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    新霉素ELISA檢測方法的建立

    2011-10-27 07:29:46劉沙洲桑小雪歐陽華學(xué)雷紹榮白林含
    食品科學(xué) 2011年14期
    關(guān)鍵詞:新霉素反應(yīng)時間抗生素

    劉沙洲,桑小雪,歐陽華學(xué),雷紹榮,白林含,*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065;2.成都市食品藥品檢測中心,四川 成都 610045;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心,四川 成都 610066)

    新霉素ELISA檢測方法的建立

    劉沙洲1,2,桑小雪1,歐陽華學(xué)3,雷紹榮3,白林含1,*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065;2.成都市食品藥品檢測中心,四川 成都 610045;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心,四川 成都 610066)

    目的:比較直接和間接競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的優(yōu)缺點,建立新霉素殘留ELISA檢測方法。方法:利用自制的新霉素多克隆抗體,采用直接競爭和間接競爭ELISA方法檢測新霉素殘留,并比較兩種方法的優(yōu)缺點。結(jié)果:新霉素抗血清和慶大霉素的交叉反應(yīng)率為2.04%,和卡那霉素的交叉反應(yīng)率為0.02%,和氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。初步測試新霉素間接競爭ELISA法的準(zhǔn)確性和回收率。板內(nèi)誤差小于4%,板間誤差小于11%,回收率為135.5%~191.3%。直接競爭和間接競爭ELISA方法的檢測極限分別為28.58ng/mL和51.74ng/mL,達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。結(jié)論:建立了直接競爭和間接ELISA吸附檢測方法,條件優(yōu)化更成功的間接競爭ELISA可用于開發(fā)新霉素檢測試劑盒。

    新霉素;多克隆抗體;競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA);方法建立

    從全球來看,在食用動物中限用、禁用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢。在1997年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織(food and agriculture organization,F(xiàn)AO)就要求停止或禁止使用抗生素飼料添加劑,1998年12月又提議在1 0年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。2 0 0 4年,WHO、FAO和世界動物衛(wèi)生組織(office international des epizooties,OIE)聯(lián)合召開了一次專題討論會,討論了非人用抗生素的使用和抗生素的耐藥性問題。發(fā)達(dá)國家和有關(guān)國際組織都對抗生素在動物飼料中使用進(jìn)行了越來越嚴(yán)格的限制。特別是不準(zhǔn)將人用抗生素用于動物,在食用動物中禁用、限用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為世界共識[1-2],是大勢所趨。

    然而我國長期存在濫用、不合理使用抗生素飼料添加劑的情況,動物性食品中抗生素殘留的問題十分嚴(yán)重,不僅給消費者帶來健康上的損害,而且阻礙了我國動物產(chǎn)品的出口。近幾年,我國不斷加強對在食用動物中使用抗生素現(xiàn)象的監(jiān)督管理,以最大限度地減少對食品安全和人類健康的威脅。除了制訂、修訂法律法規(guī)、建立健全監(jiān)督檢驗體系、開展殘留監(jiān)控工作外,還不斷對殘留的限量作出規(guī)定。2002年,農(nóng)業(yè)部重新修訂發(fā)布獸藥在動物性食品中的最高殘留限量[3],使規(guī)定限量的獸藥達(dá)到134種,主要是抗生素類藥物,其中就包括新霉素。

    酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)靈敏度高、特異性強、可用于大量樣品的快速篩選、儀器化程度低、檢測速度快、樣品前處理相對簡單、價格低和適于開發(fā)成攜帶方便的試劑盒等優(yōu)點,是國內(nèi)獸藥檢測現(xiàn)場監(jiān)控、大量樣本篩查的主要方法。用于抗生素殘留檢測的主要方法有直接競爭ELISA法和間接競爭ELISA法,本實驗擬比較直接和間接ELISA法的優(yōu)缺點,以建立新霉素殘留ELISA檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    KLH-NEO抗血清、包被抗原BSA-NEO 自制[4];牛血清白蛋白、HRP-NEO、新霉素硫酸鹽、慶大霉素硫酸鹽、卡那霉素硫酸鹽、氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素鹽酸鹽 上海華舜生物工程有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG 博士德生物工程有限公司。

    0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L十二水磷酸氫二鈉、鄰苯二胺、過氧化氫、2mol/L硫酸、pH7.4磷酸緩沖鹽水-0.05% Tween20(簡稱PBS-Tween 20)、pH9.6碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)。

    3550型酶標(biāo)測定儀 美國Bio-RAD公司;酶標(biāo)板成都博瑞克生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 直接競爭ELISA反應(yīng)條件的建立

    1.2.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

    采用方陣測定法,包被不同質(zhì)量濃度的抗血清和陰性血清,直接測定HRP-NEO,以O(shè)D45nm接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

    1.2.1.2 最佳反應(yīng)時間

    設(shè)定抗血清和HRP-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100、120min,選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

    1.2.1.3 采用直接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和酶標(biāo)新霉素HRPNEO進(jìn)行直接競爭ELISA反應(yīng),然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值,B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo),新霉素質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值,可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

    1.2.2 間接競爭ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

    1.2.2.1 酶標(biāo)抗體工作用量的選擇

    包被一抗直接測二抗,以O(shè)D450nm值接近于1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋度為最適工作用量。

    1.2.2.2 最佳包被抗原用量與最佳反應(yīng)血清用量

    采用方陣測定法,加入BSA-NEO作為包被抗原,再加入KLH-NEO抗血清和陰性血清,按ELISA操作程序進(jìn)行,最后測定OD450nm值,以O(shè)D450nm值接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

    1.2.2.3 最佳反應(yīng)時間

    設(shè)定抗血清和BSA-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100min,選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

    1.2.2.4 采用間接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和抗血清進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng),然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值,B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo),新霉素質(zhì)量濃度常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值,可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

    1.2.3 交叉反應(yīng)的測定[5]

    采用間接競爭ELISA法測定慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素和KLH-NEO抗血清的結(jié)合反應(yīng)。新霉素的I50與這些抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測干擾程度的大小。

    1.2.4 方法準(zhǔn)確性的測定

    人工添加新霉素到PBS空白液中,使其在PBS中的終質(zhì)量濃度為60、250ng/mL。

    以板內(nèi)誤差及板間誤差來表示該方法的精確度。板內(nèi)測定為同一酶標(biāo)板上同一樣本若干孔的平均值,板間測定為不同酶標(biāo)板上幾次測定結(jié)果的平均值,本實驗中板內(nèi)誤差和板間誤差均取3次測定的平均值為準(zhǔn)。

    1.2.5 回收率的測定

    回收率測定實驗主要檢驗檢測方法的可靠性。將新霉素質(zhì)量濃度為60、250ng/mL的PBS溶液各取0.1mL進(jìn)行間接競爭ELISA。同時以沒有加入新霉素的PBS作為正對照。測定時每個樣品質(zhì)量濃度設(shè)定3個重復(fù),并重復(fù)3次實驗。然后進(jìn)行間接競爭ELISA測定OD450nm,計算抑制率,代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程,計算NEO的含量,并根據(jù)下式計算回收率:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 直接競爭ELISA法

    2.1.1 反應(yīng)條件的建立

    2.1.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

    表1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比Table 1 Determination of optimal coating antiserum concentration and HRP/NEO ratio

    由表1可知,在抗血清用量為1:1000、HRP-NEO配比為1:500時,OD450nm最大,初步確定最佳包被抗血清用量1:1000、最佳HRP-NEO配比1:500。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

    2.1.1.2 最佳反應(yīng)時間

    圖1 直接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.1 Determination of optimal reaction time of dc-ELISA

    由圖1可知,反應(yīng)時間60min時,顯色效果最好,因此確定直接競爭ELISA法的顯色時間為60min。

    2.1.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    圖2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(直接競爭ELISA法)Fig.2 Standard curve for neomycin determination by dc-ELISA

    如圖2所示,B/B0達(dá)到90%時的新霉素質(zhì)量濃度為該實驗的最低檢測極限,根據(jù)回歸方程,計算出該直接競爭ELISA檢測方法的檢測限是28.58ng/mL,達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。

    2.2 間接競爭ELISA法

    2.2.1 反應(yīng)條件的確立

    2.2.1.1 酶標(biāo)二抗工作用量

    表2 酶標(biāo)二抗用量的確定Table 2 Determination of optimal enzyme labeled secondary antibody concentration

    由表2可知,二抗稀釋倍數(shù)為2000的時候,OD450nm值最接近1.0。所以,確定二抗的最佳用量為1:2000。

    2.2.1.2 最佳包被抗原質(zhì)量濃度與最佳反應(yīng)血清用量

    由表3可知,抗血清1:2000稀釋、抗原1:400稀釋時,OD450nm值接近1.0,且相近數(shù)據(jù)差別不大。所以,確定KLH-NEO抗血清1:2000稀釋、BSA-NEO抗原1:400稀釋。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

    表3 包被抗原用量和血清用量的確定Table 3 Determination of optimal coating antigen and serum concentrations

    2.2.1.3 最佳反應(yīng)時間

    圖3 間接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.3 Determination of optimal reaction time of idc-ELISA

    由圖3可知,反應(yīng)時間為60min時,顯色效果最好。

    2.2.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    圖4 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(間接競爭ELISA法)Fig.4 Standard curve for neomycin determination by idc-ELISA

    如圖4所示,根據(jù)回歸方程,計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線中I50為174.58μg/mL。間接競爭ELISA檢測方法的檢測極限是51.74ng/mL,達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)對新霉素規(guī)定的500 μg/kg MRL檢測限。

    2.2.3 新霉素抗體和其他抗生素的交叉反應(yīng)率

    表4 新霉素抗體和其他抗生素交叉反應(yīng)率實驗結(jié)果Table 4 Cross-reaction rates of prepared anti-neomycin antibodies with other antibiotics

    新霉素的I50與其他抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測的干擾程度大小。本實驗選取了5種抗生素來進(jìn)行交叉反應(yīng)率的測定。其中,慶大霉素、卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素,和新霉素屬同一大類;由表4可知,新霉素抗體和慶大霉素及卡那霉素存在一定的交叉反應(yīng),與青霉素、四環(huán)素、紅霉素幾乎沒有交叉反應(yīng)(<0.01%),這說明抗體的特異性好。新霉素抗體與慶大霉素、卡那霉素存在交叉反應(yīng)是因為慶大霉素、卡那霉素和新霉素同屬氨基糖苷類抗生素,存在結(jié)構(gòu)上的相似性[6]。而青霉素屬內(nèi)酰胺類抗生素;四環(huán)素屬四環(huán)素類抗生素;紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[7]。

    2.2.4 方法準(zhǔn)確性的考察

    表5 變異系數(shù)實驗結(jié)果Table 5 Coefficients of variation for inter-plate and intra-plate precision of idc-ELISA

    如表5所示,NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時,3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為1.18%,板間變異系數(shù)為10.7%;NEO添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時,3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為3.88%,板間變異系數(shù)為4.39%;說明該方法的穩(wěn)定性較好。

    2.2.5 回收率

    表6 回收率考察實驗結(jié)果Table 6 Results of spike recovery test of idc-ELISA

    如表6所示,NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時的回收率不及添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時的回收率理想,可能因為60ng/mL已接近于該方法的檢測限51.29ng/mL,導(dǎo)致誤差較大。

    3 討 論

    本實驗采用直接競爭和間接競爭ELISA初步建立了新霉素殘留的酶聯(lián)免疫測定方法。 兩種方法檢測極限都達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。在本實驗進(jìn)行的3次實驗中,間接競爭ELISA法的穩(wěn)定性明顯的強于直接競爭ELISA法,這可能與本實驗室制備的新霉素多克隆抗體質(zhì)量有關(guān)??贵w是酶聯(lián)免疫測定中最關(guān)鍵的成分,提高檢測方法的穩(wěn)定性、靈敏性,關(guān)鍵在于提高抗體的質(zhì)量,要解決這個問題,首先可以從制備新霉素單克隆抗體入手[8-12]。相對于多克隆抗體,單克隆抗體具有更高的特異性、純度、均質(zhì)性和重復(fù)性。

    建立一個成熟的酶聯(lián)免疫測定方法,需要進(jìn)行穩(wěn)定性實驗,用大量的實驗數(shù)據(jù)考察方法的交叉反應(yīng)率、板內(nèi)誤差、板間誤差和回收率。在此基礎(chǔ)上還需要增加檢測基質(zhì)的種類[13],進(jìn)行樣品添加實驗,如在牛奶[14]、動物組織[15]中人工添加新霉素后再測定回收率??傮w來說,要得到一個成熟穩(wěn)定的檢測體系,在抗體、基質(zhì)等方面還有許多的工作要做。

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    Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Neomycin

    LIU Sha-zhou1,2,SANG Xiao-xue1,OUYANG Hua-xue3,LEI Shao-rong3,BAI Lin-han1,*
    (1. School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China;2. Food and Drug Testing Center, Chengdu 610045,China;3. Analysis and Testing Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

    In this study, we describe the advantages and disadvantages of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) and indirect competitive ELISA (idc-ELISA) and ELISA methods for the detection of neomycin. Antineomycin polyclonal antibodies were prepared and used to detect neomycin by dc-ELISA and idc-ELISA. The cross-reaction rates of prepared anti-neomycin polyclonal antibodies with gentamincin and kanamycin were 2.04% and 0.02%, respectively,and with ampicillin, erythromycin and tetracycline all less than 0.01%. The accuracy and recovery of idc-ELISA were tested with an intra-plate error of less than 4%, an inter-plate error of less than 11% and a recovery between 135.5% and 191.3%. The detection limits of dc-ELISA and idc-ELISA were 28.58 ng/mL and 51.74 ng/mL, respectively, both of which were below the national maximum residue limit (MRL) of 500μg/kg. Therefore, a dc-ELISA method and an idc-ELISA method to detect neomycin have successfully established. Further, the idc-ELISA method where the working conditions were better optimized can be used for the development of neomycin test kit.

    neomycin;polyclonal antibodies;competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);method establishment

    S854

    A

    1002-6630(2011)14-0227-05

    2010-04-26

    四川省公益性研究計劃項目(2008NG004)

    劉沙洲(1983—),女,碩士,主要從事微生物學(xué)與生物檢測研究。E-mail:liushazhou566@sina.com

    *通信作者:白林含(1970—),女,教授,博士,主要從事微生物分子生物學(xué)研究。E-mail:bailinhan@scu.edu.cn

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