劉玉革,劉勝輝*,臧小平,魏長賓,孫光明
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,廣東 湛江 524091)
高效液相色譜法測定番石榴葉提取物中的游離鞣花酸
劉玉革,劉勝輝*,臧小平,魏長賓,孫光明
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,廣東 湛江 524091)
研究高效液相色譜法測定番石榴葉中鞣花酸的方法。以甲醇(含0.01% HCl)作為提取液,70℃加熱回流;色譜條件為:Intersil ODS-SP色譜柱(250mm×4.5mm,5μm),柱溫35℃,進(jìn)樣體積10μL,紫外檢測波長254nm;流動相為3%冰乙酸(A)-純甲醇(B);梯度洗脫程序:0~4min B由20%至45%,保持6min,10~15min由45%至70%,15~20min由70%至100%,保持1min。結(jié)果表明:本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%,鞣花酸在0.5~200mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9998,加標(biāo)回收率為95.86%~98.31%。本方法用于測定鞣花酸是切實可行的;番石榴葉片中鞣花酸含量高低與葉片的成熟度有關(guān),其中幼嫩葉含量為0.814mg/g、成熟葉含量為0.023mg/g,而老葉中未檢出。
高效液相色譜法;番石榴葉提取物;游離鞣花酸
番石榴(Psidium guajava L.)為桃金娘科番石榴屬植物,原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū),現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),果實富含VC[1],葉富含倍半萜類與單萜類等多種揮發(fā)油[2],其葉子及未熟果實可供藥用,國內(nèi)外對于番石榴葉提取物的功能成分做過許多研究,葉富含總酚[3-4]和黃酮類化合物[5],具有抗氧化、廣譜抗菌及降血糖作用[6],番石榴根具有止血作用,其有效成分是鞣花酸[7]。鞣花酸有廣譜的抗突變、抗致癌特性,此外還具有抗氧化、抗?jié)儭⒖共《?、抗炎等藥理作用[8],因而備受人們的關(guān)注。鞣花酸天然存在于草莓[9]、藍(lán)莓[10]、覆盆子[11]、石榴[12]等漿果中,但番石榴葉提取物中鞣花酸的研究尚未有報道。因此本實驗利用高效液相色譜法對番石榴葉粉中鞣花酸的含量進(jìn)行測定,為更廣泛地開展番石榴葉開發(fā)利用提供理論和技術(shù)支持。
1.1 材料與試劑
番石榴葉片,采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所。鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Fluka公司;甲醇(色譜純) 天津四友公司;甲醇、鹽酸(均為分析純)。
1.2 儀器與設(shè)備
LC-20AD高效液相色譜儀(配SPD-20A紫外檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器及CTO-10A柱溫箱) 日本島津公司;Universal32R高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司;Elix5超純水儀 美國Millipore公司。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品40mg,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到質(zhì)量濃度均為400mg/L的混標(biāo)溶液,隨后逐級稀釋至0.5、1、5、10、20、50、100、200mg/L。
1.4 色譜分析條件
色譜柱為Intersil ODS-SP色譜柱(250mm×4.5mm,5μm),柱溫35℃,流動相為3%冰乙酸(A)-甲醇(B),梯度洗脫程序:0~4min B由20%升至45%,保持6min,10~15min B由45%升至70%,15~20min升至100%,保持1min;進(jìn)樣體積10μL。
1.5 樣品處理
將所摘取的新鮮番石榴葉片分老葉、嫩葉、成熟葉,于105℃烘至質(zhì)量恒定,用粉碎機(jī)打成粉,分別準(zhǔn)確稱取1.0g粉末,放入100mL單頸瓶中,加入甲醇(含0.01% HCl)30mL,于70℃攪拌回流,2h后取出冷卻,用Whatman4號濾紙過濾,即得番石榴葉片粗提取液,置4℃冰箱備用。每個樣品設(shè)3次重復(fù)。
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
圖1 鞣花酸標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of ellagic acid standard
取各級標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣10μL,所得的色譜圖疊加如圖1所示,以標(biāo)樣質(zhì)量濃度Y/(mg/mL)為縱坐標(biāo)、標(biāo)樣峰面積X/mV為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線,計算線性回歸方程為Y=108711X-45231,線性范圍為0.5~200mg/L,相關(guān)系數(shù)為0.9998。
2.2 精密度實驗
將同一番石榴葉提取液樣品(樣品代號2010.6.25)分裝于10個樣品瓶中,在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次,測定峰面積,并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來考查其測定的精密度,得出峰面積的RSD為0.6%,保留時間的RSD為0.06%。同時將該批樣品連續(xù)測定5d,得出峰面積的RSD為1.13%,說明精密度良好。
2.3 回收率實驗
采用加標(biāo)樣回收法,稱取番石榴葉3份,每份樣量1.0g,分別加入1000μg/mL的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1mL,其他均按1.5節(jié)方法進(jìn)行,平行測定3次,計算回收率(回收率為用添加標(biāo)樣樣品的測出量減去樣品測出量,再除以加入的標(biāo)樣量,乘以100%),結(jié)果見表3。結(jié)果表明平均回收率為95.86%~98.31%。
表1 方法的回收率Table 1 Spike recovery of the method
2.4 樣品分析
2.4.1 色譜分離效果
按照上述色譜條件,將嫩葉、成熟葉、老葉各樣品進(jìn)樣10.0μL進(jìn)行液相色譜分析,所得樣品色譜圖見圖2,與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)比較,可確定峰1為鞣花酸,峰1與前后相鄰兩峰之間的分離度均大于1.5,說明該梯度洗脫方法可以成功地分離鞣花酸和其他組分。
圖2 番石榴嫩葉提取物色譜圖Fig.2 Chromatogram of guava leaf extract
2.4.2 番石榴葉片中游離鞣花酸含量
表2 番石榴葉片游離鞣花酸含量差異Table 2 Free ellagic acid contents in guava leaves at different ages
從表2可看出,番石榴葉片中游離鞣花酸含量以幼嫩葉居多,成熟葉次之,而老葉中不含鞣花酸。
鞣花酸的高效液相色譜檢測方法很多,檢測器可以選擇二極管陣列[13]或紫外檢測器,由于鞣花酸屬于酚酸的一種,因此測定所用的流動相主要由甲醇與磷酸或冰乙酸組成。通常對于不同的基體,有不同的測定方法,劉艷等[14]用CH3OH- HAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)為流動相且體積比為44:2:54可以使藍(lán)莓中的鞣花酸達(dá)到很好的分離效果,還發(fā)現(xiàn)45%甲醇-55%冰乙酸等度洗脫即可徹底分離龍眼葉的鞣花酸與其他酚酸或黃酮類化合物,但不適用于番石榴葉提取物,必須采用梯度洗脫方法才能有效地分離鞣花酸和其他組分。
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Determination of Free Ellagic Acid Content in Guava Leaves by HPLC
LIU Yu-ge,LIU Sheng-hui*,ZANG Xiao-ping,WEI Chang-bin,SUN Guang-ming
(South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Acedemy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang 524091, China)
A high performance liquid chromatographic method was established for the quantitative determination of free ellagic acid content in guava leaves. Hot ethanol reflux (containing 0.01% HCl) extraction was applied for the extraction of samples. The analyte was separated on an inertsil ODS-SP column (250 mm × 4.5 mm, 5μm) held at 35 ℃ using a mobile phase composed of 3% glacial acetic acid (phase A) and net methanol (phase B) with the following gradient elution program: 0-4 min, 20%-45% B; 4-10 min, 45% B; 10-15 min, 45%-70% B; 15-20 min 70%-100% B; 20-21 min 100% B. The injection volume used was 10μL. The detection wavelength was set as 254 nm. The relative standard deviation of retention time for 5 replicate injections was 0.6%. Free ellagic acid content displayed an excellent linear relationship with pear area over the range of 0.5 to 200 mg/L, with a correlation coefficient of more than 0.9998. The spike recoveries for free ellagic acid were between 95.86% and 98.31 %. This method was used to determine free ellagic acid content in the real samples of young, mature and aged guava leaves. The results proved its good feasibility and showed that young, mature and aged guava leaves contained 0.814, 0.023 mg/g and 0 mg/g free ellagic acid, respectively, suggesting that free ellagic acid content in guava leaves is related to their maturity.Key words:high performance liquid chromatography (HPLC);guava leaf;ellagic acid
S667.4
A
1002-6630(2011)08-0252-03
2010-05-31
中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項(sscri-2009-10)
劉玉革(1977—),女,助理研究員,博士,研究方向為功能成分提取。E-mail:liuyugehb@126.com
*通信作者:劉勝輝(1975—),女,助理研究員,碩士,研究方向為果樹生理。E-mail:lizx2002@126.com