大鼠肺動脈平滑肌細胞Rho激酶對p-Smad1核遷移的作用及機制*

李春香， 李福海， 夏 偉△， 時 慶， 汪大琨

(山東大學齊魯醫(yī)院1兒科，2低溫醫(yī)學研究室，山東 濟南250012)

大鼠肺動脈平滑肌細胞Rho激酶對p-Smad1核遷移的作用及機制*

李春香1， 李福海1， 夏 偉1△， 時 慶2， 汪大琨2

(山東大學齊魯醫(yī)院1兒科，2低溫醫(yī)學研究室，山東 濟南250012)

目的研究Rho激酶對p-Smad1核遷移的作用及信號轉導途徑，探討它們在肺血管重構中的作用機制。方法分離培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞，應用血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)啟動肺動脈平滑肌細胞Rho激酶信號通路，應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)啟動BMP信號通路，并用Rho激酶抑制劑Y-27632、MEK抑制劑U0126進行干預。培養(yǎng)細胞分成5組：(1)對照組；(2)BMP-2組；(3)BMP-2+PDGF-BB組；(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組；(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126組。免疫熒光染色標記p-Smad1在細胞核內外的分布并計算p-Smad1核遷移陽性細胞百分數(即核遷移率)。分離平滑肌細胞核蛋白和胞漿蛋白，Western blotting分析p-Smad1在細胞內的總量和細胞核內外相對含量的變化。Kit-WST-8試劑盒檢測細胞增殖。結果BMP-2組p-Smad1在細胞內的總量、在細胞核中的相對含量和核遷移率明顯高于對照組(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB 組p-Smad1的核遷移率和在細胞核中的相對含量明顯低于BMP-2組(P<0.05)，但是細胞內p-Smad1總量無明顯改變(P>0.05)；BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組細胞內p-Smad1的總量、在細胞核中的相對含量和核遷移率與BMP-2組基本相似(P>0.05)。BMP-2組的A值明顯小于對照組(P<0.05)；PDGF-BB+BMP-2組的A值明顯大于BMP-2組(P<0.05)且大于對照組(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組的A值均小于PDGF-BB+BMP-2組(P<0.05)。結論在大鼠肺動脈平滑肌細胞，PDGF-BB激活的Rho激酶通過MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核遷移，促進平滑肌細胞增殖。

肺動脈; 平滑肌細胞；Rho激酶；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質2；p-Smad1核遷移

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH) 的發(fā)生，先是肺微小動脈平滑肌細胞增生及表型的轉變，導致血管壁增厚、內徑狹小、張力增高[1]，而后不但引起肺血管收縮性改變，而且導致肺小動脈結構重構。文獻資料表明Rho激酶信號通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信號通路在PAH肺血管結構重構過程中發(fā)揮了相反的調節(jié)作用。促有絲分裂因子(PDGF、5-羥色胺、血管緊張素Ⅱ等)通過激活RhoA/Rho激酶/MEK/ERK1/2信號通路促進肺血管中膜平滑肌細胞的增生和肥大[2,3]，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor2,BMPR 2)基因突變和表達降低是原發(fā)性PAH和各種繼發(fā)性PAH的重要發(fā)生機制[4-6]。MAPK (MEK/ERK1/2)可以磷酸化BMP下游信號分子p-Smads(1 /5 /8)的中間鏈接區(qū)，抑制其向細胞核內的遷移，從而抑制BMP信號通路的轉導[7]。本研究假定這2條通路之間存在相互作用，通過體外培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞，分別應用BMP-2和血小板源性生長因子BB(platelet-derived growth factorBB,PDGF-BB)啟動BMP信號通路和激活Rho激酶，并用Rho激酶抑制劑Y-27632和MEK抑制劑U0126進行干預，免疫熒光染色觀察p-Smad1在細胞核內外的分布；提取分離胞漿和胞核蛋白，Western blotting檢測p-Smad1在細胞內的總量和細胞核內外的分布；旨在揭示Rho激酶對p-Smads核遷移的作用及機制，探討它們在PAH肺血管重構中的作用機制。

材 料 和 方 法

1大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)

Wistar大鼠(約180 g)，開胸取心肺，用顯微剪及顯微鑷在放大鏡下循肺動脈主干逐級追入肺實質，取肺動脈2級及以下分支，冷PBS液中剝除外膜纖維脂肪層，縱向剪開血管，內面朝上彎頭小鑷子自上而下刮除內膜，留中膜平滑肌層。分次酶消化法收集細胞(0.25%胰酶)。加入含10%FBS-LDMEM(Gibco)的培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)，3-5 d后換培養(yǎng)基。采用平滑肌α-actin單克隆抗體(Santa Cruz)對培養(yǎng)的細胞進行鑒定[8]。

2免疫熒光標記p-Smad1在細胞核內外的分布

2.1分離培養(yǎng)原代大鼠肺動脈平滑肌細胞 傳代培養(yǎng)至3-5代時備用。

2.2肺動脈平滑肌細胞Rho激酶信號轉導通路和BMP信號轉導通路的干預 肺動脈平滑肌細胞種植到48孔細胞培養(yǎng)板，10%FBS-LDMEM中培養(yǎng)至70%-80%融合，然后在含1% FBS基質中靜止24 h，使細胞生長周期同步到G0期，肺動脈平滑肌細胞分為5組，在再次加入10%FBS-LDMEM啟動細胞生長的同時，不同分組細胞分別加入相應試劑孵育：(1)對照組：加入10%FBS-LDMEM孵育;(2)BMP-2組：在10%FBS-LDMEM孵育30 min后，再加入2 μg/L BMP-2 (Peprotech);(3)BMP-2+PDGF-BB組： 在10%FBS-LDMEM中孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2;(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組：在10%FBS-DMEM中孵育的同時加入10 μmol/L Y-27632孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2;(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126組： 在10%FBS-DMEM中孵育的同時加入10 μmol/L U0126孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2。每組的不同干預點均設3個復孔。

2.3肺動脈平滑肌細胞p-Smad1細胞核內外分布量檢測 加入上述試劑后，在10%FBS-DMEM 中繼續(xù)孵育5 min至24 h，每隔5-60 min收取細胞做免疫熒光染色p- Smad1(5-60 min內間隔5 min，1-6 h間隔20 min，6-12 h間隔40 min， 12-24 h間隔60 min)。染色方法為：多聚甲醛固定細胞，含0.1% Triton X-100 PBS緩沖液中透化處理，羊抗p-Smad1抗體(Santa Cruz)孵育、羅丹明標記兔抗山羊Ⅱ抗(中杉金橋公司)染色，倒置相差熒光顯微鏡觀察p-Smad1在細胞核內外的分布。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,Roche分裝)對細胞核進行對比染色。實驗先后重復了4次。每組在不同時點的3個復孔中隨機取10個視野拍照。將4次實驗的拍照結果進行匯總，每組隨機取10張免疫熒光照片(n=10)，觀察分析p-Smad1在細胞核內外的分布，計算p-Smad1核遷移陽性的細胞百分數，即核遷移率。同一細胞，p-Smad1在細胞核中濃聚，即在細胞核中分布明顯濃于細胞質，就視為p-Smad1核遷移陽性，見圖1。

Figure 1. The cell p-Smad 1 nuclear translocation (immunofluorescent staining,×200).

圖1p-Smad1核遷移陽性的細胞

3Westernblotting檢測p-Smad1在細胞核內外的分布

細胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至4-5代，在含1% FBS基質中靜止24 h，在再次加入10%FBS-LDMEM啟動細胞生長的同時進行分組并加入相應試劑孵育(同免疫熒光)。 在加入所有試劑孵育1h后，每組取至少2瓶細胞，分離核蛋白和細胞漿蛋白，操作參照核蛋白提取試劑盒(Bestbio)。Western blotting簡要步驟是：加蛋白提取物進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉到NC膜、封閉、滴加Ⅰ抗。所用Ⅰ抗為鼠抗β-actin(1∶1 000，中杉金橋公司)抗體和羊抗p-Smad1(1∶500，Santa Cruz)抗體。滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ⅱ抗孵育(1∶20 000，中杉金橋公司)及兔抗山羊Ⅱ抗孵育(1∶20 000，中杉金橋公司)。免疫反應條帶用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL,Millipore)，然后直接對印記膜進行熒光CCD掃描。用Quantity One軟件進行輝度分析。以β-actin作內參照，目的蛋白色條帶輝度與β-actin顯色條帶輝度比值代表目的蛋白相對表達量。5組實驗均重復4次。

4CellCountingKit(CCK)-WST-8試劑盒檢測細胞增殖

接種細胞懸液于96孔板中，100μL/well，在培養(yǎng)箱內穩(wěn)定過夜。第2 d對細胞進行分組并每隔2 h加入相應試劑孵育(分組情況及加試劑濃度同免疫熒光)，連續(xù)24 h。做細胞數目測定時每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A值)，測定的A值與增殖細胞數量呈線性關系。

5統(tǒng)計學處理

結 果

1細胞鑒定

大鼠肺動脈平滑肌細胞免疫熒光結果可見，細胞質α-actin均勻發(fā)紅色熒光、細胞核發(fā)藍色熒光，細胞純度平均達98%以上,見圖2。

Figure 2. Morphology and purity of rat pulmonary artery smooth muscle cells(immunofluorescent staining,×200).

圖2大鼠肺動脈平滑肌細胞的鑒定

2免疫熒光標記p-Smad1在細胞核內外的分布

免疫熒光染色顯示，對照組p-Smad1在大部分細胞漿中(95%以上)顯色很弱并分布均勻，而且隨著時間延長變化不大，30 min后在少數細胞核內有較弱的濃聚，核遷移率僅占10.00%±0.71%。BMP-2組，在5 min后p-Smad1在細胞核內的濃聚即開始，30 min到高峰期，最大核遷移率達到68.00%±1.05%，與對照組相比差異顯著(P<0.01)，且這種高峰期可持續(xù)2 h，濃聚現(xiàn)象雖逐漸衰退，但24 h后仍可存在，且p-Smad1在細胞核內濃聚的細胞數目24 h內始終大于20%。BMP-2+PDGF-BB組，5 min后p-Smad1在細胞核內的濃聚也開始，但與BMP-2組比較，沒有明顯高峰期出現(xiàn)，p-Smad1的最大核遷移率為29.40%±2.52%，與BMP-2 組相比差異顯著(P<0.01)，大部分細胞細胞質與細胞核中的p-Smad1分布均勻如對照組。BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組，在5min后p-Smad1在細胞核中的濃聚亦開始，30 min達到高峰期，p-Smad1的最大核遷移率分別為64.20%±1.43%和65.80%±1.83%，與BMP-2+PDGF-BB組相比差異顯著(P<0.05)，濃聚表現(xiàn)類似BMP-2組(P>0.05)，只是高峰期持續(xù)時間略短,見圖3-5。

Figure 3. Distribution of p-Smad1 in pulmonary artery smoth muscle cells 1 h after BMP-2 exposure(immunofluorescent staining,×200). A:control group;B: BMP-2 group;C:BMP-2+PDGF-BB group;D: BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632 group; E:BMP-2+ PDGF-BB+ U0126 group.

圖3免疫熒光標記p-Smad1在細胞核內外的分布

圖4免疫熒光標記p-Smad1核遷移陽性細胞百分數

圖5細胞核內p-Smad1核遷移隨時間變化趨勢

3Westernblotting結果

據免疫熒光的結果，選擇p- Smad1在細胞核中濃聚達到高峰期(BMP-2作用1 h)時進行Western blotting檢測。與對照組相比，BMP-2組p-Smad1在細胞漿的總量以及在細胞核的相對含量明顯增多(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB 組p-Smad1在細胞核的相對含量明顯低于BMP-2組(P<0.05)，細胞內p-Smad1總量有減少趨勢，但無顯著差異(P>0.05)；BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組p-Smad1的總量以及在細胞核中的相對含量與BMP-2組基本相似(P>0.05)，其細胞核內相對含量明顯高于BMP-2+PDGF-BB組(P<0.05)，見圖6、7。

4CCK-WST-8試劑盒檢測細胞增殖結果

加試劑作用12 h，BMP-2組A值(1.924±0.086)明顯小于對照組A值(2.032±0.176)(P<0.05)，說明BMP-2明顯抑制了細胞增殖；PDGF-BB+BMP-2組A值(2.456±0.045)顯著大于BMP-2組(P<0.05),且A值亦大于對照組(P<0.05)，說明PDGF-BB阻斷了BMP-2對細胞增殖的抑制作用而且促進了細胞的增殖；BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組A值(2.312±0.079)和BMP-2+PDGF-BB+U0126組A值(2.204±0.207)均小于PDGF-BB+BMP-2組(P<0.05)，說明Y-27632和U0126抑制了PDGF-BB的促細胞增殖作用,見圖8。

Figure 6. Western blotting analysis of p-Smad1 1 h after BMP-2 exposure. A: control group;B: BMP-2 group;C:BMP-2+PDGF-BB group;D:BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632 group; E:BMP-2+ PDGF-BB+ U0126 group.

圖6BMP-2作用1h細胞漿及細胞核內p-Smad1相對含量

圖7BMP-2作用1h細胞核中p-Smad1的相對表達量

圖8BMP-2作用12h各組細胞的增殖情況

討 論

綜合實驗結果，加入BMP-2后：免疫熒光顯示p-Smad1往細胞核中遷移明顯增多，Western blotting也顯示p-Smad1在細胞核中的含量較對照組明顯增多，而CCK-WST-8試劑盒檢測細胞增殖結果顯示BMP-2明顯抑制細胞的增殖；再加入PDGF-BB后p-Smad1往細胞核中遷移被明顯抑制，在細胞核中的含量也明顯減少，細胞增殖結果顯示細胞增殖明顯；再加入Y-27632和U0126后p-Smad1又恢復了往細胞核中遷移，p-Smad1在細胞核中的含量也顯著增加，細胞增殖結果顯示細胞增殖的趨勢被抑制。以上的結果充分說明，在大鼠肺動脈平滑肌細胞，PDGF-BB激活的Rho激酶通過MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核遷移來促進平滑肌細胞增殖。

BMPs屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族，能夠調節(jié)多種生物過程。在心血管生理方面，BMPs對血管平滑肌細胞主要發(fā)揮促進分化和凋亡、抑制增生作用，以維持血管結構的穩(wěn)定。Smads是BMP信號通路的細胞內信號轉導分子，BMPs與其受體結合后，磷酸化其下游信號轉導分子Smad1/5/8的受體活化區(qū)(C末端)，磷酸化的Smads(p-Smads)遷移到細胞核內，

調節(jié)基因轉錄。在該研究中，分離培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞，加入10%FBS-LDMEM啟動細胞生長的同時，加入BMP-2后，免疫熒光染色觀察到明顯的p-Smad1核遷移，在細胞核中濃聚的細胞達到70%，Western blotting的檢測結果亦表明細胞內總量和細胞核內p-Smad1顯著增多，提示BMP-2成功啟動了BMP信號通路的轉導。Kit-WST-8試劑盒檢測細胞增殖結果證實BMP-2確實抑制了細胞的增殖。

PDGF是一種作用很強的促有絲分裂因子，在各種原因所致的肺動脈高壓肺血管結構重構過程中，表達增強的PDGF對肺動脈中膜平滑肌細胞發(fā)揮了很強的促分裂、促增生作用[9，10]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB能夠有效抑制p-Smad1的核遷移，在加入PDGF-BB后，免疫熒光和Western blotting結果均顯示細胞核內p-Smad1明顯減少，而加入Y-27632抑制Rho激酶活性或U0126 (MEK抑制劑)抑制ERK1/2激活后，p-Smad1的核遷移得到很大程度的恢復，阻斷了PDGF-BB對BMP-2啟動的p-Smad1核遷移的抑制作用，表明PDGF-BB通過激活RhoA/Rho激酶/MEK/ERK1/2信號通路抑制了p-Smad1核遷移。在該研究中雖然PDGF-BB能夠有效抑制p-Smad1的核遷移，而細胞內的p-Smad1總量卻沒有減少，提示PDGF-BB并非通過干擾p-Smad1 C末端的磷酸化抑制其核遷移，應該是通過激活RhoA/Rho激酶MEK/ERK1/2信號通路磷酸化p-Smads的中間連接區(qū)，致p-Smads被Smurf1降解[11]，抑制p-Smads的核遷移， p-Smads被Smurf1降解量，相對于細胞核內的含量，發(fā)生顯著改變，而相對于細胞漿和細胞內總量，影響甚微，所以p-Smad1總量雖有減少趨勢，但無顯著差異。細胞增殖結果充分顯示PDGF-BB阻斷了BMP-2對細胞增殖的抑制作用，促進了細胞的增殖，而加入Y-27632抑制Rho激酶活性或U0126 (MEK抑制劑)抑制ERK1/2后，PDGF-BB的促進細胞增殖作用又被抑制。所以，PDGF-BB通過抑制p-Smad1的核遷移阻斷BMP信號通路對平滑肌細胞的穩(wěn)定作用進而促進了細胞的增殖，這有可能是RhoA/Rho激酶信號通路促進平滑肌細胞增殖的作用機制之一，見圖9。

Figure 9. The cross talk of Rho kinase signaling pathway and BMP signaling pathway. Rho kinase and BMP-2 cross talking at p-Smad1 by phosphorylating its link region and C-terminal, respectively.

圖9Rho激酶信號通路和BMP信號通路的相互作用，它們分別磷酸化p-Smad1連接區(qū)和羧基末端

[1] Barbera JA,Peinado VI,Santos S.Pulmonary hypertension in chronic obstructive puImonary disease[J].Eur Respir J,2003,21(5):892-905.

[2] Nossaman BD,Kadowitz PJ.The role of the RhoA/rho-kinase pathway in pulmonary hypertension[J].Curr Drug Discov Technol,2009，6(1):59-71.

[3] Chen XY,Dun JN,Miao QF,et al.Fasudil hydrochloride hydrate,a Rho-kinase inhibitor, suppresses 5-hydroxytryptamine-induced pulmonary artery smooth muscle cell proliferation via JNK and ERK1/2 pathway[J].Pharmacology,2009,83(2):67-79.

[4] Takahashi H,Goto N,Kojima Y,et al.Downregulation of type II bone morphogenetic protein receptor in hypoxic pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006，290(3):L450-L458.

[5] Ramos MF,Lamé MW,Segall HJ,et al.Smad signaling in the rat model of monocrotaline pulmonary hypertension[J].Toxicol Pathol,2008，36(2):311-320.

[6] Rondelet B,Kerbaul F,van Beneden R,et al.Signaling molecules in overcirculation-induced pulmonary hypertension in piglets:effects of sildenafil therapy[J]. Circulation,2004,110(15):2220-2225.

[7] Kretzschmar M,Doody J,Massagué J.Opposing BMP and EGF signalling pathways converge on the TGF-β family mediator Smad1[J].Nature, 1997,389(6651):618-622.

[8] 洪 城,王 健,李 冰,等.大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞分離與原代培養(yǎng)[J].中華生物醫(yī)學工程雜志,2007,13 (3):176-179.

[9] Szewczyk NJ,Peterson BK,Jacobson LA.Activation of Ras and the mito protein kinase pathway promotes protein degradation in muscle cells ofCaenorhabditiselegans[J].Mol Cell Biol,2002,22(12):4181-4188.

[10]Chang F,Steelman LS,McCubrey JA.Raf-induced cell cycle progression in human TF-1 hematopoietic cells[J].Cell Cycle,2002,1(3):220-226.

[11]Sieber C,Kopf J,Hiepen C,et al.Recent advances in BMP receptor signaling[J].Cytokine Growth Factor Rev,2009,20(5-6):343-355.

EffectsofRhokinaseonp-Smad1nucleartranslocationinratpulmonaryarterysmoothmusclecells

LI Chun-xiang1, LI Fu-hai1, XIA Wei1, SHI Qing2, WANG Da-kun2

(1DepartmentofPediatrics,2CryomedicineLaboratory,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:cicql@163.com)

AIM: To explore the mechanism of bone morphogenetic protein (BMP) and Rho kinase signal pathways on the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells.METHODSPulmonary smooth muscle cells were isolated from the rat distal pulmonary artery and cultured. BMP and Rho kinase pathways were activated by BMP-2 and platelet-derived growth factor BB(PDGF-BB)，respectively. Rho kinase inhibitor Y-27632 and MEK inhibitor U0126 were also used. Immunofluorescent staining was applied to observe p-Smad1 distribution across the nucleus, and the cells with positive p-Smad1 nuclear accumulation were counted and the nuclear translocation rate was calculated. The total p-Smad1 and its distribution across the nucleus were quantitatively determined by Western blotting. The cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay.RESULTSExposure to BMP-2 significantly increased both the total amount of p-Smad1 and its nuclear accumulation in pulmonary smooth muscle cells. Pretreatment with PDGF-BB significantly decreased the nuclear accumulation of p-Smad1 induced by BMP-2 without decrease of total p-Smad1. However, pretreatment with Y-27632 or U0126 reversed the inhibitory effect of PDGF-BB on p-Smad1 nuclear accumulation. BMP-2 significantly inhibited the cell proliferation, but PDGF-BB blocked the effect of BMP-2 and significantly increased the cell proliferation. After pretreated with Y-27632 or U0126, the PDGF-BB-activated cell proliferation was suppressed.CONCLUSIONPDGF-BB-activated Rho kinase inhibits BMP-2-induced p-Smad1 nuclear translocation via MEK/ERK1/2, and increases pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.

Pulmonary artery; Smooth muscle cells; Rho kinase; Bone morphogenetic protein-2; p-Smad1 nuclear translocation

R363

A

1000-4718(2011)03-0443-07

2010-09-26

2011-01-12

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金資助項目(No.2008BS03017)

△通訊作者 Tel:0531-82169940;E-mail:cicql@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.005