15味中草藥對5種臨床分離菌株的體外抑菌效果觀察

李成葉，王德海*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，動物疫病的發(fā)生與流行越來越復(fù)雜，并具有混合感染和繼發(fā)感染的新特點，在疾病的治療方面，抗生素以其方便、高效的優(yōu)勢在臨床應(yīng)用中占據(jù)主導(dǎo)地位，但由于抗生素類藥物的廣泛使用，使得病原菌的抗藥性日趨增強，而由于抗生素濫用而導(dǎo)致的抗生素殘留問題也引用了全社會的關(guān)注[1]。本試驗采用的5種細菌中，金黃色葡萄球菌是對人類危險性最大的化膿性球菌[2],在醫(yī)院檢測的所有樣本中檢出率達到55.1%，是醫(yī)院內(nèi)交叉感染的重要傳染源[3],近年來由于廣泛應(yīng)用抗生素，耐藥菌株迅速增多，對青霉素-G、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、苯唑西林等常用抗菌藥物耐藥率均達60%以上[4]；鏈球菌血清型較多，也已出現(xiàn)了較多種的耐藥菌株；而大腸桿菌又屬于多血清型和變異性強的細菌，極易產(chǎn)生抗藥性[5]。因此，既能有效控制疾病的發(fā)生，又能降低細菌的耐藥性，進而降低抗生素的濫用就成為當(dāng)前藥物研究的一個方向。

中草藥作為一種無污染、綠色、天然的藥物，具有多能性、性質(zhì)穩(wěn)定、資源廣泛、價格低廉的特點，且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小，已經(jīng)證實多種中草藥有抑菌或抗菌作用[6],其作為替代抗生素解決抗藥性和藥物殘留等方面的優(yōu)勢越來越受到重視。利用中草藥防治動物疾病，既是飼養(yǎng)動物的需要，也是人們生活保健的需求。

本實驗以梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹15味中草藥對臨床分離的5株細菌（金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、鏈球菌、雞大腸桿菌、仔豬大腸桿菌）的體外抑菌效果進行觀察，從而為臨床應(yīng)用和科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金黃色葡萄球菌菌株分離自患葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎雞的關(guān)節(jié)部位；白葡萄球菌分離自患葡萄球菌病鴨的肝臟部位；雞大腸桿菌分離自患大腸桿菌病雞的肝臟部位；鏈球菌分離自患鏈球菌性關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)部位；仔豬大腸桿菌分離自患大腸桿菌病仔豬的十二指腸部位。

以上菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院病理教研室分離、鑒定、保存，臨用前分別供試菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h，用生理鹽水將菌苔洗下，稀釋至濃度為1.2×1010CFU/ml的菌懸液，備用。

1.2 試劑及藥品

1.2.1 供試中草藥

梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹均購于武漢市天然藥物醫(yī)療研究院。

臨用前將各種中草藥分別稱取10g，放入三角燒瓶中，加入100ml以上自來水使淹沒過藥面5cm左右，浸泡30min后加熱煮沸30min，濾紙過濾取藥液，藥渣按以上方法再次操作，合并兩次藥液，加熱煮沸濃縮至10ml。即得每毫升含1g生藥的藥液。經(jīng)115℃高壓滅菌30分鐘并補充水分后備用.

（1984年1月6日講座，全文略有刪節(jié)。吳培華教授提供講座錄音，史悠整理，劉祥安教授審閱，在此特申謝忱！）

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將15ml、pH7.4的滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，觀察無菌生長后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗設(shè)計

按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）的要求進行試驗設(shè)計，并進行適當(dāng)改進。吸取20μl制備的菌懸液加入制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面，均勻涂布，于室溫下干燥3～5min后，用外徑6mm的硬塑料管將涂布有菌懸液的基礎(chǔ)培養(yǎng)平板等間隔對稱地打4個孔，挑出孔中培養(yǎng)基，并在酒精燈火焰上對培養(yǎng)平板封底，將各種供試中草藥用蒸餾水稀釋成 1.00g/ml、0.75g/ml、0.50g/ml、0.25g/ml、0.10g/ml、0.05g/ml等 6 個濃度，吸取藥液50μl加入孔中，每種中草藥每個濃度設(shè)4個重復(fù)，然后將培養(yǎng)平板放入37℃溫箱培養(yǎng)18h用游標(biāo)卡測量抑菌圈直徑，同種中草藥同一濃度取其抑菌圈直徑的平均值，此即各種中草藥在不同濃度下對供試菌株的抑菌效果。

1.4 抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)

參考NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)進行判斷，以抑菌圈直徑＞20mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～15mm之間為中敏，抑菌圈直徑＜10mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試中草藥對臨床分離金葡菌的抑菌效果

表1 15種中草藥在不同濃度下對雞關(guān)節(jié)源性金葡菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表2 15種中草藥在不同濃度下對鴨肝臟源性白葡菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表3 15種中草藥在不同濃度下對豬關(guān)節(jié)源性鏈球菌體外抑菌效果（n=4，單位mm）

表4 15種中草藥不同濃度下對雞肝臟源性大腸桿菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

由表2可知，對供試菌株白葡萄球菌來說，在1.00g/ml濃度時除梔子外其它中草藥都表現(xiàn)為極敏。其中對0.10g/ml濃度以上的黃芩和金銀花，0.50g/ml濃度以上的艾葉、百部、貫眾、大青葉、紫草和敗醬草，0.75g/ml濃度的黃連、夏枯草和連翹也表現(xiàn)為極敏。而對0.05g/ml濃度以上的貫眾、大青葉、紫草、黃芩和金銀花，0.10g/ml濃度以上的百部、魚腥草、夏枯草和敗醬草，0.25g/ml濃度以上的艾葉、黃連和連翹，蒲公英和黃柏分別在0.5g/ml、0.75g/ml濃度以上時都表現(xiàn)為高敏。對1.00g/ml的梔子表現(xiàn)為中敏，同樣表現(xiàn)為中敏的還有0.05g/ml時的百部、魚腥草、夏枯草、敗醬草和連翹，0.10g/ml濃度時的黃連、蒲公英和連翹，0.25g/ml濃度的蒲公英和黃柏以及0.50g/ml濃度的黃柏。供試菌株對0.75g/ml和0.5g/ml濃度的梔子，0.1g/ml濃度的艾葉，0.05g/ml濃度的黃連和蒲公英均表現(xiàn)為低敏。而白葡萄球菌對0.25g/ml濃度以下的梔子，0.01g/ml濃度的黃柏，以及0.05g/ml濃度的艾葉均表現(xiàn)為耐藥。

由表3可知：供試菌株對1.00g/ml濃度的魚腥草、大青草、黃柏、紫草和連翹，以及0.50g/ml濃度以上的百部和金銀花均表現(xiàn)為極敏。而對1.00g/ml濃度的艾葉、貫眾、蒲公英、黃芩和敗醬草，0.75g/ml濃度的黃柏，0.50g/ml濃度以上的大青葉，0.25g/ml濃度以上的百部、紫草和連翹，以及0.10g/ml濃度以上的魚腥草和金銀花均表現(xiàn)為高敏。供試菌株表現(xiàn)為中敏的藥物有0.75g/ml濃度以上的梔子和艾葉，0.50g/ml濃度以上的黃連、蒲公英和敗醬草，0.25g/ml濃度的大青葉和黃柏，0.05g/ml濃度以上的貫眾、魚腥草、紫草、金銀花和連翹。而對0.50g/ml濃度的梔子和艾葉，0.25g/ml濃度以上蒲公英和敗醬草，0.10g/ml濃度的百部和大青葉，0.05g/ml濃度的大青葉均表現(xiàn)為低敏。而鏈球菌表現(xiàn)為耐藥的中草藥有夏枯草，0.75g/ml濃度以下的黃芩，0.25g/ml濃度以下的梔子、艾葉和黃連，0.10g/ml濃度以下的蒲公英、黃柏和敗醬草。

由表4可知：供試菌株只對1.00g/ml濃度時的敗醬草和連翹，0.75g/ml濃度以上的大青葉和黃芩表現(xiàn)為極敏。而對1.00g/ml濃度時的梔子、艾葉、百部、蒲公英和黃柏，0.50g/ml濃度以上的大青葉和紫草，0.25g/ml濃度以上的連翹，0.10g/ml濃度時的黃芩表現(xiàn)為高敏。而對1.00g/ml濃度時夏枯草，0.75g/ml濃度以上的梔子、百部和黃連，0.5g/ml濃度的艾葉，0.25g/ml濃度的大青葉，0.1g/ml濃度以上的蒲公英、紫草和敗醬草，以及0.05g/ml濃度以上的黃芩和連翹，均表現(xiàn)為中敏。而對0.25g/ml濃度時艾葉，0.10g/ml濃度的大青葉和0.05g/ml濃度的蒲公英、紫草和敗醬草均表現(xiàn)為低敏。而供試菌株對貫眾、魚腥草和金銀花表現(xiàn)為完全耐藥，其次對0.75g/ml濃度以下的夏枯草，0.5g/ml濃度以下的梔子、百部、黃連和黃柏，以及0.10g/ml濃度以下的艾葉和0.05g/ml濃度的大青葉也表現(xiàn)為耐藥。

表5 15種中草藥在不同濃度下對仔豬十二指腸源性大腸桿菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表5可知：供試菌株只對1.00g/ml濃度時的大青葉、連翹、金銀花以及0.50g/ml濃度以上的敗醬草表現(xiàn)為極敏。對1.00g/ml濃度時的艾葉和蒲公英，對0.75g/ml濃度以上的梔子、大青葉和紫草，0.5g/ml濃度以上的金銀花、黃芩，以及0.25g/ml濃度的敗醬草，0.10g/ml濃度以上的連翹均表現(xiàn)為高敏。供試菌株表現(xiàn)為中敏的藥物有1.00g/ml濃度的貫眾和黃柏，0.75g/ml濃度以上的百部、黃連和夏枯草，0.5g/ml濃度的梔子和大青葉，0.25g/ml濃度以上的蒲公英，0.1g/ml濃度以上的黃芩，和0.05g/ml濃度以上的紫草、連翹、敗醬草和金銀花。表現(xiàn)為低敏的藥物有0.75g/ml濃度的艾葉，0.5g/ml濃度的黃連，0.25g/ml濃度的大青葉和0.10g/ml濃度以下的蒲公英。而供試菌株表現(xiàn)為耐藥的中草藥有魚腥草，0.75g/ml濃度以下的貫眾和黃柏，0.5g/ml濃度以下的艾葉、夏枯草和百部，0.25g/ml濃度以下的梔子和黃連，0.10g/ml濃度以下的大青葉和0.05g/ml濃度的黃芩。

3 討論與結(jié)論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素鏈球菌（PRP）目前已成為一些大型綜合醫(yī)院常見的院內(nèi)感染菌，常表現(xiàn)為多重耐藥性[7]；而大腸桿菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床常見的病原菌之一，由于該菌一直依靠抗生素進行控制，使得耐藥性也越來越嚴重。由于耐藥菌株感染而造成疾病蔓延使得畜禽養(yǎng)殖業(yè)損失慘重，同時抗生素的殘留也越來越重，藥物的使用壽命越來越短，防治越來越困難。為了保證食品安全和生產(chǎn)效益不受影響，提高在高密度下飼養(yǎng)畜禽的抗病力就成為當(dāng)前畜牧工作者的一個重要課題。不用抗生素提高畜禽的抗病力不僅有利于動物健康、動物福利和生產(chǎn)效率，而且還可以提高畜禽生產(chǎn)中的微生物安全。

本試驗所選用的15味中草藥為臨床用于疾病防治的常用藥物，經(jīng)過實驗室前期驗證，在疾病的防治方面有確定的療效，如用于奶牛乳房炎、仔豬腹瀉以及雞葡萄球菌病等的防治方面，都顯示了明顯的優(yōu)勢。由于中草藥的天然性和多能性的特點，在臨床應(yīng)用中一方面對相關(guān)疾病具有防治作用，同時調(diào)控機體的平衡，起到調(diào)節(jié)臟腑和陰陽平衡的作用，有助于提高畜禽自身的免疫力和生產(chǎn)力，因此利用中草藥防治動物疾病，已成為當(dāng)前畜牧獸醫(yī)界一個熱點課題。

本試驗的結(jié)果顯示：不同種類中草藥對不同菌株的抗菌效果不同，并且對G+菌株和G-菌株的抑菌效果有明顯的差異，百部、金銀花、魚腥草、連翹、黃柏、紫草、大青草等7種中草藥對G+菌株抑菌效果明顯，敗醬草、大青葉、金銀花和連翹則對大腸桿菌具有明顯的體外抑菌效果。這可能與藥物本身所含成分有關(guān)外，藥物的作用機制（如影響細菌細胞壁或抑制細菌內(nèi)某些酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶等的活性）應(yīng)該發(fā)揮了重要的作用，但這有待于進一步探討。而在這15種中草藥之中，對大腸桿菌的抑菌效果較差的貫眾和魚腥草，對G+則具有明顯的抑菌效果，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與細菌自身所含的脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)和脂蛋白復(fù)合物組成的三層外胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此在中草藥飼料添加劑的配伍方面，除了分離菌株進行生化分析外，還應(yīng)該進行藥物敏感性的試驗研究。

參考文章：

[1] 陳泳，李洪，張麗華，等.3594株病原菌的分布及耐藥性研究[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2011,11（4）：350-352

[2] 姚冰，彭曉燕，李曉波.2010年抗菌藥物應(yīng)用與細菌耐藥性分析[J]。中國醫(yī)院用藥評價與分析，2011,11（4）：353-356

[3] 許亞茹，鄭秀芬，元小冬，等.神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)院感染患者的病原菌譜及耐藥性研究[J].2010,20（3）：427～429

[4] 佟愛華，董梅，匡鐵吉.葡萄球菌醫(yī)院感染臨床分布于耐藥率動態(tài)變遷特征分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2009,9（22）：4314～4317

[5] 羅玲、楊峻，艾地云，等.湖北省部分肉雞場致病性大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]。動物醫(yī)學(xué)進展，2011,32（3）：128-131

[6] 李成葉，袁碩峰，林奕，等.32味祛風(fēng)濕中藥對2個分離菌株的體外抑菌作用[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010,31（11）：43-46

[7] 周軍，溫紹霞.重癥監(jiān)護病房與普通病房靜脈導(dǎo)管感染原病菌分布調(diào)查[J].山西醫(yī)藥雜志：2011,40（4）：355-356