木瓜蛋白酶的活力檢測標準研究

張興燦，陳朝銀，李汝榮

（昆明理工大學-清華大學生物資源開發(fā)研究所，云南昆明650224）

木瓜蛋白酶的活力檢測標準研究

張興燦，陳朝銀*，李汝榮

（昆明理工大學-清華大學生物資源開發(fā)研究所，云南昆明650224）

分別按國家標準和企業(yè)標準中紫外分光光度法測定了兩個酶制劑企業(yè)生產的木瓜蛋白酶酶活力，結果表明，企業(yè)標準與國家標準測定的酶活力兩種方法測定的結果差別高達幾十倍，原因可能與底物溶液的pH、反應條件和巰基還原劑半胱氨酸鹽酸鹽有關。

木瓜蛋白酶，酶活測定，標準*

木瓜蛋白酶（Papain，EC 31412212）是一種具有廣泛底物專一性的含巰基蛋白酶，有很強的分解蛋白質的能力，此外也具有水解酰胺鍵和酯鍵的特性[1]。由于它具有適用pH范圍廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、紡織、制革、飼料、染料等工業(yè)生產中?；盍κ堑鞍酌缸钪匾馁|量指標，目前國家僅有蛋白酶制劑的通用標準[2]，由于對各類蛋白酶制劑尚無標準規(guī)定，企業(yè)、生產廠商通常根據(jù)國家蛋白酶制劑通用標準制定自己公司特定蛋白酶的企業(yè)標準。例如，目前我國的一些植物蛋白酶制劑工廠已在生產木瓜蛋白酶，但對于木瓜蛋白酶的質量檢測，特別是酶活性檢測的方法、條件和標準比較混亂，使產品保存和銷售受到嚴重影響[3]。為了提高產品質量，增強國際市場的競爭能力，亟待加強管理和統(tǒng)一檢測標準。經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)，企業(yè)標準與國家標準測定的酶活力的差值竟然高達幾十倍，這說明我國的酶制劑市場存在著較大的漏洞。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 選用兩個酶制劑公司生產的木瓜蛋白酶產品，以酪蛋白為底物，測定木瓜蛋白酶的酶活性；酶活力單位定義 在測定條件下每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在280nm處的消光值相當于濃度為1μg/mL酪氨酸消光時所需的酶量，為一個酶活力單位（U）。

Ultrospec2100型紫外分光光度計 Amersham Pharmacia公司；HH-S型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司；實驗所用試劑 均為分析純。

1.2 國標GB/T 23527-2009規(guī)定的方法[4]

1.2.1 試劑與溶液

1.2.1.1 三氯乙酸 稱取三氯乙酸65.4g/L，用水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.2 緩沖溶液 因為木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，采用磷酸緩沖液（pH=7.5），分別稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.3 L-酪氨酸標準儲備溶液（100μg/mL） 精確稱取預先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸（0.1000±0.0002）g，用1mol/L鹽酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸標準儲備溶液。

1.2.1.4 氫氧化鈉溶液（20g/L） 稱取氫氧化鈉片劑20.0g，加水900mL并攪拌溶解。待溶液到室溫后，以水定容至1000mL，攪拌均勻。

1.2.1.5 鹽酸溶液 濃度為1mol/L及0.1mol/L，按GB/T 601配制。

1.2.1.6 酪蛋白溶液（10.0g/L） 稱取標準酪蛋白（NICPBP國家藥物標準物質）1.000g，精確至0.001g，用少量氫氧化鈉溶液潤濕，加入相應的緩沖溶液約80mL，在沸水浴中加熱煮沸30min，并不時攪拌至酪蛋白全部溶解。冷卻到室溫后轉入100mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。定容前檢查并調整pH至相應緩沖液的規(guī)定值。此溶液在冰箱內貯存，有效期為3d。使用前重新確認并調整pH至規(guī)定值。

1.2.2 分析步驟

1.2.2.1 標準曲線的繪制 L-酪氨酸標準溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀釋液應在稀釋后立即進行測定。

表1 L-酪氨酸標準溶液

分別取上述所配的溶液，以0管為空白，利用紫外分光光度計于波長275nm下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度c為橫坐標，繪制標準曲線。利用回歸方程，計算出吸光度為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值。其K值應在130～135范圍內，如不符合，需重新配制試劑，進行實驗。

1.2.2.2 樣品的測定 待測酶液的制備：稱取酶樣品1～2g，精確至0.0002g。然后用相應的緩沖溶液充分溶解，然后取濾液（慢性定性濾紙）稀釋至適當?shù)臐舛?。測定：先將酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒溫水浴中，預熱5min，然后按以下流程操作：

式（1）中：X1—由標準曲線所得的樣品最終稀釋液的酶活力，u/mL；X2—樣品的酶活力，u/g；V—溶解樣品所使用容量瓶的體積，mL；n—稀釋倍數(shù)；8—反應試劑的總體積，mL；2—吸取酶液的體積，mL；m—樣品的質量，g；1/10—反應時間10min，以1min計。

1.3 按兩個公司各自的企業(yè)標準進行測定[5-6]

其中一個公司的企業(yè)標準為Q/JWLSW 01-2007（木瓜蛋白酶），另一個公司的企業(yè)標準為Q/NPB 01-2009（木瓜蛋白酶），兩個標準的內容基本一致。

1.2.3 結果計算 從標準曲線上讀出樣品最終稀釋液的酶活力，單位為u/mL。樣品的酶活力按下式計算：

1.3.1 溶劑

1.3.1.1 0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液 稱取8.955g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）到500mL容量瓶，用純水溶解并稀釋至刻度，搖勻備用（加一滴甲苯防腐）。

1.3.1.2 酶緩沖液（現(xiàn)配現(xiàn)用） 稱取0.528g L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.2236g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），用0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液分別溶解（共加入約90mL），合并混勻，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液或0.1mol/L鹽酸調pH＝6.0，定容到100mL。

1.3.1.3 酪蛋白溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用） 稱取0.600g酪蛋白（標準至0.001g），加入0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL，60℃水攪拌溶解，用0.1mol/L鹽酸調pH＝6.0，用純水定容到100mL，（40±0.2）℃保溫備用。

1.3.1.4 三氯乙酸溶液 稱取2.994g乙酸鈉，1.982g乙酸，1.798g三氯乙酸，用純水分別溶解后混合，定容到100mL容量瓶中，搖勻備用。

1.3.1.5 待測酶溶液 稱取待測木瓜蛋白酶適量（精確到0.001g），置100mL容量瓶中，加5mL酶緩沖液浸泡20min，加水至刻度，搖勻后，吸取1.0mL到25mL容量瓶中，加酶緩沖液至刻度，搖勻。

1.3.2 測試步驟

1.3.2.1 待測酶溶液的測試 量取1.0mL待測酶溶液置于具塞試管中，在（40±0.2）℃水浴鍋中水浴10min，迅速加入酪蛋白溶液5.0mL，振蕩使之充分混合后封口放回水浴，精確計時10min，加入三氯乙酸溶液5.0mL，立即搖勻，過濾。用純水作為空白，在275nm下測定濾液的吸光度A1。

1.3.2.2 待測酶的空白測試 量取1.0mL待測酶溶液置于具塞試管中，在（40±0.2）℃水浴鍋中水浴10min，迅速加入三氯乙酸溶液5.0mL，振蕩使之充分混合后封口放回水浴，計時10min，加入酪蛋白溶液5.0mL，立即搖勻，過濾。用純水作為空白，在280nm下測定溶液的吸光度A2。

1.3.2.3 酪氨酸標準液配制和測試 稱取0.050g L-酪氨酸標準品（精確至0.001g）至1000mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶解并稀釋到刻度（此為50μg/mL的標準液）。以純水作空白，在280nm波長處測吸光度A3。

1.3.3 結果計算 試樣中酶活力X1（u/g）按下式計算：

式（2）中：A1—待測酶溶液測試濾液的吸光度；A2—待測酶空白測試濾液的吸光度；A3—酪氨酸標準液的吸光度；n—待測酶樣品的稀釋倍數(shù)；m—待測酶樣品的質量，g。

2 結果與討論

2.1 由所配制的酪氨酸稀釋液測定的吸光度數(shù)據(jù)標準曲線

由標準曲線所得的回歸方程為：Y=0.0077X，相關系數(shù)R=0.9979，經(jīng)計算吸光常數(shù)k=130，符合實驗要求。

2.2 兩個標準測得的酶活力結果

對比表2和表3可以看出，在兩個不同的標準下測定的酶活力值有著高達幾十倍的差值。

表4 企業(yè)二的木瓜蛋白酶的酶活力結果

圖1 酪氨酸溶液的標準曲線

表2 企業(yè)一提供的三種木瓜蛋白酶樣品按國標測定的酶活力結果

表3 企業(yè)一提供的三種樣品按其企標測定的酶活力結果

3 討論

3.1 酪蛋白溶液配制方法的影響

國標中酪蛋白溶液配制完后其pH調節(jié)至7.5，而企業(yè)標準中的酪蛋白溶液是調節(jié)pH至6.0?？赡苁窃趐H為6.0條件下，酶活力較高。

3.2 反應條件的影響

國標中是在加入三氯乙酸后靜置10min再進行過濾，這樣蛋白質就基本完全除掉了，而企業(yè)標準中是加入三氯乙酸混勻后直接進行過濾，可能的結果就是蛋白質沒有完全沉淀下來，這可能會導致測出酶活力值較大。

3.3 半胱氨酸鹽酸鹽的作用

企業(yè)標準中配制的酶緩沖液中含有半胱氨酸鹽酸鹽，這也是影響最后結果的一個重要原因。半胱氨酸是一種還原劑，它通過改變蛋白質分子之間和蛋白質分子內部的二硫鍵，減弱了蛋白質的結構，這樣蛋白質就伸展開來，從而使酶分子更易作用于折疊的蛋白質肽鍵，使肽鏈更易被水解。

4 結論

目前對于動植物組織提取的蛋白酶制劑，國家還沒有制定相應的標準，像蛋白酶制劑國標GB/T 23527-2009中明確規(guī)定該標準不適用于動植物組織提取的蛋白酶制劑。由于國家還沒有制定相應的標準，就使動植物組織提取的蛋白酶制劑的酶活力測定沒有依據(jù)可循，造成其市場比較混亂。

關于木瓜蛋白酶活力測定的標準，方煥[3]等人早就已經(jīng)討論過，他們比較討論了木瓜蛋白酶的三種活性檢測方法，結果表明，以酪蛋白為底物的紫外分光光度法操作簡便、成本低廉，適于酶純化過程中的活性比較和木瓜蛋白酶系列產品及國內商品酶的活性測定；以BAEE為底物的光學法反應穩(wěn)定、重復性好，適于酶學性質的理論研究和出口商品酶的活性測定；以酪蛋白為底物的茚三酮顯色法，雖然操作煩瑣，但所需儀器簡單，測定結果誤差較小，非常適用于條件簡陋的地區(qū)。本文中測定木瓜蛋白酶的活力均是采用上面的第一種方法，即以酪蛋白為底物的紫外分光光度法，正是由于這種方法操作簡便、成本低廉，當前我國許多關于酶制劑的標準幾乎都采用的是這種方法。

由于動植物資源有限，工業(yè)上生產蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵制備，但是像木瓜蛋白酶這樣的動植物組織提取的酶制劑也占據(jù)巨大的市場份額，因此國家有必要制定關于動植物組織提取的蛋白酶制劑的統(tǒng)一標準，以便人們能夠在市場更加方便的進行質量檢測。

[1]路英華.蛋白酶的研究進展[J].生物科學信息，1991，3（2）：8-10.

[2]凌奧漢，吳顯榮.木瓜蛋白酶與番木瓜栽培[M].北京：中國農業(yè)出版社，1998：107.

[3]方煥，生吉萍，吳顯榮.工業(yè)生產中木瓜蛋白酶的活性檢測方法比較[J].食品與機械，2000（6）：27-29.

[4]GB/T 23527-2009中華人民共和國國家標準 蛋白酶制劑[S].

[5]Q/JWLSW 01-2007廣西南寧杰沃利生物制品有限公司企業(yè)標準 木瓜蛋白酶[S].

[6]Q/NPB 01-2009廣西南寧龐博生物工程有限公司企業(yè)標準木瓜蛋白酶[S].

Study on determination standards of papain activity

ZHANG Xing-can,CHEN Chao-yin,LI Ru-rong

（InstituteofBioresourceR&DofKunmingUniversityofScienceandTechnology-TsinghuaUniversity,Kunming650224,China）

The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended on National standards and Enterprise standards was studied respectively，found that the results had great differences.Then possible reasons were analyzed，the main influential factors may be pH of substrate，reaction conditions and cysteine hydrochloride.

papain；determination of enzyme activity；standard

TS207.2

A

1002-0306（2011）10-0435-03

2010－10－08 * 通訊聯(lián)系人

張興燦（1987-），男，在讀碩士，研究方向：生物技術制藥。

云南省科技計劃項目（2009EB081）。