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    成人哮喘患者Treg/Th17細(xì)胞失衡與呼出氣一氧化氮的相關(guān)性研究①

    2022-02-21 05:57:34覃松梅劉彤龍勝澤藍(lán)嬌韋彩周農(nóng)向陽(yáng)冉果覃雪軍
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:外周血淋巴細(xì)胞氣道

    覃松梅 劉彤 龍勝澤 藍(lán)嬌 韋彩周 農(nóng)向陽(yáng) 冉果 覃雪軍

    (廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,南寧 530021)

    支氣管哮喘是由肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病,其發(fā)病率在逐年上升,成為最常見(jiàn)的慢性疾病之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約有4.3%人口罹患哮喘,我國(guó)最新流行病學(xué)調(diào)查資料顯示哮喘的總患病率為4.2%,即我國(guó)可能有4 570萬(wàn)哮喘患者。哮喘的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,可能與感染、環(huán)境因素、過(guò)敏體質(zhì)和多基因遺傳等相關(guān)[2]。近年來(lái),哮喘患者體內(nèi)Treg與Th17細(xì)胞失衡逐漸被認(rèn)識(shí)并日益受到關(guān)注??刂茪獾姥装Y和緩解哮喘癥狀是治療哮喘的最終目標(biāo)。FeNO是由氣道細(xì)胞產(chǎn)生,可作為一種非創(chuàng)傷性并可直接量化氣道炎癥的生物標(biāo)志物,已成為氣道炎癥研究的新熱點(diǎn)。故本研究檢測(cè)了哮喘與慢性咳嗽非哮喘患者FeNO值及外周血Treg/Th17細(xì)胞,旨在分析哮喘患者FeNO水平與Treg/Th17失衡的相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 臨床資料回顧分析廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院自2017年12月至2018年6月呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的慢性咳嗽患者33例,其中17例為哮喘慢性持續(xù)期及咳嗽變異性哮喘患者,16例為非哮喘及非咳嗽變異性哮喘的慢性咳嗽患者。哮喘診斷、分級(jí)分期及咳嗽變異性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年版《支氣管哮喘防治指南》[3]。(1)典型哮喘的臨床癥狀和體征:①反復(fù)發(fā)作喘息、氣急,伴或不伴胸悶或咳嗽,夜間及晨間多發(fā),常與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激以及上呼吸道感染、運(yùn)動(dòng)等有關(guān);②發(fā)作時(shí)雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音,呼氣相延長(zhǎng);③上述癥狀和體征可經(jīng)治療緩解或自行緩解。(2)可變氣流受限的客觀檢查:①支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽(yáng)性(吸入支氣管舒張劑后,F(xiàn)EV1增加>12%,且FEV1絕對(duì)值增加>200 ml);②支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性;③呼氣流量峰值(peak expiratory flow,PEF)平均每日晝夜變異率>10%,或PEF周變異率>20%。符合典型哮喘的臨床癥狀和體征,同時(shí)具備氣流受限客觀檢查中的任一條,并排除其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽,可以診斷為哮喘。哮喘慢性持續(xù)期是指每周均不同頻度和(或)不同程度地出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。非哮喘的慢性咳嗽按2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)排除表現(xiàn)為慢性咳嗽的支氣管哮喘及咳嗽變異性哮喘患者。咳嗽變異性哮喘:咳嗽作為唯一或主要癥狀,無(wú)喘息、氣急等典型哮喘的癥狀和體征,同時(shí)具備可變氣流受限客觀檢查中的任一條,排除其他疾病所引起的咳嗽。慢性咳嗽診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》[4]:咳嗽持續(xù)時(shí)間超過(guò)8周,肺部影像學(xué)未見(jiàn)異常。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有研究對(duì)象年齡≥15周歲;②無(wú)精神障礙;③無(wú)肺炎。排除標(biāo)準(zhǔn):①來(lái)院時(shí)處于哮喘急性發(fā)作期及緩解期的患者,由于哮喘急性發(fā)作會(huì)誘發(fā)許多相關(guān)免疫反應(yīng),而緩解期患者免疫狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定,故予排除;②合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾??;③近期(1個(gè)月內(nèi))采用過(guò)全身激素治療;④妊娠或哺乳期。本研究得到了廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

    1.1.2 儀器及試劑流式細(xì)胞儀(BD FACS CantoⅡ,美國(guó));流式抗體、淋巴細(xì)胞刺激劑(BD公司,美國(guó));標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(CellMax,新西蘭);RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó));Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液(Thermo,美國(guó));IL-17 ELISA試劑盒(Abcam公司,英國(guó));酶標(biāo)儀(山東高密彩虹分析GF-M3000,中國(guó));納庫(kù)侖呼氣分析儀(Sunvou,中國(guó));MasterScreen肺功能儀(耶格公司,德國(guó))。

    1.2 方法

    1.2.1 肺功能測(cè)定用力肺活量(FVC)和第1秒用力呼氣容積(FEV1):由同一位經(jīng)肺功能檢測(cè)培訓(xùn)的醫(yī)師完成。

    1.2.2 呼出氣一氧化氮測(cè)定FeNO值測(cè)定由同一位接受過(guò)培訓(xùn)的技師通過(guò)納庫(kù)侖呼氣分析儀完成。檢測(cè)前1 d禁熏制品及腌制品等食物,檢測(cè)前1 h禁止進(jìn)食、吸煙、劇烈運(yùn)動(dòng)等。使用鼻夾夾緊患者鼻部,讓患者吸氣到最大肺活量通過(guò)濾嘴緩慢向測(cè)試儀器呼氣,保持呼氣速率(50±5)ml/s,儀器自動(dòng)分析得出FeNO值。

    1.2.3 外周血Treg和Th17細(xì)胞的檢測(cè)真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml,分別在2個(gè)流式檢測(cè)管內(nèi)取500 μl全血,加入2 ml紅細(xì)胞裂解液,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝罅呀?~10 min,融入1640培養(yǎng)基至8 ml,2 000 r/min離心5 min,棄上清;加入適量1640重懸,加入細(xì)胞刺激劑置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育6 h。第一管加入熒光標(biāo)記單抗CD4-FITC 20μl,第二管加入抗體CD4-FITC、CD25-APC各20 μl,常溫避光孵育25 min。兩管分別先后加入細(xì)胞固定/破膜緩沖液1.5 ml、染色緩沖液1 ml,常溫避光孵育20~30 min,2 000 r/min離心5 min,棄上清。于第一管內(nèi)加入胞內(nèi)熒光標(biāo)記單抗IL-17A-PerCP-Cy5.5 5 μl,第二管加入抗體FoxP3-PE 20 μl,常溫避光孵育30 min。加入1 ml染色緩沖液,1 500 r/min離心5 min,棄上清;加入2%多聚甲醛200μl重懸細(xì)胞并固定,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.2.4 ELISA檢測(cè)外周血血漿IL-17水平真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml,4℃、2 000 r/min離心5 min,收集上清-80℃保存,IL-17水平檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每份標(biāo)本測(cè)定2次,結(jié)果取平均值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組間數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行處理,變量呈正態(tài)分布,采用t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson分析或Spearman秩相關(guān)分析,數(shù)據(jù)用±s表示。P<0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 研究對(duì)象基礎(chǔ)資料對(duì)比共納入患者33例,哮喘組17例,其中咳嗽變異性哮喘7例、輕度慢性持續(xù)期哮喘4例、中度慢性持續(xù)期哮喘6例;非哮喘慢性咳嗽組16例,其中變應(yīng)性咳嗽10例、胃食管反流性咳嗽6例。各組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見(jiàn)表1。

    表1 各組基礎(chǔ)資料對(duì)比Tab.1 Comparison of basic data of each group

    2.2 Treg、Th17細(xì)胞、Treg/Th17、IL-17、FeNO表達(dá)情況兩組外周血Treg占CD4+T淋巴細(xì)胞比例無(wú)明顯差異[(0.80±0.39)%vs(1.04±0.25)%,P=0.091];哮喘組患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組[(4.01±2.11)%vs(0.93±0.75)%,P<0.001];哮喘組Treg/Th17細(xì)胞的比值明顯低于非哮喘的慢性咳嗽組[(0.24±0.19)% vs(2.55±2.59)%,P<0.001];哮喘組外周血血漿IL-17濃度明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組[(4.60±1.96)ng/L vs(3.01±1.97)ng/L,P=0.012];哮喘組FeNO水平高于非哮喘的慢性咳嗽組[(95.53±37.86)ppb vs(26.94±9.84)ppb,P<0.001]。見(jiàn)表2和圖1、2。

    圖1 外周血Treg、Th17細(xì)胞流式圖Fig.1 Flow cytometry of Treg,Th17 cells in peripheral blood

    表2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例比較(±s)Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups(±s)

    表2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例比較(±s)Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups(±s)

    Groups Asthma group Chronic cough group t Z P Number of cases(n)17 16 Treg/%0.80±0.39 1.04±0.25-1.766-0.091 Th17/%4.01±2.11 0.93±0.75--3.942<0.001 Treg/Th17 0.24±0.19 2.55±2.59--3.809<0.001

    2.3 Treg、Th17、Treg/Th17和FeNO之 間 的 相 關(guān)性哮喘組FeNO值與外周血Treg占比無(wú)相關(guān)性(r=-0.328,P=0.253),與Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.663,P=0.01),與Treg/Th17細(xì)胞比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.757,P=0.002),見(jiàn)圖3。

    圖2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞、Treg/Th17、血漿IL-17濃度、FeNO水平對(duì)比Fig.2 Comparisons of Treg,Th17 cells,Treg/Th17 in peripheral blood,IL-17 concentration in plasma and level of FeNO between two groups

    圖3 FeNO水 平 與Treg、Th17細(xì) 胞、Treg/Th17細(xì) 胞 的相關(guān)性Fig.3 Correlations between FeNO and Treg,Th17 cells,Treg/Th17

    3 討論

    哮喘是呼吸科常見(jiàn)的氣道慢性炎癥疾病。近年來(lái)隨生活習(xí)慣及環(huán)境的改變,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。數(shù)據(jù)顯示全世界哮喘患者大約有1.5~2億例,而治療哮喘的過(guò)程漫長(zhǎng),給家庭和社會(huì)帶來(lái)較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。研究表明哮喘患者氣道的慢性炎癥主要是由輔助性T(Th)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)所致,其中Th1/Th2細(xì)胞及其特征細(xì)胞因子譜的失衡被認(rèn)為與哮喘的發(fā)病密切相關(guān),Th1/Th2失衡參與疾病的發(fā)病過(guò)程,但逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡卻不能使哮喘患者的癥狀得到完全緩解[6-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在哮喘患者體內(nèi)還存在Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞失衡[9]。

    Th17細(xì)胞是一種能夠分泌IL-17的T細(xì)胞亞群,在自身免疫病、感染等疾病中發(fā)揮重要作用[10]。Th17細(xì)胞的分化由RORγt和RORα共同介導(dǎo),IL-23并不參與初始T淋巴細(xì)胞的分化,但其也是維持Th17細(xì)胞增殖和功能穩(wěn)定的重要因子。Treg是免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞,在多種疾病中參與調(diào)節(jié)變態(tài)反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)等,避免機(jī)體出現(xiàn)免疫失衡[11-12]。JIANG等[13]研究表明,在被卵清蛋白致敏的小鼠哮喘模型中,小鼠肺組織里Treg/Th17細(xì)胞比例降低,表明小鼠哮喘的發(fā)病與Treg/Th17細(xì)胞失衡存在一定聯(lián)系。本研究分析哮喘患者與非哮喘慢性咳嗽患者Treg、Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17表達(dá)水平的差異,發(fā)現(xiàn)與非哮喘慢性咳嗽組相比,哮喘組Th17細(xì)胞呈高表達(dá),且IL-17的表達(dá)也呈高表達(dá),進(jìn)一步說(shuō)明,Th17細(xì)胞及IL-17的表達(dá)水平上升與哮喘發(fā)病密切相關(guān)。其原因是哮喘患者在接觸過(guò)敏原刺激后,Th17細(xì)胞生成IL-17,促進(jìn)氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)性炎癥反應(yīng),最終促使患者哮喘發(fā)作[14]。

    T淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)生過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用,T細(xì)胞參與氣道炎癥的免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在正常情況下,T淋巴細(xì)胞及亞群數(shù)目處于較穩(wěn)定的狀態(tài),當(dāng)T淋巴細(xì)胞呈高表達(dá)則哮喘患者氣道炎癥發(fā)生變化。相關(guān)研究證實(shí),哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制還包括Treg數(shù)目的變化[15]。當(dāng)哮喘患者接觸到過(guò)敏原后,體內(nèi)Treg數(shù)目明顯發(fā)生變化,但各研究團(tuán)隊(duì)對(duì)Treg變化趨勢(shì)的研究結(jié)果不一致。XIN等[16]研究顯示,Treg在輕度和中度哮喘患者中數(shù)目呈增多趨勢(shì),且會(huì)根據(jù)病情的加重而增多。STELMASZCZYK-EMMEL等[17]研究發(fā)現(xiàn),Treg在兒童過(guò)敏性哮喘患者中呈減少趨勢(shì),但在不同病情與年齡段Treg表達(dá)水平不同。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組患者Treg/Th17下降,提示哮喘患者存在Treg/Th17細(xì)胞失衡現(xiàn)象,Th17細(xì)胞數(shù)量增多是引起Treg/Th17細(xì)胞失衡的主要因素。

    FeNO是當(dāng)氣道受到炎癥或炎癥因子刺激時(shí)所合成產(chǎn)生的,在哮喘患者中FeNO值明顯升高,F(xiàn)eNO值可在一定程度上反映氣道炎癥水平[18-19]。氣道炎癥的深層原因與Treg/Th17細(xì)胞的失衡相關(guān),目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Treg/Th17細(xì)胞失衡與FeNO相關(guān)性尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者FeNO值與外周血中Treg/Th17細(xì)胞比值呈負(fù)相關(guān),表明FeNO值在一定程度上反映哮喘患者體內(nèi)Treg/Th17細(xì)胞失衡。當(dāng)哮喘患者接觸過(guò)敏原后,受到刺激的Th17細(xì)胞活化生成IL-17,兩者共同誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞釋放趨化因子,從而使氣道炎癥持續(xù),F(xiàn)eNO作為炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物隨之升高。Th17細(xì)胞在哮喘患者呈高表達(dá),同時(shí)FeNO值也呈高表達(dá),兩者呈正相關(guān),進(jìn)一步表明FeNO值及Th17細(xì)胞水平升高與哮喘發(fā)病相關(guān),可作為哮喘氣道炎癥發(fā)病機(jī)制中的重要指標(biāo)之一。

    綜上所述,F(xiàn)eNO水平的升高與Treg/Th17細(xì)胞失衡密切相關(guān),尤其與Th17細(xì)胞增加的關(guān)系更加密切,患者Th17細(xì)胞升高導(dǎo)致氣道炎癥發(fā)生,進(jìn)一步導(dǎo)致FeNO值上升,為哮喘的診治提供新的依據(jù),F(xiàn)eNO水平可作為診斷哮喘或預(yù)測(cè)哮喘發(fā)作的指標(biāo),而Th17細(xì)胞增高導(dǎo)致FeNO值隨之升高的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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