在除了0.05%含量的樣品外均可以檢測到(圖5)。這表明最低檢測限至少為0.1%，根據(jù)玉米基因的單拷貝質(zhì)量大約為2.73pg[10]，檢測下限大約為38個(gè)單倍體拷貝。

圖5 轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測體系的靈敏度Fig.5 Sensitivity of event-specific qualitative detection

3 討 論

轉(zhuǎn)化事件特異法是通過擴(kuò)增側(cè)翼序列(受體基因組和插入DNA的連接區(qū)域)來鑒定含有相同外源DNA的不同轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism，GMO)[8]。側(cè)翼序列對(duì)于被檢測的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有很好的特異性，所以當(dāng)一個(gè)外源基因能引起幾種不同插入情況時(shí)，就可擴(kuò)增其側(cè)翼序列。為了快速獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列片段的反向PCR技術(shù)[11]確定了轉(zhuǎn)基因玉米59122的側(cè)翼序列。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性檢測中，常采用特異性較高的巢式PCR與半巢式PCR[12]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩套半巢式引物進(jìn)行了兩輪PCR擴(kuò)增。經(jīng)電泳檢測，只有第二輪PCR擴(kuò)增能檢測到擴(kuò)增條帶。這說明半巢式PCR能夠增加反應(yīng)的特異性，它不但減少了假陽性的出現(xiàn)，而且使檢測的下限下降了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。另外黃昆侖等[13]在應(yīng)用巢式PCR和半巢式PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工品的研究中也表明，巢式PCR和半巢式PCR的靈敏度高，在DNA受到嚴(yán)重破壞的產(chǎn)品中仍能檢測出轉(zhuǎn)基因成分。

另外，在轉(zhuǎn)基因檢測中多重PCR也常被采用，它不僅可以提高檢測效率，節(jié)省時(shí)間和試劑，而且可以提供內(nèi)部對(duì)照，只是模板的數(shù)量與質(zhì)量[14]。本實(shí)驗(yàn)建立了檢測轉(zhuǎn)基因玉米59122的二重PCR體系。理論上，多重PCR有一些缺陷[15]：擴(kuò)增每種目的片段需要的反應(yīng)條件如溫度、試劑濃度等可能不同；在同一體系內(nèi)擴(kuò)增多個(gè)目的片段時(shí)，起始拷貝數(shù)多的片段會(huì)占優(yōu)勢，片段間產(chǎn)生競爭。因此，建立多重PCR體系需要仔細(xì)的摸索驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過反復(fù)摸索后，成功地建立了轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化事件特異性二重定性PCR檢測體系。

本研究通過驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測體系的特異性[13]和靈敏性，說明特異性引物L(fēng)D-F1/R1用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米59122轉(zhuǎn)化事件特異性定性檢測是可行的，同時(shí)，成功地建立了針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物59122的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測體系，這將為準(zhǔn)確、快速、高效地檢測轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)制定和試劑盒的開發(fā)提供技術(shù)支持，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。

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Event-specific Transgenic Detection of Genetically Modified Maize 59122 with Flanking Sequence

XU Wen-tao1,2，YANG Rong2，LU Jiao1，ZHANG Nan1,2，LUO Yun-bo1，HE Jing1,2，HUANG Kun-lun1,2,*
(1. Food Safety Laboratory, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University,Beijing 100083, China；2. Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms (Beijing),Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

We report the cloning of two flanking sequence of the integrated gene construct of genetically modified maize 59122 by inverse PCR method and the design of even-specific primers based on the left flanking sequence with the aim of developing of a duplex PCR assay for the event-specific transgenic detection of genetically modified maize 59122 using semi-nested PCR,result ing in an amplification fragment of 100 bp in length stretching from the terminator of the pat gene to the 59122 flanking genes.This assay has been successfully applied to detect genetically modified maizes 59122, MON863, MON810, GA21, NK603,genetically modified Roundup Ready soybeans and genetically modified oilseed rape GT73, with high specificity. The optimum concentration of linear DNA in a connection system for detecting genetically modified maize 59122 by this assay was around 1 ng/μL, which exhibited a limit of detection of 0.1% and a sensitivity of 38 copies of haploid genome. Therefore, the developed PCR assay is applicable to detect genetically modified maize and its derivates accurately, fast and efficiently, and can serve to verify routine PCR qualitative detection.

genetically modified crop；event-specific transgenic detection；semi-nested polymerase chain reaction；inverse polymerase chain reaction；duplex polymerase chain reaction

Q789；S513

A

1002-6630(2011)04-0139-04

2010-03-13

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z440)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800770)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2008ZX08012-001)

許文濤(1979—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：cauxwt@yahoo.cn

*通信作者：黃昆侖(1968—)，男，教授，博士， 研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：hkl009@163.com