奧美沙坦酯對(duì)慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的保護(hù)作用*

盧曉梅， 金玉楠， 于艷秋， 張海鵬

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

奧美沙坦酯對(duì)慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的保護(hù)作用*

盧曉梅， 金玉楠， 于艷秋△， 張海鵬

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

目的探討奧美沙坦酯對(duì)慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的影響。方法健康C57小鼠分為假手術(shù)組(sham組)、慢性心力衰竭組(CHF組)和奧美沙坦酯治療組(OLM+CHF組)。以冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立慢性心力衰竭小鼠模型，其中奧美沙坦酯治療組以10 mg/kg劑量每天胃飼。12周時(shí)觀察各組小鼠心率、血壓、心功能狀況、血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平；real-time PCR法檢測腎臟腎素、血管緊張素1型受體(AT1R)和血管緊張素原(AGT)的表達(dá)情況，PAS染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與shan組相比，CHF組和OLM+CHF組左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)顯著增加(P<0.05),短軸縮短率(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF)顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組收縮壓、血肌酐和血尿素氮含量顯著增高，OLM+CHF組以上指標(biāo)較CHF組均顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，腎素、AT1R和AGT表達(dá)增高(P<0.05)，OLM+CHF組腎臟血管緊張素Ⅱ水平、腎素、AT1R和AGT表達(dá)較CHF組均顯著降低(P<0.05)。CHF組PAS染色可見腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)PAS陽性染色物明顯增多。OLM+CHF組腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)PAS染色陽性物質(zhì)與CHF組相比明顯減少。結(jié)論慢性心力衰竭可使腎內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)激活并導(dǎo)致腎臟損傷，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ起到腎臟保護(hù)作用。

奧美沙坦酯； 慢性心力衰竭； 腎損傷

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)病人出現(xiàn)腎功能不全即心腎綜合征的問題，逐漸引起人們的注意[1]。廣義的心腎綜合征是指心臟和腎臟中的一個(gè)器官對(duì)另一個(gè)器官的共同損害。狹義的心腎綜合征特指慢性心力衰竭引起進(jìn)行性腎臟損害并導(dǎo)致腎功能不全，通常認(rèn)為是慢性心力衰竭終末期的表現(xiàn)[2]。近年來，隨著老齡化社會(huì)的逐步形成和人民生活水平的提高，慢性心血管病的發(fā)病率明顯升高，內(nèi)外科治療的進(jìn)展使許多病人在疾病的急性期得到了有效的治療，病情發(fā)展到終末期的病人也明顯增加，因而常存在腎功能不全，出現(xiàn)心腎綜合征表現(xiàn)。心腎綜合征的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)過度激活是一個(gè)重要的發(fā)病因素[3]，RAS系統(tǒng)激活的產(chǎn)物血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以通過血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)和非血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)參與腎臟的損傷，其非血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)如促進(jìn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積等作用主要是由臟器局部產(chǎn)生的Ang Ⅱ介導(dǎo)的[4]。體內(nèi)外研究表明，奧美沙坦酯(olmesartan medoxomil, OLM)可以阻斷任何來源的Ang Ⅱ所致的相應(yīng)生理作用[5]。因而本研究應(yīng)用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立CHF模型，并給予奧美沙坦酯干預(yù)，觀察CHF小鼠腎臟RAS系統(tǒng)激活情況以及奧美沙坦酯對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

奧美沙坦酯購于上海三共制藥有限公司；Ang Ⅱ放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；RNA提取試劑盒;cDNA合成試劑盒購自大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；real-time PCR反應(yīng)試劑盒購自Applied Biosystems；引物序列合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；全自動(dòng)生化分析儀由日立生產(chǎn)。

2動(dòng)物模型的建立及分組

12周齡成年雄性C57小鼠36只，體重(25±3)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(sham組，n=11)；慢性心力衰竭組(CHF組，n=14)和奧美沙坦酯治療組(OLM+CHF組，n=11)。各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，人工呼吸機(jī)輔助呼吸。迅速打開左前胸并暴露心臟。用7/0尼龍絲線在左心耳下方2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，顯微鏡下確認(rèn)，將心臟復(fù)位后擠壓出胸腔內(nèi)氣體并迅速縫合關(guān)閉胸腔。Sham組穿線而不結(jié)扎動(dòng)脈，余步驟同CHF、OLM+CHF組。Sham組、CHF組每天給予正常飼料和飲水，OLM+CHF組術(shù)后給予正常飼料和飲水的同時(shí)開始給予奧美沙坦酯10 mg·kg-1·d-1灌胃。3組小鼠術(shù)后12周檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

3心率、血壓的測定和心臟超聲檢查

動(dòng)物處死前1 d，使用智能無創(chuàng)血壓計(jì)進(jìn)行清醒狀態(tài)下小鼠尾動(dòng)脈間接測壓，分別測定各組收縮壓(systolic blood pressure, SBP) 和心率(heart rate, HR)，每只動(dòng)物連續(xù)測5次計(jì)算平均值。術(shù)前及術(shù)后12周應(yīng)用美國惠普HP5500超聲儀及15 MHz高頻探頭行經(jīng)胸心臟超聲檢查。小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像及主動(dòng)脈血流情況。同時(shí)獲得二維引導(dǎo)下10個(gè)心動(dòng)周期的M型超聲心動(dòng)圖記錄。測量室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。

4血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)水平測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束小鼠腹腔麻醉后心臟取血，一部分離心分離血清，酶法測定小鼠尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)濃度。一部分制備血漿保存?zhèn)溆茫涣砣?0 mg腎臟標(biāo)本，在冰浴中勻漿，勻漿液中加入酶抑制劑后離心取上清液，血漿和腎組織勻漿按照Ang Ⅱ放免試劑盒說明檢測AngⅡ含量。

5Real-timePCR法檢測腎素、AT1R和血管緊張素原表達(dá)

取各組腎臟組織，按照試劑盒要求提取總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(引物序列見表1)，應(yīng)用SYBR green PCR master mix，在ABI Prism 7900T 序列檢測系統(tǒng)檢測分析，反應(yīng)條件為20 μL反應(yīng)體系，按94 ℃ 30 s，然后94 ℃ 5 s， 55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s 擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，分析溶解曲線，計(jì)算各個(gè)樣本的相對(duì)濃度。

表1 腎素、AT1R、AGT和GAPDH PCR 引物序列

AT1R:angiotensin type 1 receptor; AGT:angiotensinogen.

6PAS染色檢測腎組織病理學(xué)改變

實(shí)驗(yàn)完成后取腎組織，吸干表面水分并立即置于福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切成3 μm切片，PAS染色后光鏡下觀察腎小球、腎間質(zhì)和腎血管的結(jié)構(gòu)改變。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1死亡率及心功能評(píng)價(jià)

Sham組術(shù)后12周均存活且一般情況佳；CHF組死亡3只，死亡率為21.4%(3/14)，死因?yàn)閲?yán)重的心力衰竭，其余小鼠均不同程度出現(xiàn)呼吸急促、喘鳴、進(jìn)食和活動(dòng)減少等情況；OLM+CHF組小鼠也有輕微的進(jìn)食、活動(dòng)減少等情況出現(xiàn)。CHF和OLM+CHF組小鼠解剖可見左室腔擴(kuò)大，肝臟和肺臟淤血腫大，有胸腔積液和腹腔積液。與sham組比較，CHF和OLM+CHF組LVDd和LVDs顯著增加(P<0.05)，EF和FS顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組收縮壓顯著增高(P<0.05)，OLM+CHF組較CHF組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心率、血壓及心臟超聲指標(biāo)

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group．

2血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平

與sham組相比，CHF組小鼠BUN和Scr明顯升高，OLM+CHF組小鼠BUN和Scr水平較CHF組有顯著改善(P<0．05)。與sham組相比，CHF組血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，OLM+CHF組較CHF組腎臟血管緊張素Ⅱ水平顯著降低，血漿水平顯著增高(P<0.05),見表3。

表3血清肌酐、尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平測定

GroupBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)PlasmaangiotensinⅡ(pmol/L)KidneyangiotensinⅡ(fmol/g)Sham6.6±0.946.3±7.861.3±22.128.4±13.9CHF24.9±5.4#92.0±12.7#93.2±18.2#169.3±19.8#OLM+CHF19.7±4.2*69.6±4.3*214.6±38.6*98.8±10.5*

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group．

3PAS染色病理學(xué)觀察結(jié)果

PAS染色見正常小鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)中未見炎癥細(xì)胞浸潤。CHF組可見腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小管管腔擴(kuò)張，基底膜不規(guī)則增厚，腎小管間質(zhì)PAS染色陽性物明顯增多。OLM+CHF組小鼠腎臟病變均有不同程度改善，腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)PAS染色陽性物質(zhì)明顯減少,見圖1。

圖1各組PAS染色結(jié)果

4腎素、AT1R和AGT表達(dá)結(jié)果

與sham組相比，CHF組腎素、AT1R和AGT表達(dá)增高(P<0.05)，OLM+CHF組腎素、AT1R和AGT表達(dá)較CHF組均顯著降低(P<0.05),見表4。

表4不同組別腎臟組織中renin、AT1R和AGTmRNA表達(dá)

GroupReninAT1RAGTSham0.20±0.021.55±0.071.00±0.10CHF1.11±0.07#2.11±0.10#1.47±0.07#OLM+CHF0.46±0.07*1.74±0.07*1.33±0.09*

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group.

討 論

在心功能不全時(shí)，腎臟血流灌注減少和RAS活化等因素可導(dǎo)致腎功能的進(jìn)行性下降[6]。傳統(tǒng)認(rèn)為腎素-血管緊張素系統(tǒng)在全身起著重要的作用，如調(diào)節(jié)醛固酮的釋放，調(diào)節(jié)體液平衡等[7]。然而近年來發(fā)現(xiàn)組織局部RAS系統(tǒng)激活可介導(dǎo)AngⅡ有關(guān)細(xì)胞生長、心肌及血管增生肥厚、心室及血管重構(gòu)、腎臟纖維化等長期效應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟局部RAS過度激活與許多腎臟疾病包括腎病和腎動(dòng)脈硬化等有關(guān)。 RAS過度激活的主要效應(yīng)包括氧自由基的生成、 NF-κB的激活以及纖維母細(xì)胞增殖、炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等[9]。RAS過度激活后產(chǎn)生的AngⅡ可作用于腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞，導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能損害[10]。我們的研究結(jié)果表明，模型組LVDd和LVDs顯著增加，F(xiàn)S和EF顯著降低，表示心功能顯著降低，而PAS 染色結(jié)果和血肌酐和血尿素氮含量增高說明模型組出現(xiàn)了腎小球硬化和腎功能不全表現(xiàn)，同時(shí)體內(nèi)RAS系統(tǒng)激活，血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，腎臟腎素、AT1R和AGT表達(dá)增高，與以往研究結(jié)果相吻合。

AngⅡ受體有4種亞型，但其生理效應(yīng)多由AT1R介導(dǎo)。研究顯示AT1R 廣泛分布于腎組織的各種細(xì)胞， AT1R在AngⅡ作用下可導(dǎo)致腎血管收縮，腎血流量下降及腎小球內(nèi)壓力增加；刺激系膜細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生并抑制其降解；刺激纖溶酶原激活物抑制劑-1及其它一些生長因子的產(chǎn)生[11]。 而AT2R 主要分布于腎小球入球小動(dòng)脈和系膜細(xì)胞等處，可使入球小動(dòng)脈擴(kuò)張，并可抑制系膜細(xì)胞生長并刺激其凋亡，同時(shí)AT2R在腎臟能刺激產(chǎn)生NO，所以這2種受體的生理作用幾乎是相互拮抗的[12]。 我們研究應(yīng)用的奧美沙坦酯是一種前體藥物，經(jīng)胃腸道吸收水解為奧美沙坦。奧美沙坦為選擇性AT1R拮抗劑，通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1R結(jié)合而阻斷血管緊張素Ⅱ的作用。我們的結(jié)果顯示治療組腎功能損傷相對(duì)減輕，可見奧美沙坦酯通過與AT1R的結(jié)合抑制了腎內(nèi)RAS系統(tǒng)的過度激活，從而阻斷了血管緊張素Ⅱ?qū)δI臟的損傷作用，我們還發(fā)現(xiàn)OLM組血漿血管緊張素Ⅱ顯著增高，循環(huán)中增高的血管緊張素Ⅱ可能會(huì)與AT2R結(jié)合，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，慢性心力衰竭可使腎內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)激活，并導(dǎo)致腎小球硬化和腎臟損傷，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ起到腎臟保護(hù)作用。

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Protectiveeffectofolmesartanmedoxomilonrenalinjuryinmicewithchronicheartfailure

LU Xiao-mei, JIN Yu-nan, YU Yan-qiu, ZHANG Hai-peng

(DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:yqyu@mail.cmu.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of olmesartan medoxomil on renal injury in mice with chronic heart failure (CHF).METHODSC57 mice were divided into sham operation group (sham group), chronic heart failure group (CHF group) and olmesartan medoxomil treatment group (OLM+CHF group). The experimental CHF model was established by ligation of left anterior descending branch of coronary artery. The mice in OLM+CHF group were fed with olmesartan medoxomil daily at the dose of 10 mg/kg. After 12 weeks, the heart rate, blood pressure, cardiac functions, serum creatinine and blood urea nitrogen levels, the angiotensin Ⅱ levels in plasma and renal tissues were measured. The expression levels of renal rennin, angiotensin type 1 receptor(AT1R) and angiotensinogen (AGT) were determined by real-time PCR. The pathological changes of the kidneys were observed under microscope with PAS staining.RESULTSCompared with sham group, left ventricular end-diastolic dimension(LVDd) and left ventricular end-systolic dimension(LVDs) were significantly increased (P<0.05), while fractional shortening(FS) and ejection fraction(EF) were significantly decreased in the mice of CHF and OLM+CHF groups (P<0.05). Compared with sham group, systolic blood pressure, the levels of serum creatinine and blood urea nitrogen, and the PAS staining positive area of the kidneys were significantly increased in CHF group (P<0.05), while in OLM+CHF group these changes were significantly lower than those in CHF group (P<0.05). Compared with sham group, the levels of angiotensin Ⅱ in plasma and kidney, the expression of renin, AT1R and AGT were increased in CHF group (P<0.05). In OLM+CHF group, the angiotensin Ⅱ level in the kidneys and the expression of renin, AT1R and AGT were significantly lower than those in CHF group (P<0.05).CONCLUSIONChronic heart failure activates the intrarenal renin-angiotensin system, leading to glomerular sclerosis and renal injury. Olmesartan medoxomil protects kidneys by inhibiting the effects of angiotensin Ⅱ.

Olmesartan medoxomil; Chronic heart failure; Renal injury

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.028

1000-4718(2011)01-0145-04

2010-05-19

2010-11-02

遼寧省教育廳高等學(xué)?？蒲匈Y助項(xiàng)目(No. 20060946)；遼寧省科技廳藥物源頭創(chuàng)新研究資助項(xiàng)目(No. 2006226031-211)

△通訊作者 Tel：024-23256666-5362； E-mail: yqyu@mail.cmu.edu.cn