黃芩對小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影響的研究*

黃綺凌, 宋 寧, 李東健， 黃世光△, 張?jiān)龇?/p>

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2深圳市兒童醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518026；3廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510170)

黃芩對小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影響的研究*

黃綺凌1, 宋 寧2, 李東健3， 黃世光1△, 張?jiān)龇?

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2深圳市兒童醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518026；3廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510170)

目的本研究采用小鼠建立實(shí)驗(yàn)牙周炎模型，觀察黃芩水提取物對牙周炎的治療效果，分析黃芩對Th1 /Th2反應(yīng)平衡的作用，探討黃芩對牙周炎的免疫干預(yù)/治療機(jī)制。方法采用清潔級12周齡雄性昆明小鼠36只，隨機(jī)分成3組：(1)正常對照組；(2)牙周炎組：參照Kimura等的方法建立牙周炎模型，并于建模后第5周開始用蒸餾水灌胃；(3)黃芩組：同上法復(fù)制模型，并于建模后第5周開始用黃芩水提取物灌胃。各組動物分別于建模后第4、6和8周末處死，每組4只。制作牙體牙周組織聯(lián)合切片，觀察牙周的組織學(xué)改變，并用ELISA法檢測各組小鼠外周血清中IgG1、IgG2a水平。結(jié)果(1)組織學(xué)改變：牙周炎組牙周炎癥破壞明顯。黃芩組牙周組織炎癥程度較牙周炎組明顯減輕，修復(fù)反應(yīng)明顯。(2)抗體水平：黃芩組IgG1水平逐步升高，明顯高于牙周炎組(P<0.05)。牙周炎組IgG2a水平逐步升高(P<0.05)；黃芩組IgG2a水平逐步降低(P<0.05)，且明顯低于牙周炎組(P<0.05)。結(jié)論黃芩通過抑制小鼠牙周炎的Th1細(xì)胞反應(yīng)和增強(qiáng)Th2細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)小鼠的免疫能力，對小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎有顯著的治療效果。

牙周炎； 抗體； 黃芩； 免疫調(diào)節(jié)

牙周炎是一種多因素引起的牙齒支持組織的慢性感染性疾病，研究表明牙周病的病理損害與輔助性T細(xì)胞(helper T-lymphocyte, Th)免疫應(yīng)答平衡失調(diào)密切相關(guān)，免疫應(yīng)答向Th1方向過度發(fā)展，Th2應(yīng)答相對不足致使牙周組織炎癥與牙槽骨吸收。 我們及其他一些研究者的研究表明抗牙周感染保護(hù)性免疫是一種Th2免疫反應(yīng)，糾正Th1/Th2應(yīng)答失衡有利于改善牙周炎的病變進(jìn)程[1-3]。研究證明黃芩對慢性牙周炎具有一定的治療效果[4]，但關(guān)于其相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立小鼠實(shí)驗(yàn)牙周炎模型，觀察黃芩水提取物對牙周炎的治療效果，探討黃芩對Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)平衡的作用，并在細(xì)胞免疫學(xué)的角度分析其免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

清潔級昆明小鼠購于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；黃芩提取物混懸液由香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院陳劍萍助理教授惠贈。

2方法

2.1動物分組 實(shí)驗(yàn)采用清潔級12周齡的雄性昆明小鼠36只，體重約32-36 g，于室內(nèi)采光條件良好、清潔、安靜、通風(fēng)良好、室溫22℃左右、光照周期12 h∶12 h、無特殊致病菌的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組。(1)正常對照組(normal control group)：正常喂養(yǎng)，牙周不做特殊處理，并于第5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃。(2)實(shí)驗(yàn)性牙周炎組(experimental periodontitis group)：參照Kimura等[5]的方法建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，于建模后5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃，連續(xù)觀察至第8周。(3)黃芩治療組(ScutellariabaicalensisGeorgigroup, SG)：同上法建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，于建模后5周開始用黃芩提取物混懸液(0.48 g ·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)觀察至第8周。各組小鼠分別于建模后第4周 、第6周和第8周末，末次給藥后24 h分批處死動物，各時(shí)點(diǎn)每組處死動物數(shù)為4只。

2.2動物模型的建立

① 絲線結(jié)扎牙頸部 實(shí)驗(yàn)小鼠用0.7%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g體質(zhì)量，ip)麻醉，待小鼠麻醉后，取其仰臥位，固定四肢及頭部，消毒口腔及口周，用尖探針分離雙側(cè)上頜第1磨牙牙齦組織，5/0絲線纏繞牙頸部2-3圈，于兩側(cè)牙齦乳頭處縫扎固定，在前庭溝區(qū)打結(jié)，結(jié)扎線盡量置于齦溝內(nèi)。

② 牙周致病菌的接種 收集臨床確診為慢性牙周炎患者的病變區(qū)域齦緣下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的標(biāo)本瓶，在漩渦式混勻器中振蕩30 s，生理鹽水10倍系列稀釋，選擇稀釋度10-3濃度接種于疾病控制中心(CDC)厭氧血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)基上生長的菌落與牙周致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對照，對符合菌種特征的菌落，用磷酸緩沖溶液 (phosphate buffer solution, PBS) 溶液洗脫、經(jīng)離心收集濕菌，用培養(yǎng)液制成細(xì)菌懸液備用。實(shí)驗(yàn)性牙周炎組、黃芩治療組小鼠經(jīng)絲線結(jié)扎牙頸部后通過管飼法，每只小鼠給予菌懸液0.3 mL，初次接種后每48 h追加1次，共管飼細(xì)菌3次。

3觀察指標(biāo)及檢測方法

3.1組織學(xué)觀察 取出上頜第1磨牙及其牙周組織,脫鈣,制作牙體牙周組織聯(lián)合切片, HE染色,光鏡下觀察結(jié)合上皮、上皮下炎癥細(xì)胞浸潤及牙槽骨的吸收情況。

3.2血清標(biāo)本的采集和抗體的測定 采用摘眼球法采集血液約1 mL，靜置2 h，4℃放置過夜，離心(4 000 r/min)5 min，收集血清，-20 ℃保存。測量血清抗體時(shí)，將保存的標(biāo)本平衡至室溫，放置20 min。ELISA法檢測 IgG1、IgG2a水平：在酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加入用0.05 mol/L pH9.6包被緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 mg/L的抗原 0.1 mL，4 ℃孵育過夜。含Tween 20的5%PBS洗液洗滌4次。加入稀釋的待測血清，37 ℃放置2 h。分別用PBS與PBST洗滌2次。加入酶標(biāo)抗體，37 ℃放置1 h后洗滌4次。加入底物液，37 ℃避光放置30 min。加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)，在波長為450 nm處測吸光度(absorbance,A)值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1組織學(xué)改變

正常對照組牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，結(jié)合上皮、溝內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)正常，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，見圖1A。實(shí)驗(yàn)性牙周炎組牙周炎癥破壞明顯，結(jié)合上皮與牙面分離,上皮向根方增殖，組織深部可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，牙周纖維水腫、變性，牙槽骨表面可見活躍的破骨細(xì)胞和骨吸收，牙槽嵴頂高度降低，見圖1B、C和D。黃芩組牙周組織炎性細(xì)胞浸潤比牙周炎組明顯減少，結(jié)締組織小血管增生，成纖維細(xì)胞增生活躍；骨吸收陷窩內(nèi)可見成纖維細(xì)胞，偶見破骨細(xì)胞，見圖1E、F。

Figure 1. Histological changes of periodontal tissues in mice(HE staining,×10).A:normal control group.The epithelium was integrated;the structure of periodontal connective tissue was dense;the alveolar crest and alveolar bone were also integrated and had no absorption.B:periodontitis group at 4th week.Periodontium showed lots of inflammatory cells and collagen fiber edema,and the alveolar crest was blunt.C:periodontitis group at 6th week.Periodontium showed lots of inflammatory cells withcapillary injection.D:periodontitis group at 8th week.Alveolar bone was seriously destroyed.E:ScutellariabaicalensisGeorgigroup at 6th week. A small number of inflammatory cells were observed in the periodontal tissue,and fibroblasts increased.F:ScutellariabaicalensisGeorgigroup at 8th week.Fibroblasts increased with capillary hyperplasia.

圖1各組牙周組織HE染色光鏡下觀察結(jié)果

2小鼠血清抗體的變化

2.1小鼠抗體IgG1的水平 各組小鼠血清IgG1水平見表1，結(jié)果表明黃芩組和牙周炎組的抗體IgG1水平在各個時(shí)點(diǎn)均明顯低于正常對照組(P<0.05)；牙周炎組抗體IgG1水平逐漸降低，第8周時(shí)較第4周降低明顯(P<0.05)。黃芩組抗體IgG1水平在第4周最低，之后各時(shí)點(diǎn)均比第4周明顯升高(P<0.05)；第8周時(shí)黃芩組抗體IgG1水平明顯高于牙周炎組(P<0.05)。

表1各組小鼠血清IgG1水平的變化

GroupIgG1(Avalue)4weeks6weeks8weeksControl0.392±0.0060.398±0.0060.399±0.009Periodontitis0.259±0.004▲0.256±0.005▲0.245±0.008▲SG0.258±0.006▲0.314±0.006*▲△0.344±0.058★▲△

▲P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsperiodontitis group；*P<0.05vs4 weeks after operation in the same group；★P<0.05vs6 weeks after operation in the same group.SG:ScutellariabaicalensisGeorgi.

2.2小鼠血清IgG2a的水平 各組小鼠血清IgG2a水平見表2，結(jié)果表明牙周炎組抗體IgG2a水平在第6周和第8周時(shí)較第4周明顯升高(P<0.05)， 在各個時(shí)點(diǎn)均明顯高于正常對照組(P<0.05)。黃芩組抗體IgG2a水平逐步降低，各時(shí)點(diǎn)比較均有顯著差異(P<0.05)。 從第6周開始，黃芩組IgG2a水平明顯低于牙周炎組(P<0.05)。

表2各組小鼠血清IgG2a水平的變化

GroupIgG2a(Avalue)4weeks6weeks8weeksControl0.607±0.0210.614±0.0050.608±0.009Periodontitis1.208±0.014▲1.353±0.010*▲1.414±0.015★▲SG1.210±0.009▲0.934±0.006*▲△0.743±0.009★▲△

▲P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsperiodontitis group;*P<0.05vs4 weeks after operation in the same group;★P<0.05vs6 weeks after operation in the same groupSG:ScutellariabaicalensisGeorgi.

討 論

牙周病是一種多因性疾病，宿主對于微生物的入侵引發(fā)的免疫及炎癥反應(yīng)是疾病發(fā)展與破壞進(jìn)程的決定性因素。大量的研究表明，輔助性T細(xì)胞對免疫調(diào)節(jié)起著重要的作用。生理狀態(tài)時(shí)，輔助性T細(xì)胞亞群Th1和Th2細(xì)胞功能處于動態(tài)平衡，這種平衡對維持正常的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能起至關(guān)重要的作用。Th1/Th2的極化可導(dǎo)致機(jī)體的免疫應(yīng)答偏離，引發(fā)各種疾病。牙周組織疾病時(shí)，Th1、Th2型細(xì)胞因子分泌異常，導(dǎo)致促炎/抑炎平衡的失調(diào)[6]。Th1細(xì)胞因子(如IL-1、IFN-γ和TNF-α)明顯高于Th2細(xì)胞因子，Th1免疫應(yīng)答是牙周炎時(shí)的優(yōu)勢應(yīng)答反應(yīng)。Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-10的濃度在無病灶區(qū)域及牙周治療后均顯著增加，提示Th2免疫應(yīng)答與牙周狀況的改善有關(guān)[7,8]。

Th1、Th2型細(xì)胞因子與特異性抗體IgG亞類表達(dá)有重要關(guān)系。研究證實(shí)Th2細(xì)胞因子刺激抗體IgG1的產(chǎn)生，而Th1細(xì)胞因子則誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體IgG2a[9]。Houri-Haddad等[10]采用小鼠皮下埋管法制作局部炎癥模型，觀察細(xì)胞因子和抗P.gingivalis的IgG抗體的水平，結(jié)果觀察到IgG1水平明顯升高，表明在牙周保護(hù)性免疫中免疫應(yīng)答向Th2方向發(fā)展。在Goncalves等[11]的實(shí)驗(yàn)中，采用P.gingivalis菌誘導(dǎo)小鼠牙周炎動物模型，觀察到IFN-γ明顯升高，血清的IgG2a抗體滴度增加，結(jié)果表明Th1型免疫反應(yīng)在牙周炎發(fā)生中起主導(dǎo)作用。因此通過比較血清IgG2a和IgG1水平的變化，可以間接反應(yīng)出Th1/ Th2細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)變化，此方法在實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛運(yùn)用[12]。在我們實(shí)驗(yàn)中，觀察到小鼠牙周炎組血清抗體水平在各個時(shí)點(diǎn)均與正常對照組有明顯差異，牙周炎時(shí)IgG1水平降低，而IgG2a則升高，提示在牙周炎時(shí)Th2細(xì)胞反應(yīng)受到了抑制，Th1細(xì)胞反應(yīng)活躍，牙周炎小鼠的免疫應(yīng)答向 Th1方向偏移，牙周的炎癥加重。 這個結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果是一致的[2，3]。

黃芩含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等黃酮類有效成分,具有抑菌、清熱、抗變態(tài)反應(yīng)等多種作用。研究證實(shí)，黃芩能抑制Th1細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生。俞燕等[13]觀察到黃芩苷通過抑制IL-1β、TNF-α的過度產(chǎn)生從而對大鼠感染性腦水腫有保護(hù)作用。在畢新嶺等[14]的研究中，觀察到黃芩甙能明顯抑制IFN-γ，TNF-α和IL-8等細(xì)胞因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)iNOS。在對牙周病治療研究中觀察到，黃芩苷能通過多種作用減少IL-1β的合成或抑制其作用[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到，黃芩治療組隨治療時(shí)間的延長抗體IgG2a水平逐步降低；而隨治療時(shí)間延長抗體IgG1的水平逐步升高。組織學(xué)也觀察到牙周組織出現(xiàn)明顯的修復(fù)反應(yīng)，炎性細(xì)胞浸潤減少，成纖維細(xì)胞增生活躍。我們的研究結(jié)果表明黃芩治療能使牙周炎時(shí)Th1的優(yōu)勢反應(yīng)受到抑制，提高Th2細(xì)胞反應(yīng)，Th1/ Th2的平衡向Th2方向偏移，從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)牙周炎Th1 /Th2細(xì)胞反應(yīng)的失衡。我們的研究結(jié)果提示黃芩有可能為牙周炎的免疫治療提供一條新途徑。

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EffectofScutellariabaicalensisGeorgionserumlevelsofIgG1andIgG2ainmousemodelofperiodontitis

HUANG Qi-ling1, SONG Ning2, LI Dong-jian3, HUANG Shi-guang1, ZHANG Zeng-fang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofStomatology,ShenzhenChildren’sHospital,Shenzhen518026,China;StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of the water extract ofScutellariabaicalensisGeorgion the experimental mouse model of periodontitis.METHODSThirty-six male Kunming mice (SPF grade and 12 weeks old) were randomly divided into 3 groups: (1) normal control group; (2) experimental periodontitis group: The animals were prepared by ligature of braided silk around the first maxillary molars, inoculated with putative periodontopathic baeteria,and then gavaged with distilled water at the beginning of the 5th week after the ligature; (3)ScutellariabaicalensisGeorgigroup(SG group).The periodontitis model animals were induced by the same way as above, then were gavaged with the water extract ofScutellariabaicalensisGeorgiat the beginning of the 5th week after the ligature. The mice were sacrificed at the end of 4, 6 and 8 weeks after the model of periodontitis was established. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining. The serum levels of IgG1 and IgG2a were determined by ELISA.RESULTSThe results of histological observation showed that the destruction of periodontal tissue in periodontitis group was more serious than that in other groups. Lots of inflammatory cells were observed in the deeper periodontal tissue. Osteoclastic resorption was observed on the surface of alveolar bone, and the height of alveolar bone decreased. The level of IgG1 in SG group increased and was significantly higher than that in periodontitis group at week 6 and week 8 (P<0.05). The level of IgG2a in periodontitis group also increased (P<0.05). However, the level of IgG2a in SG group decreased and was significantly lower than that in periodontitis group (P<0.05).CONCLUSIONThe water extract ofScutellariabaicalensisGeorgiplays a significant role in mouse periodontitis by restraining Th1 response and strengthening Th2 response.

Periodontitis; Antibodies;ScutellariabaicalensisGeorgi; Immunoregulation

R781.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.033

1000-4718(2011)01-0171-04

2010-08-09

2010-10-09

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題資助項(xiàng)目 (No. 2008315 )

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com