紅毛丹果皮抗氧化物質(zhì)的提取及其抗氧化作用

張會(huì)林，孫麗平，范家恒，莊永亮

（昆明理工大學(xué)，化學(xué)與工程學(xué)院食品工程研究中心，云南昆明650224）

紅毛丹果皮抗氧化物質(zhì)的提取及其抗氧化作用

張會(huì)林，孫麗平，范家恒，莊永亮﹡

（昆明理工大學(xué)，化學(xué)與工程學(xué)院食品工程研究中心，云南昆明650224）

考察了不同濃度的甲醇溶液對(duì)紅毛丹果皮中多酚和黃酮物質(zhì)的超聲提取作用，并研究了不同甲醇提取液的還原能力、DPPH·和羥自由基清除能力。結(jié)果表明，60%和90%的甲醇溶液對(duì)紅毛丹果皮多酚的提取率較高，90%的甲醇溶液對(duì)黃酮的提取率最高。30%、60%、90%甲醇和水溶液對(duì)DPPH·自由基清除能力的IC50值均在4μg/mL左右；對(duì)羥自由基清除能力的IC50值分別為46.80、34.06、36.69、80.30μg/mL。結(jié)果表明：不同甲醇提取液均具有較強(qiáng)的還原能力、DPPH·和羥自由基清除能力，其IC50值均為μg/mL級(jí)。一定濃度范圍內(nèi)，提取液抗氧化能力與其多酚的含量呈正相關(guān)性。90%和60%的甲醇提取液的抗氧化能力明顯高于30%甲醇和水提取液。綜合考慮對(duì)多酚的提取率、抗氧化能力以及提取成本等因素，可采用60%的甲醇作為提取液。

紅毛丹果皮，超聲波，總酚，黃酮，抗氧化活性

紅毛丹（Nephelium lappaceum L.），又稱毛荔枝，原產(chǎn)于馬來(lái)西亞群島，與亞熱帶水果荔枝和龍眼同科[1]。紅毛丹營(yíng)養(yǎng)豐富，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紅毛丹中磷、鎂、硫和鈣的含量非常豐富，鋅、鐵和錳的含量也很高，而鎘、砷等有害元素含量卻很低[2]。紅毛丹果皮作為一種經(jīng)濟(jì)效益極低的副產(chǎn)品存在，多被廢棄，沒有得到充分的利用。紅毛丹果皮中多酚含量很高，研究表明，植物多酚具有防衰老、抗腫瘤、抗突變、抗高血壓、抗過敏反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治冠心病與中風(fēng)等多種保健功能。在馬來(lái)群島，干紅毛丹皮可入藥[3]。紅毛丹果皮提取物對(duì)人表皮癌細(xì)胞KB和大腸腺癌細(xì)胞Caco-2具有很好的抑制增殖能力[4]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅毛丹的研究主要是引種技術(shù)等方面，對(duì)其果皮中活性成分及其抗氧化能力的研究未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)擬采用不同濃度的甲醇溶液超聲提取紅毛丹果皮中的多酚和黃酮物質(zhì)，研究提取液的抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)紅毛丹果皮高附加值產(chǎn)品，促進(jìn)其綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 收集新鮮的紅毛丹果皮，60℃烘干，粉碎，過40目篩，備用。

TU1901型雙光束紫外可見光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；78-1型磁力攪拌器 深圳市國(guó)華儀器廠；LXJ-IIB型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SB-5200DTD超聲波清洗器 寧波新芝生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅毛丹果皮中多酚和黃酮物質(zhì)的超聲提取準(zhǔn)確稱取一定量果皮粉，按1∶20料液比，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、60%、90%的甲醇溶液和蒸餾水，采用SB-5200DTD超聲波清洗器（超聲功率200W），設(shè)定溫度30℃，超聲提取30min后3000r/min離心10min，取上清液定容至100mL，得到不同甲醇濃度的提取液樣品。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定[5]采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定提取液中多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。準(zhǔn)確吸取不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和甲醇提取液各1mL于10mL試管中，然后依次加入1mL去離子水，0.5mL福林酚試劑，1.5mL Na2CO3（7.5%）溶液，最后用水定容至10mL，在50℃水浴下保持10min，冷卻，在760nm測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為：y=0.0086x+0.0067，R2=0.9986，其中y為吸光度，x為沒食子酸含量。每個(gè)樣品做三個(gè)平行，結(jié)果以百分含量計(jì)。

1.2.3 總黃酮類物質(zhì)的測(cè)定[6]采用硝酸鋁法測(cè)定提取液中總黃酮類含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。準(zhǔn)確吸取不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作液和甲醇提取液各5mL，靜置5min，加入0.3mL亞硝酸鈉（5%），反應(yīng)6min后加入0.3mL硝酸鋁溶液（10%），反應(yīng)6min再加入4mL1mol/L氫氧化鈉和2.5mL水，反應(yīng)10min后于510nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為：y=0.0005x+0.0582，R2=0.9982，其中y為吸光度，x為蘆丁含量。每個(gè)樣品做三個(gè)平行，結(jié)果以百分含量計(jì)。

1.2.4 提取液抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 還原能力的測(cè)定[7]取1mL稀釋為一定濃度梯度的提取液于10mL離心管中，加入1mL磷酸鹽（PBS）緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）和1mL1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20min，取出，加入1mL10%三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。

取1mL混合液于5mL離心管中，加入1mL超純水和0.2mL0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，測(cè)定溶液在700nm處的吸光度（A700nm），以A700nm表示樣品的還原能力，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定[7]取0.4mL稀釋為一定濃度梯度的提取液于5mL試管中，加入2mL0.1mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻，暗處放置30min并不斷振蕩，在517nm處測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。清除率計(jì)算公式為：

式中，Ai=2mLDPPH溶液+0.4mL待測(cè)溶液的吸光度；Aj=2mL甲醇溶液+0.4mL待測(cè)溶液的吸光度；A0=2mL甲醇溶液+0.4mL超純水的吸光度。

1.2.4.3 紅毛丹果皮提取液在水楊酸體系中清除羥自由基能力的測(cè)定[8]取1mL稀釋為一定濃度梯度的提取液于10mL離心管中，依次加入0.3mL 8.0mmol/L的FeS04，0.25mL 20mmol/L的H2O2，1mL3.0mmol/L水楊酸，混勻，37℃水浴30min，取出，冷卻，加入0.45mL的蒸餾水，混勻，2000r/min離心10min，取上清液于510nm測(cè)吸光度。清除率計(jì)算公式為：

式中，A0=未加清除劑的吸光度；A1=加入清除劑的吸光度；A2=試劑空白的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度甲醇溶液對(duì)紅毛丹果皮中多酚和黃酮物質(zhì)的超聲提取作用

多酚及黃酮類物質(zhì)具有活潑的多羥基結(jié)構(gòu)，從而具有較強(qiáng)供電子能力，使其成為有效的抗氧化活性成分。不同極性的溶液對(duì)多酚和黃酮類物質(zhì)提取能力不同，本文研究了三種濃度甲醇溶液及蒸餾水對(duì)紅毛丹果皮中多酚和黃酮物質(zhì)的提取作用（圖1）。結(jié)果表明，甲醇濃度不同，對(duì)果皮中多酚和黃酮物質(zhì)的提取率明顯不同；60%和90%甲醇多酚提取率分別是22.6%和23.4%，兩者沒有顯著性差異，但是顯著高于水和30%甲醇提取率。四種不同濃度甲醇對(duì)總黃酮類物質(zhì)的提取率依次為：90%甲醇>30%甲醇>60%甲醇>水，90%甲醇溶液對(duì)黃酮的提取效果最好，提取率為16.25%。30%和60%甲醇溶液提取率沒有顯著性差異，而水對(duì)黃酮的提取率最低。

圖1 不同濃度甲醇對(duì)多酚和總黃酮的超聲提取作用

2.2 不同濃度甲醇提取液的還原能力

還原能力的測(cè)定是以樣品是否為有效的電子供應(yīng)者為評(píng)價(jià)指標(biāo)的。若是有效的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子可將Fe3+還原成Fe2+，還可與自由基形成較惰性的物質(zhì)，從而中斷自由基鏈鎖反應(yīng)。一般情況下，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。紅毛丹果皮不同濃度甲醇的提取液均具有較強(qiáng)的還原能力（圖2），且提取物的還原力與其質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在濃度低于4μg/mL時(shí)，60%甲醇提取液的還原能力高于Vc和其它三個(gè)提取液，水提取液的效果最差；當(dāng)濃度高于4μg/mL時(shí)，90%和60%甲醇提取液的還原力相當(dāng)且略低于Vc的還原能力。30%甲醇濃度和水提取液的還原力低于90%和60%甲醇提取液，這可能與提取液的多酚含量有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多酚含量的高低直接決定提取液的還原能力。

圖2 不同濃度甲醇提取液的還原能力

2.3 不同濃度甲醇提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517nm處有最強(qiáng)光吸收作用。在自由基清除劑存在時(shí)，孤電子被配對(duì)，517nm處的光吸收作用消失或減弱，消減的程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因此可通過測(cè)定光吸收的消減程度來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑清除DPPH自由基的能力。由圖3可知，紅毛丹果皮不同濃度的甲醇提取液均具有很強(qiáng)的DPPH自由基抑制能力，且隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，抑制DPPH自由基的能力相應(yīng)提高。四種提取液清除DPPH自由基的IC50值與Vc很相近，均在4μg/mL左右。

圖3 不同濃度甲醇提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4 不同濃度甲醇提取液對(duì)羥自由基的清除能力

圖4 不同濃度甲醇提取液對(duì)羥自由基的清除能力

羥基自由基是目前已知的氧化性最強(qiáng)的自由基，反應(yīng)性極強(qiáng)，幾乎可以和所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對(duì)機(jī)體危害極大[9]。由圖4可知，紅毛丹果皮不同濃度的甲醇提取液對(duì)羥自由基均具有一定的清除作用。在一定濃度范圍內(nèi)，提取物對(duì)羥自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。90%甲醇和60%甲醇提取物清除羥自由基的IC50值分別為36.69、34.06μg/mL，略高于Vc（40.80μg/mL）；30%甲醇和水提取物對(duì)羥自由基的清除能力相對(duì)較弱，IC50值分別是46.80、80.30μg/mL。不過，當(dāng)濃度高于50μg/mL，Vc的抑制羥自由基能力顯著高于四種提取液。當(dāng)提取物濃度大于170μg/mL時(shí)，60%和90%甲醇提取液對(duì)羥自由基的清除能力有所減弱，這與Shyamala[10]等的研究結(jié)果一致，可能是一些抗氧化劑濃度過高時(shí)表現(xiàn)出促氧化作用。

3 結(jié)論

3.1 四種提取液中90%和60%的甲醇溶液對(duì)紅毛丹果皮中多酚的提取率較高，兩者無(wú)顯著性差異；90%的甲醇溶液對(duì)黃酮的提取率最高，略高于60%和30%的甲醇溶液。

3.2 不同濃度甲醇提取液均具有較強(qiáng)的還原能力、DPPH·和羥自由基清除能力，且與提取物濃度含量呈正相關(guān)性，其IC50值均為μg/mL級(jí)，90%和60%的甲醇提取液的抗氧化能力高于30%甲醇和水提取液。

3.3 綜合考慮對(duì)多酚的提取率、抗氧化能力以及提取成本等因素，可采用60%的甲醇作為提取液，高值開發(fā)紅毛丹果皮，為人體保健和食品保質(zhì)提供天然的抗氧化原料。

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Study on active ingredients and antioxidant activities of extracts from rambutan rind by ultrasonic extraction

ZHANG Hui-lin,SUN Li-ping,FAN Jia-heng,ZHUANG Yong-liang*

（Research Center of Food Engineering,College of Chemistry and Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650224,China）

The rind of rambutan was extracted using ultrasound by different concentrations of methanol.Total phenolic and flavonoids contents of different extracts were determined and scavenging effects on reducing power，DPPH· and hydroxyl free radical were evaluated.Results showed that the 60%and 90%methanolic extracts had higher total phenolic content，and the flavonoids content of 90%methanolic extract was the highest.The IC50of 30%,60%and 90%methanolic and water extracts were about 4μg/mL in the DPPH·model and 46.80， 34.06， 36.69， 80.30μg/mL in the hydroxyl free radical model，respectively.The methaolic extracts had high effects on reducing power，scavenging DPPH· and hydroxyl radical，and all of their values of IC50reached the level of μg/mL.The results indicated the antioxidant activities of different extracts were positively corresponding to their total phenolic contents.Antioxidant activities of 60%and 90%methanolic extracts were higher than 30%methanolic extract and water extract obviously.

rambutan rind；ultrasound；phenolic；flavonoids；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-0306（2011）10-0129-03

2010-11-22 *通訊聯(lián)系人

張會(huì)林（1986-），女，碩士研究生，研究方向：功能食品。

云南省自然科學(xué)基金（2010ZC032）。