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    香腸中紅色2G的HPLC法及UPLC-MS/MS檢測

    2011-10-26 03:38:08儲曉剛吳永寧
    食品科學(xué) 2011年8期
    關(guān)鍵詞:乙酸銨香腸乙酸

    凌 云,儲曉剛,孫 利,張 峰,王 菡,3,陳 琦,4,吳永寧*

    (1.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所,北京 100021;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100025;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866;4.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安 712081)

    香腸中紅色2G的HPLC法及UPLC-MS/MS檢測

    凌 云1,2,儲曉剛2,孫 利2,張 峰2,王 菡2,3,陳 琦2,4,吳永寧1,*

    (1.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所,北京 100021;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100025;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866;4.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安 712081)

    建立香腸中紅色2G色素的高效液相色譜法(HPLC)測定和確證的超高壓液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。以0.662mol/L氨水為提取液,樣品均質(zhì)提取兩次,離心后用C18柱凈化,采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)檢測,流動相為乙酸-乙酸銨緩沖液-甲醇(55:45,V/V),等度洗脫,流速為1mL/min,檢測波長為530nm,陽性結(jié)果用UPLC-MS/MS確證。HPLC-DAD法在0.0212~1.06mg/L范圍內(nèi),紅色2G的峰面積與其相應(yīng)濃度呈現(xiàn)良好相關(guān)性,r>0.999,方法測定限為0.106mg/kg,在空白樣品中添加已知濃度的紅色2G色素,平均回收率在79.0%~86.5%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.19%~5.06%之間。UPLC-MS/MS法的測定限為0.005mg/kg,平均回收率在75.5%~80.2%之間,RSD在3.62%~9.97%之間。該方法可用于香腸中紅色2G的檢測及確證。

    紅色2G;色素;香腸;高效液相色譜;超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;確證

    紅色2G(Red 2G),別名食品紅10號,為單偶氮化合物,溶于水,微溶于乙醇,分子式為C18H13N3Na2O8S2,相對分子質(zhì)量509,為人工合成色素,常作為食品加工中的紅色色素,著色力強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定,不易褪色。因其可能具有致癌性[1],歐盟委員會已宣布在歐盟范圍內(nèi)禁止使用該色素[2],中國也已禁止使用紅色2G作為食品添加劑[3]。

    我國關(guān)于人工合成色素檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)有5項(xiàng)[4-8],尚沒有紅色2G檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)。王全林等[9]建立了二極管陣列高效液相色譜法測定食品中紅色2G,但前處理較為復(fù)雜。國外關(guān)于紅色2G的分析方法有分光光度計(jì)法、液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法及液質(zhì)聯(lián)用方法[10-15],但這些方法檢測限較高,液質(zhì)方法僅為液相色譜-單級四級桿質(zhì)譜法。本實(shí)驗(yàn)建立香腸中紅色2G的HPLC分析方法,提高方法的靈敏度,同時用超高壓液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS/MS)確證陽性結(jié)果,并簡化樣品前處理步驟,為香腸中紅色2G的測定提供一定的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紅色2G標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0%) 瑞士Fluka公司。氨水、乙酸、乙酸銨為分析純;甲醇為色譜純;乙酸-乙酸銨緩沖液:稱取1.554g乙酸銨溶于900mL水中,加入1mL乙酸,定容至1.00L,pH4.7;標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成1060mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4℃保存。

    1.2 儀器與設(shè)備

    C18固相萃取柱(500mg/6mL)、1100高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器(DAD)) 美國Agilent公司;超高效液相色相色譜-Quattro Premier三重四級桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(ESI))、固相萃取裝置 美國Waters公司;萬分之一分析天平;3K30冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;酸度計(jì) 日本Horiba公司;超純水器 美國Millipore公司;高速均質(zhì)器 美國Omniglh公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品提取與凈化

    將待測肉樣品切碎,稱取肉碎末5.00g,置于50mL離心管中,加入15mL 0.662mol/L氨水,均質(zhì)約2min,30000×g離心10min,取出上清液,殘余物再重復(fù)上述操作一次,合并上清液,用水定容至50mL,取出20mL,用乙酸調(diào)pH值至5~6之間,10000×g離心5min,吸取上清液,殘余物用5mL蒸餾水提取兩次,合并上清液。C18柱用4mL甲醇及4mL水活化后,將樣品提取液全部加樣到凈化柱中,先用4mL水淋洗,再用4mL水-甲醇(1:1)洗脫,將洗脫液收集,并定容至5mL,20000×g離心5min后供HPLC-DAD或UPLC-MS/MS分析。

    1.3.2 HPLC測定條件

    色譜柱:Waters Atlantis C18(4.6mm×250mm,5.0μm);柱箱溫度:30℃;流動相:乙酸-乙酸銨緩沖液-甲醇(55:45),等度洗脫,流速為1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;檢測波長:530nm。

    1.3.3 UPLC-MS/MS測定條件

    色譜柱:Waters Acquity BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm);流動相:乙腈-乙酸銨緩沖液(2mmol/L),梯度淋洗,初始條件:0~2min 10%乙腈線性上升至45%,2~3min乙腈保持45%,3~3.1min 45%乙腈下降至10%,流速:0.3mL/min;進(jìn)樣量:10μL。質(zhì)譜條件:采用電噴霧負(fù)離子模式,多反應(yīng)監(jiān)控掃描模式:m/z 231.7>157.9,碰撞能量,15eV;m/z 231.7>178.9,碰撞能量,10eV;毛細(xì)管電壓:2.75kV;錐孔電壓:26.74V;源溫度:110℃;脫溶劑氣溫度:400℃;脫溶劑氣流量:650L/h;電子倍增電壓:650V。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品提取

    紅色2G屬于人工合成色素,極易與蛋白質(zhì)結(jié)合或被吸附。本實(shí)驗(yàn)采用0.662mol/L氨水的均質(zhì)提取,蛋白質(zhì)溶解度提高,吸附的色素被釋放,能夠提高提取效率。但是,實(shí)驗(yàn)過程中用乙酸調(diào)節(jié)提取液pH值時,由于蛋白質(zhì)鹽析,產(chǎn)生大量沉淀。稱取香腸樣品,添加1.00mg/kg紅色2G,對比以下兩種前處理方法的回收率:樣品均質(zhì)提取后,用乙酸調(diào)pH值,離心定容后,取部分樣液注入液相色譜儀測定,添加回收率只有51.4%;而樣品均質(zhì)提取后,用乙酸調(diào)pH值,離心后沉淀用5mL蒸餾水提取兩次,將所有提取液合并后定容,取部分樣液注入液相色譜儀測定,添加回收率為82.3%,可見在蛋白質(zhì)沉淀過程中共沉淀作用降低了紅色2G的回收率。

    2.2 樣品凈化

    Minioti采用HPLC法測定水溶性食品中13種人工合成色素[4],水提取液過濾后直接分析,沒有樣品凈化步驟,本實(shí)驗(yàn)涉及的樣品基質(zhì)是肉類食品,提取液中的少量脂肪和蛋白質(zhì)對分析產(chǎn)生影響。量取1μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用10mL 氨水(0.662mol/L)稀釋,并用乙酸調(diào)整pH值為5~6后加到C18柱上,經(jīng)4mL水淋洗,4mL水-甲醇(1:1)洗脫,收集洗脫液測定,結(jié)果表明紅色2G的回收率達(dá)到104%,可見通過調(diào)節(jié)pH值使紅色2G吸附于C18柱上,甲醇-水(1:1)能夠?qū)⑵淙肯疵?,故選用C18柱進(jìn)行樣品凈化,既能去除樣品中大分子干擾,還能確保目標(biāo)組分的回收。

    2.3 HPLC法

    2.3.1 檢測波長的選擇

    吸取424ng/mL的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液,注入HPLC,記錄二極管陣列掃描圖(200~800nm),圖1為紅色2G的紫外-可見光譜圖,在235、311、505、530nm都有較強(qiáng)的吸收,由于530nm波長處的吸收很強(qiáng),同時可見區(qū)干擾較小,故選其作為檢測波長。

    圖1 紅色2G的紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of Red 2G

    2.3.2 流動相的選擇

    紅色2G屬于單偶氮化合物,且為磺酸鈉鹽,流動相的pH值對其分離影響較大。本實(shí)驗(yàn)比較甲醇-水作為流動相和甲醇-緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)的差別,發(fā)現(xiàn)采用前者作為流動相進(jìn)行洗脫時,色譜峰前伸,峰形差,選擇甲醇-緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)后,峰形得到有效的改善。

    圖2 流動相對紅色2G分離的影響Fig.2 Effect of mobile phase composition on red 2G separation

    2.3.3 線性實(shí)驗(yàn)

    吸取紅色2G標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用超純水稀釋為0.0212、0.0424、0.0530、0.106、0.212、0.424、0.636、1.06mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,依次注入HPLC分析,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)峰面積對應(yīng)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,線性方程為 y=0.0311x- 0.1418(r=0.9996)。

    2.3.4 方法的加標(biāo)回收及精密度、測定限

    將3個不同添加水平的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加于香腸樣品中,具體添加水平見表1。每個添加水平平行測定6次,紅色2G的平均回收率在79.0%~86.5%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.19%~5.06%之間,結(jié)果見表1。按信噪比RSN=10計(jì)算紅色2G的測定限為0.106mg/kg。

    表1 HPLC方法的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Accuracy and precision of HPLC method (n=6)

    2.4 UPLC-MS/MS確證方法

    以準(zhǔn)分子離子峰[M-2Na]2-為母離子(m/z=231.7)進(jìn)行掃描,選擇豐度較高的碎片峰[M-2Na-C4H6-N2]2-和[M-2Na-C4H6-N2-COCH2]2-作為子離子,m/z分別為178.9和157.9,m/z=157.9碎片峰的優(yōu)化碰撞電壓為15eV;m/z178.9碎片峰的優(yōu)化碰撞電壓為10eV,m/z178.9與m/z157.9的離子比率為1.3:1.0。在儀器的檢測限為0.001mg/L(信噪比RSN=3),將2個不同濃度水平的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加于香腸樣品中,具體添加水平見表2,按以上樣品處理方法操作并測定,每個添加水平平行測定6次,紅色2G的平均回收率在75.5%~80.2%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.62%~9.97%之間,結(jié)果見表2。按信噪比RSN=10計(jì)算紅色2G的測定限為0.005mg/kg,圖3為紅色2G的標(biāo)準(zhǔn)譜圖(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為0.212mg/L)及標(biāo)準(zhǔn)添加樣品譜圖(標(biāo)準(zhǔn)添加水平為0.200mg/kg)。

    表2 UPLC-MS/MS方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Accuracy and precision of UPLC/MS/MS method (n=6)

    圖3 紅色2G的UPLC/MS/MS譜圖Fig.3 UPLC/MS/MS chromatography of red 2G

    2.5 實(shí)際樣品測定

    從超市購買6種品牌的香腸用所建立的方法進(jìn)行測定,均未檢出紅色2G。

    3 結(jié) 論

    本研究建立香腸中紅色2G的HPLC分析方法和UPLC-MS/MS確證方法。通過線性、準(zhǔn)確度、精密度實(shí)驗(yàn)以及樣品的測定,驗(yàn)證了方法的可行性。本方法靈敏度高,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,使用范圍廣。

    [1] Commission Regulation (EC) No 884/2007 of 26 July 2007on emergency measures suspending the use of E 128 Red 2G as food colour[J].Official Journal of the European Union, 2007, L195: 8-9.

    [2] European Food Safety Authority. Opinion of the scientific panel on food additives, flavourings, processing aids and materials in contact with food(AFC) on the food colour Red 2G (E128) based on a request from the Commission related to the re-evaluation of all permitted food additives[EB/OL].(2007-07-16)[2010-06-17].http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178624461311.htm.

    [3] 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007.

    [4] GB/T 5009.35—2003 食品中合成著色劑的測定[S].

    [5] GB/T 5009.141-2003 食品中誘惑紅的測定 [S].

    [6] GB/T 9695.6—2008 肉制品中胭脂紅著色劑的測定[S].

    [7] GB/T 21916—2008 水果罐頭中合成著色劑的測定高效液相色譜法[S].

    [8] GB/T 21912—2008 食品中二氧化鈦的測定[S].

    [9] 王全林, 應(yīng)路, 張書芬, 等. 二極管陣列高效液相色譜法測定食品中紅色2G[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(2): 164-167.

    [10] MINIOTI K S, SAKELLARIOU C F, THOMAIDIS N S. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversedphase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Anal Chim Acta, 2007, 583(1): 103-110.

    [11] RYVOLOVA M, TABORSKY P, VRABEL P, et al. Sensitive determination of erythrosine and other red food colorants using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J]. J Chromatogr A,2007, 1141(2): 206-211.

    [12] ISHIKAWA F, SHIGEOKA S, NAGASHIMA M, et al. Analytical method of 21 coal-tar dyes in protein-rich foods by solid-phase extraction and HPLC[J]. Journal of Food and Hygiene Society of Japan, 2000, 41(3): 194-199.

    [13] ISHIKAWA F, OISHI M, SHINDO T, et al. Confirmation of nonpermitted detected dyes in akasu (red vinegar) by LC/MS[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2005, 46(5): 228-233.

    [14] YOSHIOKA N, ICHIHASHI K. Determination of 40 synthetic food colors in drinks and candies by high-performance liquid chromatography using a short column with photodiode array detection[J]. Talanta, 2008,74(5): 1408-1413.

    [15] ZALACAIN A, ORDOUDI S A, BLAZQUEZ I, et al. Screening method for the detection of artificial colours in saffron using derivative UV-Vis spectrometry after precipitation of crocetin[J]. Food Addit Contam, 2005,22(7): 607-615.

    Determination of Red 2G in Sausage by High-performance Liquid Chromatography and Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

    LING Yun1,2,CHU Xiao-gang2,SUN Li2,ZHANG Feng2,WANG Han2,3,CHEN Qi2,4,WU Yong-ning1,*
    (1. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China;2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100025, China;3. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;4. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 712081, China)

    A high-performance liquid chromatography method (HPLC) was developed for the determination of red 2G in sausage. Sausage samples were extracted twice with 0.662 mol/L NH3·H2O and the extract was cleaned up on a C18 column.Red 2G was analyzed by HPLC with diode array detector and confirmed by UPLC-MS/MS. The limit of quantification (LOQ)of HPLC was 0.106 mg/kg and the average recoveries ranged from 79.0% to 86.5% with RSD values between 3.19% and 5.06%.The LOQ of UPLC-MS/MS was 0.005 mg/kg and the average recoveries ranged from 75.5% to 80.2% with RSD values between 3.62% and 9.97%. The developed HPLC method and UPLC-MS method can be applied for the determination and confirmation of red 2G in sausage.

    red 2G;color;sausage;high-performance liquid chromatography (HPLC);ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS);confirmation

    R155.5

    A

    1002-6630(2011)08-0231-04

    2010-06-17

    北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(D08050200310804)

    凌云(1979—),女,助理研究員,博士研究生,研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail:lingyun_505@163.com

    *通信作者:吳永寧(1962—),男,研究員,博士,研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生。E-mail:wuyn@public.bta.net.cn

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