• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新霉素ELISA檢測方法的建立

    2011-10-27 07:29:46劉沙洲桑小雪歐陽華學(xué)雷紹榮白林含
    食品科學(xué) 2011年14期
    關(guān)鍵詞:新霉素反應(yīng)時間抗生素

    劉沙洲,桑小雪,歐陽華學(xué),雷紹榮,白林含,*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065;2.成都市食品藥品檢測中心,四川 成都 610045;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心,四川 成都 610066)

    新霉素ELISA檢測方法的建立

    劉沙洲1,2,桑小雪1,歐陽華學(xué)3,雷紹榮3,白林含1,*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065;2.成都市食品藥品檢測中心,四川 成都 610045;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心,四川 成都 610066)

    目的:比較直接和間接競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的優(yōu)缺點,建立新霉素殘留ELISA檢測方法。方法:利用自制的新霉素多克隆抗體,采用直接競爭和間接競爭ELISA方法檢測新霉素殘留,并比較兩種方法的優(yōu)缺點。結(jié)果:新霉素抗血清和慶大霉素的交叉反應(yīng)率為2.04%,和卡那霉素的交叉反應(yīng)率為0.02%,和氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。初步測試新霉素間接競爭ELISA法的準(zhǔn)確性和回收率。板內(nèi)誤差小于4%,板間誤差小于11%,回收率為135.5%~191.3%。直接競爭和間接競爭ELISA方法的檢測極限分別為28.58ng/mL和51.74ng/mL,達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。結(jié)論:建立了直接競爭和間接ELISA吸附檢測方法,條件優(yōu)化更成功的間接競爭ELISA可用于開發(fā)新霉素檢測試劑盒。

    新霉素;多克隆抗體;競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA);方法建立

    從全球來看,在食用動物中限用、禁用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢。在1997年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織(food and agriculture organization,F(xiàn)AO)就要求停止或禁止使用抗生素飼料添加劑,1998年12月又提議在1 0年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。2 0 0 4年,WHO、FAO和世界動物衛(wèi)生組織(office international des epizooties,OIE)聯(lián)合召開了一次專題討論會,討論了非人用抗生素的使用和抗生素的耐藥性問題。發(fā)達(dá)國家和有關(guān)國際組織都對抗生素在動物飼料中使用進(jìn)行了越來越嚴(yán)格的限制。特別是不準(zhǔn)將人用抗生素用于動物,在食用動物中禁用、限用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為世界共識[1-2],是大勢所趨。

    然而我國長期存在濫用、不合理使用抗生素飼料添加劑的情況,動物性食品中抗生素殘留的問題十分嚴(yán)重,不僅給消費者帶來健康上的損害,而且阻礙了我國動物產(chǎn)品的出口。近幾年,我國不斷加強對在食用動物中使用抗生素現(xiàn)象的監(jiān)督管理,以最大限度地減少對食品安全和人類健康的威脅。除了制訂、修訂法律法規(guī)、建立健全監(jiān)督檢驗體系、開展殘留監(jiān)控工作外,還不斷對殘留的限量作出規(guī)定。2002年,農(nóng)業(yè)部重新修訂發(fā)布獸藥在動物性食品中的最高殘留限量[3],使規(guī)定限量的獸藥達(dá)到134種,主要是抗生素類藥物,其中就包括新霉素。

    酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)靈敏度高、特異性強、可用于大量樣品的快速篩選、儀器化程度低、檢測速度快、樣品前處理相對簡單、價格低和適于開發(fā)成攜帶方便的試劑盒等優(yōu)點,是國內(nèi)獸藥檢測現(xiàn)場監(jiān)控、大量樣本篩查的主要方法。用于抗生素殘留檢測的主要方法有直接競爭ELISA法和間接競爭ELISA法,本實驗擬比較直接和間接ELISA法的優(yōu)缺點,以建立新霉素殘留ELISA檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    KLH-NEO抗血清、包被抗原BSA-NEO 自制[4];牛血清白蛋白、HRP-NEO、新霉素硫酸鹽、慶大霉素硫酸鹽、卡那霉素硫酸鹽、氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素鹽酸鹽 上海華舜生物工程有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG 博士德生物工程有限公司。

    0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L十二水磷酸氫二鈉、鄰苯二胺、過氧化氫、2mol/L硫酸、pH7.4磷酸緩沖鹽水-0.05% Tween20(簡稱PBS-Tween 20)、pH9.6碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)。

    3550型酶標(biāo)測定儀 美國Bio-RAD公司;酶標(biāo)板成都博瑞克生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 直接競爭ELISA反應(yīng)條件的建立

    1.2.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

    采用方陣測定法,包被不同質(zhì)量濃度的抗血清和陰性血清,直接測定HRP-NEO,以O(shè)D45nm接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

    1.2.1.2 最佳反應(yīng)時間

    設(shè)定抗血清和HRP-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100、120min,選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

    1.2.1.3 采用直接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和酶標(biāo)新霉素HRPNEO進(jìn)行直接競爭ELISA反應(yīng),然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值,B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo),新霉素質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值,可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

    1.2.2 間接競爭ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

    1.2.2.1 酶標(biāo)抗體工作用量的選擇

    包被一抗直接測二抗,以O(shè)D450nm值接近于1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋度為最適工作用量。

    1.2.2.2 最佳包被抗原用量與最佳反應(yīng)血清用量

    采用方陣測定法,加入BSA-NEO作為包被抗原,再加入KLH-NEO抗血清和陰性血清,按ELISA操作程序進(jìn)行,最后測定OD450nm值,以O(shè)D450nm值接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

    1.2.2.3 最佳反應(yīng)時間

    設(shè)定抗血清和BSA-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100min,選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

    1.2.2.4 采用間接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和抗血清進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng),然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值,B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo),新霉素質(zhì)量濃度常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值,可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

    1.2.3 交叉反應(yīng)的測定[5]

    采用間接競爭ELISA法測定慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素和KLH-NEO抗血清的結(jié)合反應(yīng)。新霉素的I50與這些抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測干擾程度的大小。

    1.2.4 方法準(zhǔn)確性的測定

    人工添加新霉素到PBS空白液中,使其在PBS中的終質(zhì)量濃度為60、250ng/mL。

    以板內(nèi)誤差及板間誤差來表示該方法的精確度。板內(nèi)測定為同一酶標(biāo)板上同一樣本若干孔的平均值,板間測定為不同酶標(biāo)板上幾次測定結(jié)果的平均值,本實驗中板內(nèi)誤差和板間誤差均取3次測定的平均值為準(zhǔn)。

    1.2.5 回收率的測定

    回收率測定實驗主要檢驗檢測方法的可靠性。將新霉素質(zhì)量濃度為60、250ng/mL的PBS溶液各取0.1mL進(jìn)行間接競爭ELISA。同時以沒有加入新霉素的PBS作為正對照。測定時每個樣品質(zhì)量濃度設(shè)定3個重復(fù),并重復(fù)3次實驗。然后進(jìn)行間接競爭ELISA測定OD450nm,計算抑制率,代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程,計算NEO的含量,并根據(jù)下式計算回收率:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 直接競爭ELISA法

    2.1.1 反應(yīng)條件的建立

    2.1.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

    表1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比Table 1 Determination of optimal coating antiserum concentration and HRP/NEO ratio

    由表1可知,在抗血清用量為1:1000、HRP-NEO配比為1:500時,OD450nm最大,初步確定最佳包被抗血清用量1:1000、最佳HRP-NEO配比1:500。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

    2.1.1.2 最佳反應(yīng)時間

    圖1 直接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.1 Determination of optimal reaction time of dc-ELISA

    由圖1可知,反應(yīng)時間60min時,顯色效果最好,因此確定直接競爭ELISA法的顯色時間為60min。

    2.1.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    圖2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(直接競爭ELISA法)Fig.2 Standard curve for neomycin determination by dc-ELISA

    如圖2所示,B/B0達(dá)到90%時的新霉素質(zhì)量濃度為該實驗的最低檢測極限,根據(jù)回歸方程,計算出該直接競爭ELISA檢測方法的檢測限是28.58ng/mL,達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。

    2.2 間接競爭ELISA法

    2.2.1 反應(yīng)條件的確立

    2.2.1.1 酶標(biāo)二抗工作用量

    表2 酶標(biāo)二抗用量的確定Table 2 Determination of optimal enzyme labeled secondary antibody concentration

    由表2可知,二抗稀釋倍數(shù)為2000的時候,OD450nm值最接近1.0。所以,確定二抗的最佳用量為1:2000。

    2.2.1.2 最佳包被抗原質(zhì)量濃度與最佳反應(yīng)血清用量

    由表3可知,抗血清1:2000稀釋、抗原1:400稀釋時,OD450nm值接近1.0,且相近數(shù)據(jù)差別不大。所以,確定KLH-NEO抗血清1:2000稀釋、BSA-NEO抗原1:400稀釋。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

    表3 包被抗原用量和血清用量的確定Table 3 Determination of optimal coating antigen and serum concentrations

    2.2.1.3 最佳反應(yīng)時間

    圖3 間接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.3 Determination of optimal reaction time of idc-ELISA

    由圖3可知,反應(yīng)時間為60min時,顯色效果最好。

    2.2.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    圖4 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(間接競爭ELISA法)Fig.4 Standard curve for neomycin determination by idc-ELISA

    如圖4所示,根據(jù)回歸方程,計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線中I50為174.58μg/mL。間接競爭ELISA檢測方法的檢測極限是51.74ng/mL,達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)對新霉素規(guī)定的500 μg/kg MRL檢測限。

    2.2.3 新霉素抗體和其他抗生素的交叉反應(yīng)率

    表4 新霉素抗體和其他抗生素交叉反應(yīng)率實驗結(jié)果Table 4 Cross-reaction rates of prepared anti-neomycin antibodies with other antibiotics

    新霉素的I50與其他抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測的干擾程度大小。本實驗選取了5種抗生素來進(jìn)行交叉反應(yīng)率的測定。其中,慶大霉素、卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素,和新霉素屬同一大類;由表4可知,新霉素抗體和慶大霉素及卡那霉素存在一定的交叉反應(yīng),與青霉素、四環(huán)素、紅霉素幾乎沒有交叉反應(yīng)(<0.01%),這說明抗體的特異性好。新霉素抗體與慶大霉素、卡那霉素存在交叉反應(yīng)是因為慶大霉素、卡那霉素和新霉素同屬氨基糖苷類抗生素,存在結(jié)構(gòu)上的相似性[6]。而青霉素屬內(nèi)酰胺類抗生素;四環(huán)素屬四環(huán)素類抗生素;紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[7]。

    2.2.4 方法準(zhǔn)確性的考察

    表5 變異系數(shù)實驗結(jié)果Table 5 Coefficients of variation for inter-plate and intra-plate precision of idc-ELISA

    如表5所示,NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時,3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為1.18%,板間變異系數(shù)為10.7%;NEO添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時,3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為3.88%,板間變異系數(shù)為4.39%;說明該方法的穩(wěn)定性較好。

    2.2.5 回收率

    表6 回收率考察實驗結(jié)果Table 6 Results of spike recovery test of idc-ELISA

    如表6所示,NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時的回收率不及添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時的回收率理想,可能因為60ng/mL已接近于該方法的檢測限51.29ng/mL,導(dǎo)致誤差較大。

    3 討 論

    本實驗采用直接競爭和間接競爭ELISA初步建立了新霉素殘留的酶聯(lián)免疫測定方法。 兩種方法檢測極限都達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。在本實驗進(jìn)行的3次實驗中,間接競爭ELISA法的穩(wěn)定性明顯的強于直接競爭ELISA法,這可能與本實驗室制備的新霉素多克隆抗體質(zhì)量有關(guān)??贵w是酶聯(lián)免疫測定中最關(guān)鍵的成分,提高檢測方法的穩(wěn)定性、靈敏性,關(guān)鍵在于提高抗體的質(zhì)量,要解決這個問題,首先可以從制備新霉素單克隆抗體入手[8-12]。相對于多克隆抗體,單克隆抗體具有更高的特異性、純度、均質(zhì)性和重復(fù)性。

    建立一個成熟的酶聯(lián)免疫測定方法,需要進(jìn)行穩(wěn)定性實驗,用大量的實驗數(shù)據(jù)考察方法的交叉反應(yīng)率、板內(nèi)誤差、板間誤差和回收率。在此基礎(chǔ)上還需要增加檢測基質(zhì)的種類[13],進(jìn)行樣品添加實驗,如在牛奶[14]、動物組織[15]中人工添加新霉素后再測定回收率??傮w來說,要得到一個成熟穩(wěn)定的檢測體系,在抗體、基質(zhì)等方面還有許多的工作要做。

    [1] 張彥明, 佘銳萍. 動物性食品衛(wèi)生學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 73-86.

    [2] 趙紅梅, 金升藻. 濫用抗生素對人畜的危害及對策研究[J]. 國外醫(yī)藥: 抗生素分冊, 2003, 24(4): 164-167.

    [3] 農(nóng)業(yè)部第235號公告. 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]. 2002.

    [4] 劉沙洲, 黃非, 王麗麗, 等. 新霉素酶聯(lián)免疫檢測方法的研究: 新霉素抗體的制備[J]. 食品科技, 2007(3): 208-211.

    [5] 石德時, 王桂枝, 畢丁仁, 等. 氯霉素抗體的制備[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001, 20(5): 463-465.

    [6] LOOMANS E E, Van WILTENBURG J, KOETS M, et al. Neomin as an immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin, and neomycin in milk[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2003, 51(3): 587-593.

    [7] STOLKER A A, BRINKMAN U A. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals: a review[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1067(1/2): 15-33.

    [8] 葛紅霞. 單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2007(3):9-10.

    [9] 譚雅麗, 石德時, 王桂枝, 等. 抗氯霉素單克隆抗體的制備及鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2000(增刊1): 63-65.

    [10] 魏書林, 曹振, 沈建忠, 等. 抗氯霉素單克隆抗體的制備和鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志, 2004, 40(8): 62-64.

    [11] 王選年, 楊艷艷, 李青梅, 等. 鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其特性[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002(6): 30-33.

    [12] 蔡勤仁, 曾振靈, 楊桂香. 恩諾沙星單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(7): 1060-1064.

    [13] 許艇, 秦治翔, 王文珺, 等. 甲萘威ELISA方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2004, 10(5): 569-572.

    [14] 李利東, 宓曉黎, 袁建興, 等. 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒應(yīng)用于牛奶中四環(huán)素殘留的測定[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2004(2): 52-54.

    [15] 關(guān)嶸. 應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究[J].檢驗檢疫科學(xué), 2002, 12(4): 5-10.

    Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Neomycin

    LIU Sha-zhou1,2,SANG Xiao-xue1,OUYANG Hua-xue3,LEI Shao-rong3,BAI Lin-han1,*
    (1. School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China;2. Food and Drug Testing Center, Chengdu 610045,China;3. Analysis and Testing Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

    In this study, we describe the advantages and disadvantages of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) and indirect competitive ELISA (idc-ELISA) and ELISA methods for the detection of neomycin. Antineomycin polyclonal antibodies were prepared and used to detect neomycin by dc-ELISA and idc-ELISA. The cross-reaction rates of prepared anti-neomycin polyclonal antibodies with gentamincin and kanamycin were 2.04% and 0.02%, respectively,and with ampicillin, erythromycin and tetracycline all less than 0.01%. The accuracy and recovery of idc-ELISA were tested with an intra-plate error of less than 4%, an inter-plate error of less than 11% and a recovery between 135.5% and 191.3%. The detection limits of dc-ELISA and idc-ELISA were 28.58 ng/mL and 51.74 ng/mL, respectively, both of which were below the national maximum residue limit (MRL) of 500μg/kg. Therefore, a dc-ELISA method and an idc-ELISA method to detect neomycin have successfully established. Further, the idc-ELISA method where the working conditions were better optimized can be used for the development of neomycin test kit.

    neomycin;polyclonal antibodies;competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);method establishment

    S854

    A

    1002-6630(2011)14-0227-05

    2010-04-26

    四川省公益性研究計劃項目(2008NG004)

    劉沙洲(1983—),女,碩士,主要從事微生物學(xué)與生物檢測研究。E-mail:liushazhou566@sina.com

    *通信作者:白林含(1970—),女,教授,博士,主要從事微生物分子生物學(xué)研究。E-mail:bailinhan@scu.edu.cn

    猜你喜歡
    新霉素反應(yīng)時間抗生素
    體外新霉素?fù)p傷HEI-OC-1細(xì)胞的作用和機制研究
    皮膚受傷后不一定要用抗生素
    中老年保健(2021年6期)2021-08-24 06:53:34
    硫脲濃度及反應(yīng)時間對氫化物發(fā)生-原子熒光法測砷影響
    抗生素的故事
    HPLC-CAD法測定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有關(guān)物質(zhì)
    用反應(yīng)時間研究氛圍燈顏色亮度對安全駕駛的影響
    汽車零部件(2018年5期)2018-06-13 08:42:18
    貓抓病一例及抗生素治療
    童年重負(fù):“被攝入”的抗生素
    新霉素對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響
    視覺反應(yīng)時間和聽覺反應(yīng)時間的比較分析
    高清黄色对白视频在线免费看| 91精品国产国语对白视频| 水蜜桃什么品种好| h视频一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 一级爰片在线观看| 国产精品一国产av| 久久人妻熟女aⅴ| 搡老岳熟女国产| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲视频免费观看视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 一级a爱视频在线免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 99久久精品国产亚洲精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 妹子高潮喷水视频| 久久久欧美国产精品| 欧美精品一区二区大全| 国产亚洲最大av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产野战对白在线观看| 男女之事视频高清在线观看 | 91aial.com中文字幕在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产色婷婷99| 岛国毛片在线播放| 1024视频免费在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 免费av中文字幕在线| 在现免费观看毛片| 赤兔流量卡办理| 国产精品 国内视频| 国产精品免费大片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产男人的电影天堂91| 欧美日韩av久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 久久鲁丝午夜福利片| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品女同一区二区软件| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品美女久久av网站| 成人黄色视频免费在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 精品久久久久久电影网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费黄频网站在线观看国产| 99国产综合亚洲精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一级片'在线观看视频| 老司机亚洲免费影院| 免费少妇av软件| 精品免费久久久久久久清纯 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 久热这里只有精品99| 色精品久久人妻99蜜桃| 色视频在线一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 2018国产大陆天天弄谢| 欧美日韩精品网址| 蜜桃在线观看..| 女性生殖器流出的白浆| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| bbb黄色大片| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜91福利影院| www日本在线高清视频| 婷婷成人精品国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黄色一级大片看看| 天天操日日干夜夜撸| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产男女内射视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品99久久99久久久不卡 | 又大又黄又爽视频免费| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲在久久综合| 视频区图区小说| 好男人视频免费观看在线| 精品亚洲成国产av| 18在线观看网站| 我的亚洲天堂| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 男女之事视频高清在线观看 | 久久精品久久精品一区二区三区| videos熟女内射| 黄频高清免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 超碰97精品在线观看| 国产欧美亚洲国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 水蜜桃什么品种好| 十八禁网站网址无遮挡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 老司机靠b影院| videosex国产| 各种免费的搞黄视频| 美女国产高潮福利片在线看| 久久av网站| 观看av在线不卡| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 男女免费视频国产| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品一区蜜桃| 视频在线观看一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利网站1000一区二区三区| 91老司机精品| 少妇精品久久久久久久| 成人手机av| 精品少妇内射三级| 国产av一区二区精品久久| 只有这里有精品99| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 老熟女久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 天堂8中文在线网| 自线自在国产av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 9色porny在线观看| 一级爰片在线观看| av免费观看日本| 人妻人人澡人人爽人人| 久久亚洲国产成人精品v| 美女主播在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| av片东京热男人的天堂| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成年人免费黄色播放视频| 操美女的视频在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产97色在线日韩免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 岛国毛片在线播放| 大码成人一级视频| 另类精品久久| 中文天堂在线官网| 一二三四中文在线观看免费高清| 午夜免费观看性视频| 中文欧美无线码| 精品国产国语对白av| 一级爰片在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利在线免费观看网站| 免费av中文字幕在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品 国内视频| 免费观看性生交大片5| 在线观看人妻少妇| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区久久| 熟女av电影| 亚洲av成人精品一二三区| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产在线视频一区二区| 国产精品免费大片| 亚洲成人一二三区av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久久久国产电影| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 不卡av一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 韩国高清视频一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产高清国产精品国产三级| 国产在线一区二区三区精| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 老汉色∧v一级毛片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美精品av麻豆av| 男女午夜视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 丝袜脚勾引网站| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 成人毛片60女人毛片免费| av在线播放精品| 国产xxxxx性猛交| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 日本一区二区免费在线视频| 久久久精品区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 搡老岳熟女国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲,欧美,日韩| 一本色道久久久久久精品综合| 性色av一级| 午夜福利在线免费观看网站| 国产 精品1| kizo精华| 免费不卡黄色视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 大陆偷拍与自拍| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费日韩欧美在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 中文欧美无线码| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲av高清不卡| 久久久欧美国产精品| 91国产中文字幕| 国产99久久九九免费精品| 中文字幕制服av| 国产精品.久久久| 日本wwww免费看| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美97在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 夫妻午夜视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲,欧美精品.| 只有这里有精品99| xxxhd国产人妻xxx| 婷婷色av中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 曰老女人黄片| 精品亚洲成国产av| 交换朋友夫妻互换小说| 丰满乱子伦码专区| 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻在线不人妻| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 免费观看av网站的网址| 成人三级做爰电影| 免费黄色在线免费观看| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 高清不卡的av网站| 高清在线视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产午夜精品一二区理论片| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品成人在线| 99九九在线精品视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 宅男免费午夜| 亚洲av国产av综合av卡| 精品第一国产精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产高清不卡午夜福利| 色综合欧美亚洲国产小说| 99热全是精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| av片东京热男人的天堂| a 毛片基地| 老汉色av国产亚洲站长工具| 极品人妻少妇av视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 熟女av电影| 人人妻人人澡人人看| av不卡在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av日韩在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产在视频线精品| 国产av一区二区精品久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 婷婷色综合www| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲色图综合在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 少妇人妻精品综合一区二区| 99国产精品免费福利视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 纯流量卡能插随身wifi吗| 大香蕉久久网| 一本色道久久久久久精品综合| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲,欧美,日韩| 久久这里只有精品19| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产av一区二区精品久久| 成人手机av| 99九九在线精品视频| 秋霞伦理黄片| 欧美日韩一级在线毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品一二三| 国产极品粉嫩免费观看在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费在线观看完整版高清| 精品久久久久久电影网| 九色亚洲精品在线播放| 岛国毛片在线播放| 久久久国产一区二区| 蜜桃国产av成人99| 人体艺术视频欧美日本| 精品午夜福利在线看| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜老司机福利片| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇人妻 视频| 老司机靠b影院| 成人手机av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品自拍成人| 免费黄色在线免费观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久免费观看电影| 97精品久久久久久久久久精品| 精品福利永久在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩免费高清中文字幕av| 97在线人人人人妻| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 人人妻人人澡人人看| 午夜免费鲁丝| 国产成人系列免费观看| 免费观看人在逋| 久久久国产一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| av一本久久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 黄色视频不卡| 国产成人啪精品午夜网站| www.自偷自拍.com| 一级片免费观看大全| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产伦理片在线播放av一区| 两个人看的免费小视频| 日本黄色日本黄色录像| 嫩草影院入口| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产成人精品无人区| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产黄色免费在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 成年av动漫网址| 精品久久久久久电影网| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 在线观看免费视频网站a站| √禁漫天堂资源中文www| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久精品人妻al黑| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人体艺术视频欧美日本| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲成色77777| 人妻人人澡人人爽人人| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲免费av在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 国产97色在线日韩免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美黑人精品巨大| 精品一区二区三区av网在线观看 | 制服人妻中文乱码| 啦啦啦 在线观看视频| av卡一久久| 在线天堂最新版资源| www日本在线高清视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 秋霞在线观看毛片| 99香蕉大伊视频| 99久久人妻综合| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产免费视频播放在线视频| 免费观看av网站的网址| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人手机av| 999久久久国产精品视频| 日本vs欧美在线观看视频| 日本欧美视频一区| 伦理电影免费视频| www.av在线官网国产| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产成人精品久久久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 又大又爽又粗| 999久久久国产精品视频| 桃花免费在线播放| 人妻 亚洲 视频| 9色porny在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 一级a爱视频在线免费观看| 18在线观看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 一区二区av电影网| 久久狼人影院| 黄片播放在线免费| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩大码丰满熟妇| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人免费无遮挡视频| 香蕉丝袜av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本av免费视频播放| 乱人伦中国视频| 久久久国产一区二区| 免费在线观看完整版高清| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级黄片播放器| 亚洲天堂av无毛| videos熟女内射| 国产精品 欧美亚洲| 国产探花极品一区二区| 婷婷色综合www| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲成人一二三区av| 色婷婷av一区二区三区视频| av视频免费观看在线观看| 国产99久久九九免费精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产一区二区 视频在线| 亚洲成色77777| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久久久国产电影| 午夜激情久久久久久久| 91精品三级在线观看| netflix在线观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 午夜日本视频在线| 国产深夜福利视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| www.av在线官网国产| 亚洲四区av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 九九爱精品视频在线观看| 高清av免费在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产看品久久| √禁漫天堂资源中文www| 久久狼人影院| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 美女大奶头黄色视频| netflix在线观看网站| 大香蕉久久网| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲专区中文字幕在线 | 在线精品无人区一区二区三| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久性视频一级片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av成人精品一二三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 中文字幕av电影在线播放| 永久免费av网站大全| 国产精品久久久久久精品古装| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲第一青青草原| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品av久久久久免费| 99热全是精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人妻一区二区av| 高清欧美精品videossex| 中文欧美无线码| 国产精品久久久av美女十八| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久国产一区二区| 九草在线视频观看| 老司机在亚洲福利影院| 视频区图区小说| 午夜福利一区二区在线看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美xxⅹ黑人| 晚上一个人看的免费电影| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av有码第一页| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲免费av在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 免费日韩欧美在线观看| 99热国产这里只有精品6| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩欧美精品免费久久| 街头女战士在线观看网站| 国产又爽黄色视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 男女边摸边吃奶| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美精品av麻豆av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 成人三级做爰电影| 精品酒店卫生间| 国产精品免费视频内射| 女人精品久久久久毛片| 午夜福利,免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩精品有码人妻一区| 午夜福利一区二区在线看| 日韩欧美精品免费久久| 午夜av观看不卡| 久久婷婷青草| 咕卡用的链子| 成人黄色视频免费在线看| 久久婷婷青草| 午夜91福利影院| 午夜av观看不卡| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品国产综合久久久| 只有这里有精品99| 国产色婷婷99| 亚洲国产欧美网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜免费鲁丝| 国产精品 国内视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 天堂8中文在线网| av网站免费在线观看视频| 99久久人妻综合| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 男的添女的下面高潮视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品久久精品一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 波多野结衣av一区二区av| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲人成电影观看| 男人添女人高潮全过程视频| 精品国产国语对白av| 国产 一区精品| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲男人天堂网一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站|