后處理對缺血再灌注損傷大鼠肺Egr-1和IL-1β表達的影響*

伍火志， 袁 江， 王理想， 劉 鑫， 黃清華

(遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院心胸外科，廣東 珠海 519100)

后處理對缺血再灌注損傷大鼠肺Egr-1和IL-1β表達的影響*

伍火志△， 袁 江， 王理想， 劉 鑫， 黃清華

(遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院心胸外科，廣東 珠海 519100)

目的研究后處理對在體缺血再灌注損傷大鼠肺早期生長反應(yīng)因子1(Egr-1)和白細胞介素1β(IL-1β)表達的影響，并分析其可能的肺保護作用機制。方法建立大鼠在體肺臟缺血再灌注損傷模型，將SD大鼠24只隨機分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組和缺血后處理(IPostC)組,每組8只。在體鼠I/R損傷模型制備完成后，阻斷左肺門，終止血供及通氣，造成左肺缺血，達預(yù)定時間后松開阻斷帶恢復(fù)血供及通氣形成再灌注損傷。sham組只游離左側(cè)肺門、套阻斷帶但不阻斷，等待3 h后直接取標本；I/R組缺血1 h后再灌注2 h；IPostC組缺血1 h后給予重復(fù)3次的5 min灌注和5 min缺血的后處理，繼以恢復(fù)血供行再灌注1.5 h。3組實驗結(jié)束后均留取左側(cè)肺組織，制成10%的組織勻漿，用于測定髓過氧化物酶(MPO)的含量；留取小塊肺組織測定肺濕/干重比(W/D)，并在光鏡下觀察肺組織的病理變化；RT-PCR法檢測Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的表達量。結(jié)果3組間各項檢測指標比較，差異均顯著(P<0.05)。與sham組比較，I/R組肺組織中Egr-1 mRNA、IL-1β mRNA的表達量、MPO的活性及W/D值均明顯升高(P<0.05)；肺組織炎癥反應(yīng)明顯加重。IPostC組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的表達量、MPO的活性及W/D值與I/R組相比均明顯下降(P<0.05)；肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。結(jié)論后處理能夠明顯減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制Egr-1和IL-1β的表達有關(guān)。

肺缺血； 再灌注損傷； 后處理； 早期生長反應(yīng)因子1； 白細胞介素1β

肺移植、肺栓塞血管再通、體外循環(huán)以及需暫時阻斷一側(cè)肺動脈同期行血管成形術(shù)的中央型肺癌手術(shù)等過程中均可發(fā)生肺缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI),導致術(shù)后肺功能障礙。從基因水平研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注肺組織中早期生長反應(yīng)因子1(early growth response factor 1,Egr-1)的高表達，通過其下游基因白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)表達的參與，引起肺組織炎癥損傷，是導致肺缺血再灌注損傷的發(fā)生機制之一[1]。近年來，在對缺血再灌注損傷的組織和臟器保護措施的研究中，引入了缺血后處理的概念，即在再灌注開始時，進行重復(fù)多次的短暫灌注和缺血處理，從而起到器官保護作用[2-4]。我們已經(jīng)對離體缺血再灌注鼠肺進行后處理的研究表明，后處理可以降低缺血再灌注肺中IL-6、IL-8等細胞因子的表達，減輕中性粒細胞炎癥反應(yīng)，從而減輕肺缺血再灌注損傷[5]。本實驗旨在通過建立在體肺缺血再灌注損傷模型，研究后處理對在體鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用，通過分析其對缺血再灌注肺組織中Egr-1和IL-1β表達的影響，從基因水平進一步探討其可能的肺保護機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康SD大鼠24只，雌雄不限，體重280-320 g，隨機分為假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)和缺血后處理組(IPostC組)每組8只。

1.2試劑 MPO試劑盒(南京建成生物有限公司)；PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen)；FI/Rst Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)；Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；引物合成(Invitrogen)。

2方法

取大鼠稱重，以5%異戊巴比妥鈉(0.3 g/kg BW)行大鼠腹腔麻醉，麻醉成功后，氣管插管，接小動物呼吸機(上海奧爾科特生物有限公司)，通氣頻率90次/min，潮氣量2-3 mL/次，吸呼比1∶2，吸入空氣進行輔助呼吸。右側(cè)臥位，消毒左胸部皮膚，沿左胸骨切斷第3-5肋軟骨，打開胸腔，游離左肺門并穿過止血帶，靜脈注射肝素(1 mg/kg)抗凝。Sham組只游離肺門不阻斷，等待3 h直接取標本；I/R組和IPostC組均阻斷肺門，終止血供及通氣造成左肺缺血，1 h后松開阻斷帶恢復(fù)血供及通氣形成再灌注。IPostC組缺血1 h后給予重復(fù)3次的5 min灌注和5 min缺血的后處理，繼以恢復(fù)血供行再灌注1.5 h。

3肺濕/干重比(W/D)的計算

再灌注2 h后鉗夾切取左側(cè)肺組織稱得的重量為濕重,隨即將該肺組織放入干燥箱內(nèi)以80 ℃的溫度鼓風干燥12 h后稱取的重量為干重,兩者之間的比值為肺濕/干重比。

4髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的檢測

實驗結(jié)束后留取小塊肺組織(約100 mg)，-40 ℃低溫保存，實驗完成后統(tǒng)一制成組織勻漿，比色法檢測MPO的含量。

5光鏡觀察

切取小塊左肺上半部分用多聚甲醛固定做病理檢查。

6RT-PCR法檢測EGR-1mRNA及IL-1βmRNA表達水平

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也有局限性。如存在一定的脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性取決于sgRNA上的識別序列。為了避免脫靶效應(yīng)，有必要將Cas9引導至其基因組中精確靶標的sgRNA。為了確保Cas9的靶向活性和正常功能，使用Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)和Cas9表征的研究已經(jīng)證明需要與靶基因序列完美匹配[26-28]。有學者研發(fā)了很多軟件輔助CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速篩選特定基因序列靶點，有針對性地避開可能脫靶的位點，從而降低甚至消除脫靶現(xiàn)象[29]。

6.1RNA提取及RT-PCR反應(yīng) 稱取凍存肺組織100 mg，以Trizol法勻漿提取總 RNA，紫外分光光度法測定其濃度與含量。取1μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

6.2PCR 以β-actin為內(nèi)參照，采用50 μL體系進行擴增。EGR-1:上游引物 5′-AAAGTTTGCCAGGAGTGAT-3′,下游引物5′-GCAGGAGACGGGTAGGTA-3′，擴增產(chǎn)物 225 bp。IL-1β:上游引物 5′-CCTCTGTGACTCGTGGGA-3′,下游引物 5′-CTTCTTTGGGTATTGTTTGG-3′，擴增產(chǎn)物322 bp。β-actin：上游引物 5′-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3′,下游引物 5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′，擴增產(chǎn)物 571 bp。 PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；擴增31個循環(huán)(內(nèi)參照35個循環(huán))[95 ℃ 30 s，57 ℃(退火溫度)30 s，72 ℃ 30 s]，最后72 ℃延伸10 min。

6.3產(chǎn)物分析 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。結(jié)果用各樣品的條帶灰度值與β-actin的條帶灰度值之比表示。

7統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1Egr-1mRNA及IL-1βmRNA的表達

應(yīng)用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，I/R組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的相對表達量明顯高于sham組，而IPostC組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的相對表達量明顯低于I/R組，3組間比較差異均顯著(P<0.05)，見表1及圖1、2。

表1各組Egr-1mRNA及IL-1βmRNA相對表達量

GroupEgr-1mRNArelativeexpressionIL-1βmRNArelativeexpressionSham0.2975±0.02890.2308±0.0083I/R0.6147±0.0152#0.5500±0.0281#IPostC0.4680±0.0166*0.3661±0.0080*

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsI/R group.

Figure 1. Egr-1 mRNA expression detected by RT-PCR.

圖1RT-PCR檢測各組Egr-1mRNA的表達

Figure 2. IL-1β mRNA expression detected by RT-PCR.

圖2RT-PCR檢測各組IL-1βmRNA的表達

I/R組肺組織W/D及MPO活性明顯高于sham組，而IpostC組肺組織W/D及MPO活性則明顯低于I/R組，3組間比較差異顯著(P<0.05)，見表2。

表2各組MPO活性和W/D的比較

GroupMPOactivityLungwet/dryratio(W/D)Sham1.1847±0.26364.4935±0.4171I/R2.2732±0.5593#6.6513±0.3820#IPostC1.6317±0.2015*5.5151±0.2693*

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsI/R group.

3肺組織病理觀察

Sham組肺組織無明顯炎癥反應(yīng)。I/R組均出現(xiàn)不同程度的肺泡水腫，毛細血管破裂出血，肺間質(zhì)增寬并有水腫,炎癥細胞浸潤,肺泡內(nèi)有較多血液成分滲出,損傷明顯。IPostC組肺間質(zhì)輕度水腫,少量炎癥細胞浸潤,肺泡較完整,見圖3。

Figure 3. Lung tissue sections were stained with HE for morphological evaluation(×200). A:sham group; B: I/R group; C: IPostC group.

圖3肺組織HE染色顯示假手術(shù)組、缺血再灌注組和后處理組的病理組織學變化

討 論

Egr-1是首先在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，控制多個下游基因的表達，涉及白細胞的募集與黏附、血液凝固及纖維化[6]。 當機體受到機械損傷、躲避性應(yīng)激、細胞因子及缺氧等細胞外刺激后，受刺激的組織和細胞就會表達Egr-1。在鼠肺缺血再灌注損傷中，Egr-1 mRNA表達明顯升高，并局限于肺巨噬細胞和平滑肌細胞中，而且與野生型小鼠相比，Egr-1基因剔除小鼠體內(nèi)的炎癥介質(zhì)的水平、纖維蛋白的量及白細胞聚集明顯減少，生存期明顯延長[7]。陳乾坤等[1]研究證實，在肺缺血再灌注損傷中，通過IL-1β的參與，Egr-1發(fā)揮重要的炎癥損傷作用，缺血再灌注可以誘導肺組織中Egr-1的表達在短時間內(nèi)迅速升高，而且其表達量隨著再灌注時間的延長而顯著增高。本實驗中I/R組Egr-1 mRNA表達量明顯高于假手術(shù)組，與以上研究結(jié)果相符，表明再灌注肺組織中Egr-1表達的升高是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的原因之一。

利用大鼠肺缺血再灌注損傷模型，CO能抑制肺組織Egr-1的表達從而減輕白細胞淤滯和纖維素沉積，促進氣體交換而延長大鼠生存期[8]。應(yīng)用嗎替麥考酚酯可減少Egr-1的表達而減輕肺血管通透性、減少髓過氧化物酶含量及肺泡中白細胞計數(shù)[9]。說明采取一定的干預(yù)措施可以抑制肺組織中Egr-1的表達。

在后處理減輕肺損傷機制的研究中，王繼武等[10]報道，給予在體大鼠重復(fù)5次的1 min灌注+1 min缺血的后處理，發(fā)現(xiàn)缺血后處理組的肺組織中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛含量較對照組明顯下降，而抗自由基酶超氧化物歧化酶活性明顯增加。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，后處理可以降低缺血再灌注肺中IL-6、IL-8等細胞因子的表達，減小中性粒細胞炎癥反應(yīng)，從而減輕肺缺血再灌注損傷[5]。魯建軍等[11]利用犬肺移植模型研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可以減輕供體肺的缺血再灌注損傷，改善供體肺功能。本實驗中IPostC組Egr-1 mRNA的表達量明顯低于I/R組，提示缺血后處理可以抑制缺血再灌注肺組織中Egr-1的表達，這可能是缺血后處理發(fā)揮肺保護作用的機制之一。

本實驗同時對Egr-1的下游基因IL-1β的表達的變化進行了研究。前炎癥因子IL-1β主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，它的釋放是缺血再灌注損傷的機制之一[12]。結(jié)果表明，I/R組肺組織中IL-1β mRNA的表達量明顯高于假手術(shù)組，而IPostC組肺組織中IL-1β mRNA的表達量則明顯低于I/R組，此結(jié)果與其上游基因Egr-1表達量的改變相一致，提示缺血后處理可以抑制缺血再灌注肺中IL-1β mRNA的表達，并且此作用可能與后處理抑制了IL-1β的上游基因Egr-1的表達密切相關(guān)。

中性粒細胞的活化及其所介導的炎癥損傷作用是肺缺血再灌注損傷的機制之一[13]。W/D反映肺組織的水腫程度，可直接評價組織炎癥損傷程度。本實驗對各組肺組織W/D及MPO活性進行測量，結(jié)果表明，I/R組肺組織W/D及MPO活性明顯高于假手術(shù)組，病理切片顯示炎癥反應(yīng)明顯加重。而IPostC組肺組織W/D及MPO活性均明顯低于I/R組，病理學觀察發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)明顯減輕。肺組織Egr-1 mRNA的表達量與MPO的活性均呈正相關(guān)，提示后處理所引起肺組織炎癥反應(yīng)的改變與其抑制了Egr-1的表達密切相關(guān)。

綜上所述，缺血后處理能夠明顯減輕鼠肺缺血再灌注損傷，其機制可能與后處理抑制再灌注損傷鼠肺Egr-1及其下游基因IL-1β的表達有關(guān)。

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Effectofischemicpost-conditioningonEgr-1andIL-1βexpressioninischemia-reperfusioninjuredlunginrats

WU Huo-zhi, YUAN Jiang, WANG Li-xiang, LIU Xin, HUANG Qing-hua

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheFifthAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519100,China.E-mail:gary_wu5445@163.com)

AIM: To investigate the protective effects of ischemic post-conditioning on the expression of early growth response factor 1 (Egr-1) and interleukin-1β(IL-1β) in ischemia-reperfusion injured lung in rats.METHODSThe model of lung ischemia-reperfusion injury was established in 24 rats and the rats were randomly allocated to 3 different groups (n=8 in each group): (1) sham group: only sham operation (thoracotomy) and no ischemia for 3 h; (2)ischemia-reperfusion group (I/R group): interruption of pulmonary perfusion and ventilation for 1 h followed by reperfusion for 2 h; (3) ischemic post-conditioning group (IPostC group): ischemic post-conditioning (5 min of reperfusion and 5 min of ischemia for 3 times) between the end of ischemia and the beginning of the reperfusion followed by reperfusion for 1.5 h. The lung tissues (prepared to small pieces of about 20 mg) were collected and homogenized at the end of the experiment. The concentration of myeloperoxidase (MPO) in the homogenate was determined. The wet to dry weight ratio (W/D) of the lung tissues was also measured at the end of reperfusion. The pathological changes of the lung tissues were observed under light microscope after reperfusion. The mRNA expression of Egr-1 and IL-1β in the lung tissues was detected by RT-PCR.RESULTSCompared with sham group, the mRNA expression of Egr-1 and IL-1β, the levels of MPO and W/D were significantly increased in I/R group (P<0.05). The inflammatory responses of the lungs in I/R group were significantly severer than those in sham group. Compared with I/R group, the mRNA expression of Egr-1 and IL-1β, the levels of MPO and W/D in IPostC group were significantly decreased (P<0.05). The inflammatory responses of the lungs in IPostC group were also significantly attenuated.CONCLUSIONIschemic post-conditioning significantly reduces ischemic reperfusion injury of the lung by inhibiting the expression of Egr-1 and IL-1β.

Lung ischemia; Reperfusion injury; Post-conditioning; Early growth response factor-1; Interleukin-1β

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.006

1000-4718(2011)01-0033-04

2010-07-16

2010-09-21

貴州省科學技術(shù)基金資助項目(黔科合J字No.20092313)

△通訊作者 Tel：0756-5523329；E-mail:gary_wu5445@163.com