聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素對急性肺損傷ICAM-1和E,P-selectin的影響

祝雪花, 王萬鐵, 戴雍月, 蔣柳明

(溫州醫(yī)學院1護理學院, 2病理生理教研室, 3附屬第一醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325035)

聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素對急性肺損傷ICAM-1和E,P-selectin的影響

祝雪花1, 王萬鐵2△, 戴雍月2, 蔣柳明3

(溫州醫(yī)學院1護理學院,2病理生理教研室,3附屬第一醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325035)

目的制作急性肺損傷(ALI)模型并檢測細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E-選擇素和P-選擇素在實驗兔血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的變化情況以探討三者在ALI中的作用并觀察聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素對其的影響。方法24只健康兔隨機分成3組：對照組(NC組)，油酸損傷組(OA組)，氨溴索+小劑量肝素治療組(AH組)。采用耳緣靜脈法靜注油酸復(fù)制兔ALI模型，檢測各組動脈氧分壓(PaO2)，ELISA法檢測ICAM-1和E-選擇素，TUNEL法檢測凋亡指數(shù)(AI)，免疫組化檢測P-選擇素，電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化并測定濕干重比值(W/D)。結(jié)果與NC組比較， OA組和AH組PaO2顯著降低(P<0.01)，但AH組顯著高于OA組(P<0.01)； ICAM-1、E-選擇素的濃度(血清、肺組織及BALF中)、肺組織AI和W/D升高(P<0.05或P<0.01)，但AH組低于OA組(P<0.05或P<0.01)。與同組給予治療藥物前0 h比較，NC組無差異(P>0.05),OA組各時點PaO2顯著降低(P<0.01)，ICAM-1和E-選擇素濃度顯著升高(P<0.01)，AH組各時點PaO2降低(P<0.05)、ICAM-1和E-選擇素濃度升高(P<0.05)。肺組織中P-選擇素在OA組表達較為廣泛：主要為炎癥細胞、毛細血管的內(nèi)皮細胞和血管內(nèi)的血漿等，NC組呈低水平表達，AH組的表達介于兩者之間。細胞凋亡以O(shè)A組最為明顯，NC組未見細胞凋亡或偶有凋亡，AH組凋亡的細胞明顯比OA組減少。結(jié)論在OA致ALI時，ICAM-1、E-選擇素和P-選擇素明顯增高，參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展；聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素可以降低ICAM-1、E-選擇素和P-選擇素的水平，減輕肺臟細胞的損傷、改善肺通氣和換氣功能、減輕肺水腫，從而發(fā)揮對ALI的防治作用。

胞間黏附分子-1； E-選擇素； P-選擇素； 急性肺損傷； 氨溴索； 肝素

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，迄今仍未完全闡明，因此借助于一些動物模型進行發(fā)病機制和相關(guān)治療的實驗研究顯得尤為重要。近來研究發(fā)現(xiàn), 多形核白細胞(polymorphonuclear leucocyte， PMN)對內(nèi)皮細胞的黏附、跨越血管內(nèi)皮、在肺內(nèi)大量“扣押”以及PMN的激活、釋放蛋白酶、氧自由基致肺組織損傷都需要多種細胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)的參與[1,2]。氨溴索是一種新型的黏液溶解劑，近年來，其對呼吸系統(tǒng)的保護作用倍受關(guān)注。小劑量肝素可抑制補體系統(tǒng)及白細胞的趨化性，中和炎癥因子，降低內(nèi)皮細胞的通透性，故具有一定的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其對ALI 的治療作用越來越引起人們的關(guān)注。但是，尚未見到有關(guān)氨溴索與小劑量肝素聯(lián)合用藥對ALI治療作用的報道。本文探討了細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)及P-選擇素(P-selectin)在ALI中的變化及意義，并觀察聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素對以上指標的影響，為臨床治療ALI/ARDS提供新的思路。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物及分組 健康日本大耳白兔24只，雌雄不拘，兔齡8-10個月，體重為2.1-2.8 kg，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證為SYXK(浙)2003-0025。隨機分為3組(每組8只)：生理鹽水對照組(NC組)、油酸損傷組(OA組)和氨溴索+小劑量肝素組治療組(AH組)。

1.2主要試劑與儀器 油酸(oleic acid, OA)購于Sigma；鹽酸氨溴索注射液購于德國勃林格殷格翰公司；肝素鈉注射液購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；ICAM-1、E-selectin試劑盒購自Peprotech；TUNEL法凋亡檢測試劑盒購自Roche；P-selectin免疫組化試劑盒購自Bethyl。低溫高速離心機(Hettich Universal 32R)；血氣分析儀(Compact 3，Roche)；酶標儀(Multiskan Spectrum)；洗板機(1575型，Bio-Rad)。

2方法

2.1實驗動物準備 各組動物在實驗前均禁食12 h，稱重，以25%烏拉坦4 mL·kg-1靜脈注射麻醉后仰臥固定于兔臺，于頸正中部切開，在多導生理記錄儀監(jiān)測下，分離左頸總動脈，結(jié)扎遠心端，切開近心端插管供采血用；并經(jīng)氣管切開插入氣管導管，插入深度約2.5 cm，醫(yī)用縫合線扎緊固定，并行機械通氣，呼吸機參數(shù)設(shè)置如下:潮氣量15 mL·kg-1，呼吸頻率30次/min，吸呼比1∶2，吸入氧濃度100%。實驗過程中意外死亡的大白兔不納入本研究。

2.2兔ALI模型的復(fù)制與給藥方法 動物模型的建立參照Nakazawa等[3]描述的方法，選用Sigma公司生產(chǎn)的編號為O1008的油酸，純度達到99.96%，按0.08 mL· kg-1的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射 (NC組除外)，建立油酸型ALI模型，抽取動脈血測血氣分析，以氧合指數(shù)(PO2/FiO2) ≤300 mmHg，且維持30 min不升高為模型成功的判定標準。動物模型制備成功后，AH組自耳緣靜脈輸入氨溴索(14 mg·kg-1) +小劑量肝素(50 U·kg-1·h-1), 持續(xù)6 h(化入林格氏液中微泵維持劑量)，NC組及OA組自耳緣靜脈輸入等量容積的生理鹽水。實驗期間所有動物均經(jīng)靜脈輸入乳酸鈉林格注射液8 mL·kg-1·h-1，持續(xù)6 h，取標本后，阻斷自主呼吸。

2.3標本的留取 各組大耳白兔分別在注入氨溴索+小劑量肝素或生理鹽水(以下簡稱給藥)前和給藥后6 h采血2 mL，留取血清方法為室溫靜置1 h，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，留取上清液，放入EP管中-70 ℃保存；做血氣分析標本留取方法為于1、2、 4、 6 h抽0.5 mL動脈血至經(jīng)肝素潤滑的玻璃針筒內(nèi)馬上用橡皮塞隔絕空氣于10 min內(nèi)進行測定；給藥6 h后阻斷自主呼吸，左頸總動脈放血處死動物，夾住實驗兔氣管避免被血液等污染，迅速剖胸取肺臟，肉眼觀察肺病理改變；以4 ℃生理鹽水10 mL灌注左肺，重復(fù)3次，回收灌洗液，回收率70%左右，將收集的支氣管肺泡灌洗液以2 000 r/min離心10 min，取其上清液置-70 ℃保存；濾紙輕輕吸干右肺表面血跡，右肺下葉剪下放入凍存管中，貼好標簽置入液氮桶，備用于肺勻漿；右肺上葉剪下1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm大小組織，2.5%戊二醛固定，待用H-7500透射電鏡進行肺超微結(jié)構(gòu)的觀察；右肺中葉用電子天平稱濕重后置恒溫干燥箱中 (80 ℃、20 h) 烘干，再稱干重，計算濕重與干重比(wet/dry weight, W/D)。

2.4指標檢測 動脈血氣指標檢測用奧地利生產(chǎn)的Compact 3型血氣分析儀進行檢測，直接讀數(shù)記錄結(jié)果。血清、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織中ICAM-1和E-selectin采用酶聯(lián)免疫吸附測定法。肺組織中的P-selectin采用免疫組化檢測，其計分標準分以下幾種。(1)按陽性染色細胞數(shù)占視野細胞總數(shù)的多少計分為A：沒有陽性染色細胞記為-；陽性細胞百分數(shù)<25%為+；25%-50%為++；>50%為+++。(2)按著色細胞染色強度計分為B：細胞呈陰性染色為-；染色弱，陽性細胞呈淡黃色為+；染色中等，陽性細胞呈棕黃色為++；染色強，陽性細胞呈棕褐色為+++。肺組織中凋亡指數(shù)采用TUNEL法檢測。以上檢測方法均按照說明書操作。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1氨溴索+小劑量肝素對實驗兔肺組織病理的影響

NC組線粒體結(jié)構(gòu)完整，微絨毛整齊，Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞無水腫，板層小體無排空現(xiàn)象。OA組肺泡間隔明顯增寬, 肺泡腔內(nèi)大量炎癥細胞和紅細胞滲出，線粒體空化，Ⅱ型上皮細胞多數(shù)板層小體排空現(xiàn)象明顯，形成空泡, 毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、微絨毛減少。AH組肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)炎癥細胞和紅細胞滲出、線粒體空化較OA組輕,Ⅱ型上皮細胞板層小體排空減輕，形成空泡數(shù)量減少，毛細血管內(nèi)皮細胞之間連接接近正常，見圖1。

Figure 1. The ultrastructural changes of lung tissues in different groups were observed by electron microscopy.

圖1各組肺組織電鏡下觀察

2氨溴索+小劑量肝素對實驗兔動脈血氧分壓(PaO2)的影響

與NC組相同時點比較，除AH組1 h外，AH組其它各時點及OA組所有時點PaO2均降低(P<0.01)，AH組1 h與NC組1 h的PaO2比較無顯著差異(P>0.05)；AH組與OA組相同時點比較，除0 h外其它各時點PaO2均升高(P<0.01)，AH組0 h與OA組0 h比較無顯著差異(P>0.05)；與同組給予治療藥物前(0 h)比較，NC組無顯著差異(P>0.05),OA組各時點PaO2均降低(OA 1 hP<0.05,其它各時點P<0.01),見表1。

3氨溴索+小劑量肝素對實驗兔血清、肺組織、BALF中ICAM-1、E-selectin及肺組織中P-selectin的影響

3.1對實驗兔血清、肺組織、BALF中ICAM-1、E-selectin的影響 與NC組比較，OA組0 h、AH組0 h及6h血清中的ICAM-1無顯著差異(P>0.05)，這2組0 h血清中的E-selectin和6 h血清(AH組6 h血清中的ICAM-1除外)、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中ICAM-1和E-selectin濃度均顯著升高(P<0.01)。與OA組比較，除0 h血清外AH組其它各類別均明顯降低(P<0.01)。與同組給予治療藥物前(0 h)比較，NC組ICAM-1無顯著差異(P>0.05)、E-selectin顯著升高(P<0.01)， OA組及AH組兩者指標顯著升高(P<0.01),見表2。

表1 各組實驗兔不同時點PaO2的變化

**P<0.01vsNC group at the same time point;▲▲P<0.01vsOA group at the same time point;#P<0.05，##P<0.01vsthe same group at 0 h (before treatment).

表2 各組實驗兔血清、肺組織、BALF中ICAM-1和E-selectin的變化

**P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsOA group;##P<0.01vsthe same group at 0 h (before treatment).

3.2對實驗兔肺組織中P-selectin的影響 (1)NC組: P-selectin呈低水平表達，陽性細胞染色弱，呈淡黃色，陽性細胞百分數(shù)<25%(A:+;B:+)。(2)OA組: P-selectin呈高水平表達，主要為炎癥細胞、毛細血管的內(nèi)皮細胞和血管內(nèi)的血漿等，陽性細胞染色強，呈棕褐色，陽性細胞百分數(shù)>50%(A:+++;B:+++)。(3)AH組: 與OA組比較，P-selectin呈中等水平表達，陽性細胞染色一般，呈棕黃色，陽性細胞百分數(shù)25%-50%(A:++;B:++)，見圖2。

Figure 2. The P-selectin expression in lung tissues of different groups(DAB,×200).A:NC group;B:OA group;C:AH group.

圖2各組肺組織中P-selectin表達

4氨溴索+小劑量肝素對實驗兔肺組織中凋亡指數(shù)及W/D的影響

與NC組相同時點比較，OA組凋亡指數(shù)顯著升高，W/D值顯著增加(P<0.01)，AH組W/D值增加(P<0.05)，凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與OA組相同時點比較，AH組凋亡指數(shù)顯著降低，W/D值明顯減少(P<0.01),見表3。

表3各組實驗兔肺組織中凋亡指數(shù)及W/D值的變化

GroupAI(%)W/DNC0.84±0.175.28±0.26OA6.51±0.34**6.49±0.60**AH2.57±0.11**▲▲5.78±0.39*▲▲

*P<0.05，**P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsOA group.

討 論

本研究顯示，OA組PaO2明顯下降，PO2/FiO2≤300 mmHg；肺W/D值顯著上升，病理學檢查炎癥病變顯著，符合典型的ALI表現(xiàn)，說明本實驗OA靜脈注射復(fù)制實驗兔ALI模型是成功的。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性肺損傷實驗兔血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中ICAM-1、E-selectin濃度顯著增高及肺組織中P-selectin表達增加；同時還提示在ALI時肺組織中凋亡指數(shù)顯著升高、W/D值明顯增加，這提示急性肺損傷的發(fā)生與ICAM-1、E-selectin濃度增高、P-selectin表達增加相關(guān)，這也與范麗麗等[4]和馬希剛等[5]的報道相符。有研究表明，ICAM-1介導了上皮細胞與中性粒細胞的黏附而且促進了中性粒細胞的活化[6,7]，抑制或拮抗ICAM- 1的表達能夠減輕ALI[8]。 多形核白細胞(PMN)與內(nèi)皮細胞形成接觸時需要E-selectin作為啟動因子；P-selectin主要參與介導白細胞與內(nèi)皮細胞的起始黏附。然而本研究NC組亦可見少許細胞凋亡,而且NC組干預(yù)后6h血清E-selectin亦顯著升高,這可能與NC組給予高濃度吸氧有關(guān)[9]。

氨溴索(商品名為沐舒坦)是一種新型的黏液溶解劑，近年來，其對呼吸系統(tǒng)的保護作用倍受關(guān)注。肝素具有抗凝、預(yù)防早期DIC形成的作用，最近研究表明[10,11]，肝素能中和許多炎癥因子，降低內(nèi)皮細胞的通透性，故具有一定的抗炎作用?，F(xiàn)在國內(nèi)外對急性肺損傷的保護治療研究多集中于山莨菪堿、激素以及免疫抑制劑上，對肝素的保護作用研究較少。有人曾將小劑量肝素應(yīng)用于肺損傷的臨床治療收到較好效果，但確切機制需作深入研究[12]。

本實驗結(jié)果顯示通過靜脈輸注聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素后，PaO2迅速升高，表明實驗兔肺通氣功能和換氣功能改善；ICAM-1、E-selectin和P-selectin表達下降，凋亡指數(shù)下降，濕/干重比值及肺含水量下降，大部分肺組織無明顯病理學改變，提示聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素對急性肺損傷具有防治作用。

AH組實驗兔0 h血清中ICAM-1、E-selectin濃度與OA組無顯著差異,但6 h血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中ICAM-1、E-selectin濃度較OA組顯著下降(P<0.01)，甚至6h血清中的ICAM-1已下降至NC組水平；肺組織中P-selectin表達較0A組下降；同時還顯示AH組肺組織細胞的凋亡指數(shù)顯著下降、W/D值明顯減少，這提示聯(lián)合應(yīng)用氨溴索與小劑量肝素可以有效抑制ICAM-1和E-selectin的表達，從而抑制PMN與內(nèi)皮細胞的黏附，改善肺通氣和換氣功能、減輕肺水腫，以發(fā)揮對急性肺損傷的防治作用。

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Effectsofambroxolcombinedwithlow-doseheparinonproductionofICAM-1andE,P-selectininacutelunginjury

ZHU Xue-hua1, WANG Wan-tie2, DAI Yong-yue2, JIANG Liu-ming3

(1SchoolofNursing,2DepartmentofPathophysiology,3DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,ChinaE-mail:wwt@wzmc.edu,cn)

AIM: To study the production of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), E-selectin and P-selectin in serum, lung tissues and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of acute lung injury(ALI) model and to observe the effects of ambroxol combined with low-dose heparin on the changes of the 3 factors above.METHODSTwenty-four healthy rabbits were randomly divided into 3 groups: normal saline control group (NC), oleic acid injury group (OA), ambroxol+ heparin treatment group (AH). The rabbit ALI model was induced by oleic acid injection through auricular vein. Partial pressure of O2in artery(PaO2) was analyzed.The concentrations of ICAM-1 and E-selectin were detected by ELISA.The apoptosis index(AI) was measured by TUNEL method.The expression of P-selectin was determined by immunohistochemical method.The ultrastructural changes of the lung tissues were observed under electron microscope, and the lung wet/dry ratio(W/D) was calculated.RESULTSPaO2in AH group and OA group was significantly lower (P<0.01) than that in NC group, and PaO2in AH group was significantly higher than that in OA group (P<0.01). The concentrations of ICAM-1 and E-selectin in serum, lung tissues and BALF, and AI and W/D in lung tissues in AH group were higher (P<0.05 orP<0.01) than those in NC group, and was lower than those in OA group (P<0.05 orP<0.01). In NC group, no significant change of the above parameters at all time points was observed (P>0.05). In OA group, PaO2was significantly decreased (P<0.01) with the pathological process developed, and the concentrations of ICAM-1 and E-selectin were significantly increased. In AH group, PaO2was decreased (P<0.05),and the concentrations of ICAM-1 and E-selectin were increased with the process of ALI developed. The P-selectin expression in lung tissues of OA group was distributed mainly in inflammatory cells, capillary endothelial cells and plasma. From low to high levels, the order was NC group < AH group < OA group in the expression of P-selectin. The most obvious apoptosis was observed in OA group. No apoptosis or occasional positive cells were found in NC group. The apoptotic rate in AH group was significantly reduced compared with that in OA group.CONCLUSIONIn ALI induced by OA, ICAM-1, E-selectin and P-selectin are significantly increased and are involved in the occurrence and development of ALI. Ambroxol combined with low-dose heparin reduces the levels of ICAM-1, E-selectin and P-selectin, the pulmonary edema and the lung injury, improves pulmonary functions, and plays an important role in the prevention and treatment of acute lung injury.

Intercellular adhesion molecule-1; E-selectin；P-selectin; Acute lung injury; Ambroxol; Heparin

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.018

1000-4718(2011)01-0092-05

2010-07-21

2010-11-22

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Tel: 0577-86689817； E-mail: wwt @wzmc.edu.cn