槲皮素抑制魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡*

畢 偉， 朱麗紅， 王傳明， 梁嫣然， 陶恩祥△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510120；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

槲皮素抑制魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡*

畢 偉1▲， 朱麗紅2▲， 王傳明1， 梁嫣然1， 陶恩祥1△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510120；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

目的探討槲皮素對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法運(yùn)用魚藤酮誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞，經(jīng)300 μmol/L槲皮素預(yù)處理后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位,比較各組的差異。結(jié)果與魚藤酮組相比，槲皮素加魚藤酮處理組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，凋亡率降至6.3%(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)增加(P<0.01)，Bax表達(dá)降低(P<0.01)，線粒體膜電位上升(P<0.01)。結(jié)論槲皮素對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有抑制作用，上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，維持線粒體膜電位可能是其作用的機(jī)制之一。

槲皮素； 魚藤酮； 細(xì)胞凋亡； PC12細(xì)胞； 帕金森病

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年最常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，在60歲以上人群中患病率高達(dá)1%，PD病理上表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性、丟失，膠質(zhì)增生，胞漿內(nèi)出現(xiàn)特征性嗜酸性包涵體即路易體(Lewy body，LB)[1]。大量研究顯示，雌激素在維持黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)的功能完整中發(fā)揮重要作用[2,3]。但是雌激素有增加女性患子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，因而限制了它的臨床應(yīng)用。槲皮素與己烯雌酚相似而具有雌性激素樣作用，是植物類雌激素，且不會增加女性患子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[4,5]。那么該藥能否代替雌激素對PD黑質(zhì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用尚缺乏研究。本研究采用魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡模型，觀察槲皮素對神經(jīng)元凋亡的抑制作用，以及槲皮素抑制凋亡的可能細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞((已經(jīng)由神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)分化)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM-F12為Hyclone產(chǎn)品，胎牛血清為TBD產(chǎn)品。槲皮素(純度﹥98%)、魚藤酮、胰酶、MTT、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及核染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(Dapi)為Sigma產(chǎn)品。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒為Beckman Coulter產(chǎn)品。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)Ⅰ 抗為Cell Signaling Technology產(chǎn)品。5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzim-idazolylcarbocyanine iodide (JC-1) 檢測試劑盒為Molecular Probe產(chǎn)品。熒光倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson產(chǎn)品。

2方法

2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)方法 大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法 設(shè)立4個組：空白對照組：魚藤酮組(1.6 μmol/L)、單純槲皮素處理組(300 μmol/L)、槲皮素加魚藤酮處理組。

空白對照組：細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入任何藥物。魚藤酮組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入魚藤酮孵育24 h。單純槲皮素處理組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入槲皮素孵育24 h。槲皮素加魚藤酮處理組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入槲皮素預(yù)處理2 h后，加入魚藤酮，二者共同孵育24 h。

2.3PC12細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察 將PC12細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)的蓋玻片，待細(xì)胞貼壁生長24 h后,各實(shí)驗(yàn)組給以不同因素處理24 h。小心棄去上清，加入PBS清洗3次，加入新鮮配制的 4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3次，加Dapi染液室溫避光染色3 min(Dapi 1 mg/L)，用封片液(20 mmol/L 檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH 5.5)封片后熒光顯微鏡下觀察并攝片。

2.4Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞凋亡 每組3孔合并后按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[6]。用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，懸浮于無血清DMEM-F12中，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，預(yù)冷PBS洗1次，重懸400目篩網(wǎng)過濾，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109cells/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC(20 mg/L)和2.5 μL PI(250 mg/L)，輕輕混勻，避光冰上放置15 min，加入400 μL預(yù)冷1×binding buffer輕輕振蕩，轉(zhuǎn)至流式細(xì)胞儀檢測管，30 min內(nèi)完成檢測。

2.5Western blotting 檢測Bax、Bcl-2的表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測定含量，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育(Bax、Bcl-2的抗體稀釋濃度均為1∶1 000)過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，顯影，凝膠成像儀照相并分析蛋白條帶灰度值。

2.6JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位 經(jīng)藥物處理24 h后，6孔板每孔加200 μL JC-1(10 mg/L)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min。37℃ DMEM-F12清洗2次，再用37 ℃ PBS清洗1次，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞。室溫、1 500 r/min 離心2 min，樣品緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。以發(fā)射波長590 nm紅色熒光值與530 nm綠色熒光值百分比表示線粒體膜電位。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)Dapi染色，空白對照組可見細(xì)胞核出現(xiàn)彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光,見圖 1A；1.6 μmol/L魚藤酮作用PC12細(xì)胞24 h后，出現(xiàn)大量的細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或是顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞，見圖1B；300 μmol/L槲皮素和魚藤酮同時處理時，呈固縮狀態(tài)的細(xì)胞核數(shù)明顯減少，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈均勻的低密度藍(lán)光,見圖 1C,提示槲皮素可明顯減輕魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡作用。

2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

正?；罴?xì)胞Annexin V及PI均低染，分布于流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)(LL)；早期凋亡細(xì)胞Annexin V高染而PI低染，分布于圖的右下區(qū)(RL)；晚期凋亡或死亡細(xì)胞Annexin V及PI均高染，分布于圖的右上區(qū)(RU),見圖 2；將早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)總和稱為總凋亡率。結(jié)果顯示，空白對照組及單純槲皮素處理組僅有少量凋亡細(xì)胞，分別為3.6%±1.7%和4.6%±2.2%。魚藤酮組可見較多的凋亡細(xì)胞24.7%±3.3%，較空白對照組明顯增多(n=3,P<0.01)。槲皮素加魚藤酮處理組可見散在的凋亡細(xì)胞6.3%±1.9%，較魚藤酮組明顯減少(n=3，P<0.01)。提示槲皮素可降低魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

Figure 1. Effect of quercetin on apoptosis induced by rotenone in PC12 cells (×200). A: control; B: rotenone (1.6 μmol/L); C: rotenone (1.6 μmol/L)+ quercetin (300 μmol/L); D:quercetin (300 μmol/L).

圖1槲皮素對魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

Figure 2. FACS analysis of annexin V/PI in apoptotic cells. A: control; B: rotenone (1.6 μmol/L); C: rotenone (1.6 μmol/L)+ quercetin (300 μmol/L); D:quercetin (300 μmol/L).

圖2AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

3Westernblotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

圖3所示，魚藤酮誘導(dǎo)損傷后Bcl-2的表達(dá)下降，Bax的表達(dá)增加，與之相比，槲皮素加魚藤酮處理組Bcl-2的表達(dá)明顯增加，Bax的表達(dá)明顯減少(P<0.01)。結(jié)果表明槲皮素對抗魚藤酮誘導(dǎo)的凋亡與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

圖3Westernblotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

4線粒體膜電位的檢測

線粒體親脂性陽離子染料JC-1特異性地進(jìn)入線粒體，分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上，線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。藥物作用24 h后，檢測PC12細(xì)胞胞內(nèi)線粒體膜電位的改變。結(jié)果顯示， 1.6 μmol/L魚藤酮處理組可明顯降低線粒體膜電位，紅/綠熒光強(qiáng)度比值下降(P<0.01)；槲皮素加魚藤酮處理組紅/綠熒光強(qiáng)度比值較魚藤酮處理組明顯增加(P<0.01)，提示槲皮素可一定程度上逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的線粒體膜電位減低。單純槲皮素處理組紅/綠熒光強(qiáng)度比值與空白對照組差異不顯著(P>0.05),見圖4。

圖4槲皮素對PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

討 論

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能在PD的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡中起重要作用[7,8]。不同類型的環(huán)境毒素或(和)遺傳變異可分別誘發(fā)氧化應(yīng)激，α-突觸核蛋白的異常折疊聚集及小膠質(zhì)細(xì)胞激活等，每個因素都可能成為啟動因子，并誘發(fā)其它因素的損害機(jī)制[9]。這種相互協(xié)同作用形成了不斷加強(qiáng)的“正反饋”效應(yīng)，使原本單一因素的損害作用在多巴胺神經(jīng)元內(nèi)被不斷擴(kuò)大。這可能是多巴胺神經(jīng)元選擇性和進(jìn)行性丟失的關(guān)鍵因素，而細(xì)胞凋亡則是其主要形式[10]。

Bcl-2蛋白家族與PD細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡基因bcl-2、bcl-xl的啟動子區(qū)含有雌激素受體反應(yīng)元件，雌激素可使Bcl-2表達(dá)的蛋白量升高，使1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)小鼠模型中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少[11]。過表達(dá)Bcl-2可以通過拮抗Bax的激活、減少活性氧片段生成，從而阻止多巴胺誘導(dǎo)的凋亡[12]。羅蔓等[13]研究發(fā)現(xiàn)雌激素主要通過與Bcl-2家族蛋白的作用，上調(diào)Bcl-2蛋白與下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞保護(hù)作用。Ishikawa等[14，15]認(rèn)為，對于多種類型的正常細(xì)胞來說，槲皮素都有阻止其細(xì)胞凋亡發(fā)生的效應(yīng)。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于自然界各種植物的花、葉、果實(shí)之中，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Dapi染色法觀察到，槲皮素可明顯減少呈固縮狀態(tài)的細(xì)胞核，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈均勻的低密度藍(lán)光。經(jīng)Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法，觀察到槲皮素可以明顯地抑制魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。Western blotting檢測Bax、Bcl-2蛋白經(jīng)槲皮素作用后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示槲皮素通過下調(diào)Bax蛋白與上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞保護(hù)作用。

凋亡信號從最初產(chǎn)生到細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及DNA片段化的產(chǎn)生需經(jīng)歷一定時間，而線粒體跨膜電位丟失是凋亡程序中一個極早期的事件。Bcl-2蛋白家族作用于線粒體滲透性轉(zhuǎn)換(permeability transitionpore,PT)孔，通過改變線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)PD細(xì)胞凋亡。線粒體PT孔和線粒體內(nèi)致凋亡的多種蛋白釋放均受Bcl-2家族調(diào)控。因此，我們應(yīng)用線粒體親脂性陽離子染料JC-1觀察藥物作用24 h后，PC12細(xì)胞胞內(nèi)線粒體膜電位的改變。結(jié)果提示，槲皮素可一定程度上逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素對PD具有保護(hù)作用，我們推測槲皮素可能通過與Bcl-2家族蛋白的作用，上調(diào)Bcl-2蛋白與下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)來維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮細(xì)胞凋亡主開關(guān)的作用。因此，若能進(jìn)一步明確槲皮素對PD保護(hù)作用的機(jī)制，將有助于指導(dǎo)新型抗PD藥物的開發(fā)。

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InhibitoryeffectofquercetinonapoptosisofPC12cellsinducedbyrotenone

BI Wei1, ZHU Li-hong2, WANG Chuan-ming1, LIANG Yan-ran1, TAO En-xiang1

(1DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:taoenxiang@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effects and mechanisms of quercetin on the apoptosis of PC12 cells induced by rotenone.METHODSPC12 cells were used in the study. Quercetin at the concentration of 300 μmol/L was added into the PC12 cells cultured in DMEM-F12 medium with 10% fetal calf serum. The morphological changes of the cells were observed under fluorescence microscope. The apoptotic rate was determined by flow cytometry assay. The protein levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blotting, and the mitochondrial membrane potential was measured by ratiometric probe JC-1.RESULTSIn the cells treated with rotenone+quercetin, the morphology of the cells was significantly improved, and the apoptotic rate was decreased to 6.7%, significantly lower than that in the cells treated with rotenone alone (P<0.01). The expression of Bcl-2 was up-regulated and Bax was down-regulated in rotenone+quercetin group (P<0.01), while the mitochondrial membrane potential was also increased (P<0.01) as compared to those in rotenone group.CONCLUSIONPretreatment of quercetin inhibits the development of apoptosis in PC12 cells induced by rotenone. One of the mechanisms may be correlated with up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax, thus maintaining mitochondrial membrane potential.

Quercetin; Rotenone; Apoptosis; PC12 cells; Parkinson disease

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.016

1000-4718(2011)01-0082-04

2010-07-22

2010-10-19

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2005B33801003)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.20070558257)

△ 通訊作者Tel:020-81332095; E-mail: taoenxiang@yahoo.com.cn

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