關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與CD105陽(yáng)性滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)并促進(jìn)其成軟骨分化*

張 松， 王鵬程， 胡海清

1武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)骨科，武漢 430060 2武漢大學(xué)中南醫(yī)院急救中心，武漢 430071

創(chuàng)傷、退行性病變等各種原因都易造成軟骨損傷。軟骨的再生修復(fù)能力很差，損傷后的缺損一般通過瘢痕增生修復(fù)，從而失去原有的形態(tài)功能。組織工程學(xué)的興起、研究和進(jìn)展為此治療提供了可能[1]。

種子細(xì)胞是組織工程的研究基礎(chǔ)之一，既往的研究曾選用自體軟骨細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但因它們存在獲取困難、易老化、丟失表型等缺點(diǎn)，應(yīng)用比較困難[2-3]。相比之下，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSC)是近年來興起的一種細(xì)胞。因其來源容易(可從關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中大量取得)，體外易于擴(kuò)增，成軟骨分化能力很強(qiáng)，使其在軟骨組織工程中的應(yīng)用逐漸受到青睞。然而，因它是滑膜細(xì)胞來源，在分化過程中可能伴隨著炎癥反應(yīng)。CD105是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(TGF-β3)的受體，既往的研究報(bào)道證實(shí)，經(jīng)過磁珠分選(MACS)所得的CD105+SMSC具有更強(qiáng)的成軟骨能力[4]。

組織工程學(xué)研究中，使用間接共培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞，可研究細(xì)胞之間通過外分泌的相互作用。軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)，為維持其表型可分泌TGF-β3。而在SMSC成軟骨分化過程中，TGF-β3也是必不可少的[5]。

本研究擬使用Transwell小室進(jìn)行CD105+SMSC和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(ACC)共培養(yǎng)，探索共培養(yǎng)條件下ACC促進(jìn)CD105+SMSC成軟骨的能力，以及在此過程中炎癥反應(yīng)的情況，并為進(jìn)一步研究其作用的分子機(jī)制和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4周齡清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量60 g左右[武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0004]。雙抗(青霉素+鏈霉素)(武漢博士德公司)，PBS(Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)(Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)(Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶(Biosharp公司)，40 μm細(xì)胞濾器(BD公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)液(Hyclone公司)，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(賽業(yè)公司)，CD105兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam公司)，羊抗兔Microbead IgG和MS分選柱(美天旎公司)，牛血清白蛋白(BSA)(博士德公司)，羊抗兔cy3熒光抗體(CST公司)，抗熒光淬滅封片劑(博士德公司)，F(xiàn)ITC流式抗體(三鷹公司)，甲苯胺藍(lán)染液(谷歌生物公司)，引物合成(Invitrogen公司)，細(xì)胞RNA小量提取試劑盒(Omega公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)，SYBR Green(Toyobo公司)，DEPC(Sigma公司)，Transwell小室(康寧公司)。

1.2 SMSC細(xì)胞培養(yǎng)、分選、鑒定

1.2.1 SMSC細(xì)胞分離 SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后，浸泡于75%乙醇10 min消毒，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)髕上囊內(nèi)側(cè)滑膜組織，以預(yù)冷預(yù)加1%雙抗的滅菌PBS沖洗干凈，剪除肉眼可見的脂肪和結(jié)締組織，將分離出的滑膜組織剪成約1 mm3大小的碎塊。加入0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)并置于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，離心棄上清液，用0.1%Ⅱ型膠原酶于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 h，40 μm細(xì)胞濾器過濾，1000 r/min×8 min離心棄上清。用含有10%FBS的DMEM/F12 1∶1重懸后計(jì)數(shù)，培養(yǎng)瓶中接種培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，每2～3天換液1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)，至90%左右融合，以0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)消化后按1∶3比例進(jìn)行傳代。取傳代培養(yǎng)的第3代SMSC備用[4]。

1.2.2 SMSC的誘導(dǎo) 分化成骨誘導(dǎo)：使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)平面培養(yǎng)的第3代SMSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，完成后用茜素紅染色鑒定。成脂誘導(dǎo)：使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)平面培養(yǎng)的第3代SMSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，完成后用油紅O染色，對(duì)脂滴染色鑒定。成軟骨誘導(dǎo)：使用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)Pellet培養(yǎng)的第3代SMSC誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，取出Pellet小團(tuán)，經(jīng)固定、脫水、干燥、石蠟包埋后切片，使用阿利新藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。

1.2.3 SMSC的磁珠分選 用0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，離心1000 r/min ×5 min后棄上清，使用兔多抗CD105(1∶100)于37℃培養(yǎng)箱孵育15 min，離心1000 r/min ×5 min后棄上清，并用PBS洗滌2次以去除未結(jié)合的一抗。計(jì)數(shù)后按每107個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)20 μL羊抗兔Microbead IgG的比例，于37℃培養(yǎng)箱孵育15 min。使用配套的分選設(shè)備和MS分選柱進(jìn)行細(xì)胞分選，所得洗脫的細(xì)胞即為CD105+SMSC。

1.2.4 免疫熒光鑒定 使用免疫熒光鑒定分選的細(xì)胞，將分選所得的細(xì)胞培養(yǎng)傳代至12孔板內(nèi)細(xì)胞爬片，使用4%多聚甲醛在4℃固定30 min，然后PBS洗滌3次，每次5 min，然后在常溫下用0.1%Triton-X100處理20 min，經(jīng)BSA封閉1 h后，孵育CD105兔多抗過夜。次日室溫下孵育羊抗兔cy3二抗1 h，PBS洗滌后用抗熒光淬滅封片液封片，置于蓋玻片上，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞學(xué)鑒定 收集培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期CD105+SMSC，0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)消化后計(jì)數(shù)，重懸后以1000 r/min離心5 min，棄上清后加入CD105抗體和FITC標(biāo)記的流式抗體，經(jīng)孵育、固定后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 ACC細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

1.3.1 ACC細(xì)胞分離 培養(yǎng)大鼠用頸椎脫臼法處死，75%乙醇消毒10 min，在超凈臺(tái)中無菌條件下用手術(shù)刀片切取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)軟骨，放入預(yù)冷的預(yù)加1%雙抗的滅菌PBS中洗2～3次。把軟骨組織用顯微剪切成約1 mm3的碎塊，收集后加入0.25%的胰蛋白酶5 mL；放置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30 min，離心1000 r/min×5 min后棄去胰酶；加入5 mL PBS洗滌2次，離心1000 r/min×5 min后棄上清。使用0.1%的Ⅱ型膠原酶5 mL重懸后置入25 cm2培養(yǎng)瓶，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，使用40 μm細(xì)胞濾器濾去未消化的軟骨組織，過濾的液體以1000 r/min離心8 min，輕輕棄去上清液，加入5 mL含有10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12 1∶1完全培養(yǎng)液，混合后于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3天換液。倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況。長(zhǎng)到90%左右融合即可進(jìn)行傳代。取傳代培養(yǎng)的第3代軟骨細(xì)胞備用[6]。

1.3.2 軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色 軟骨細(xì)胞傳代后，按105/孔加至12孔板爬片中，使用4%多聚甲醛在常溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，在常溫下甲苯胺藍(lán)染液染色30 min，PBS洗滌3次后用乙醇梯度脫水，風(fēng)干后中性樹膠封片，顯微鏡觀察及拍照保存。

1.4 Transwell小室間接共培養(yǎng)

使用Transwell小室(6孔，0.4 μm)(康寧，3450)進(jìn)行CD105+SMSC和ACC的共培養(yǎng)，其中上室內(nèi)為CD105+SMSC，下室內(nèi)為ACC，各孔的細(xì)胞數(shù)目見實(shí)驗(yàn)分組(表1)，另設(shè)置CD105+SMSC +成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(CCM)和單獨(dú)平面培養(yǎng)的CD105+SMSC兩組，分別記作CCM組和對(duì)照組。每間隔2～3 d換液1次，共14 d。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

培養(yǎng)14 d后收集各組細(xì)胞，用RNA小量提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop定量檢測(cè)RNA的濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析各基因的表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參校正，以熔解曲線單峰判斷特異性擴(kuò)增。所使用儀器：熒光定量PCR儀(Bio-rad IQ5)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火10 s，72℃延伸40 s，之后55℃熔解曲線分析。所使用的引物序列見表2。

表1 Transwell小室間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分組(×104/mL)Table 1 Experimental grouping of Transwell indirect co-cultivation(×104/mL)

表2 所用引物序列Table 2 Sequences of primers

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SMSC形態(tài)觀察和成骨、成脂、成軟骨分化鑒定

光鏡下可見滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)梭形的成纖維狀，為干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)(圖1A)；成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)呈紅色為陽(yáng)性(圖1B)；成脂誘導(dǎo)后，油紅O染色可見空泡狀脂滴呈橘紅色為陽(yáng)性(圖1C)；Pellet培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，所得細(xì)胞團(tuán)脫水后切片，阿利新藍(lán)染色呈藍(lán)色為陽(yáng)性(圖1D)。

A：SMSC光鏡形態(tài)(×200)；B：SMSC成骨分化(茜素紅染色，×200)；C：SMSC成脂分化(油紅O染色，×200)；D：SMSC成軟骨分化(阿利新藍(lán)染色，×100)圖1 SMSC形態(tài)觀察和成骨、成脂、成軟骨分化Fig.1 Microscopic observation，osteogenic，adipogenic and chondrogenic differentiation of SMSC

2.2 CD105+SMSC的光鏡觀察、免疫熒光和流式細(xì)胞學(xué)鑒定

光鏡下可見經(jīng)過磁珠分選和未經(jīng)磁珠分選的細(xì)胞形態(tài)并沒有顯著差別(圖2A和2B)，使用CD105為一抗做免疫熒光，可以觀察到分選后的細(xì)胞cy3熒光陽(yáng)性(圖2C)，未分選為陰性(圖2D)，流式細(xì)胞學(xué)鑒定提示，分選后的細(xì)胞表面標(biāo)記CD105陽(yáng)性率占99.82%(圖2E)。

2.3 ACC形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色鑒定

光鏡下可見軟骨細(xì)胞形態(tài)均一，呈三角形、不規(guī)則多邊形或鋪路石樣外觀(圖3A)，甲苯胺藍(lán)染色后可見軟骨細(xì)胞分泌豐富的細(xì)胞外基質(zhì)(圖3B)。

2.4 共培養(yǎng)后的CD105+SMSC成軟骨和炎癥指標(biāo)評(píng)價(jià)

共培養(yǎng)各組mRNA結(jié)果分析(圖4)：與對(duì)照組相比，CCM組的CD105+SMSC可見各成軟骨指標(biāo)的表達(dá)量均明顯上升，ADAMTS-5和RUNX-2表達(dá)增高，MMP-3表達(dá)基本不變，MMP-13表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

與對(duì)照組相比，各成軟骨指標(biāo)表達(dá)量總體為升高趨勢(shì)，但各種比例的組別之間不盡相同，對(duì)于Col2A1，于1∶1比例共培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)量最高，但仍低于CCM組。對(duì)于Aggrecan，于2∶1比例共培養(yǎng)時(shí)候比例最高，與CCM相近。SOX-9基因和Aggrecan相似，在2∶1比例培養(yǎng)時(shí)最高。TGF-β3與上述3個(gè)指標(biāo)較為不同，是在4∶1組的比例最高。炎癥指標(biāo)方面，與對(duì)照組相比，ADAMTS-5在各組均無明顯下降，RUNX-2在4∶1，2∶1和1∶2組無明顯下降，其余各組有下降趨勢(shì)，而對(duì)于MMP-3和MMP-13，各組均有明顯的下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A：分選后SMSC光鏡形態(tài)(×200)；B：未分選SMSC光鏡形態(tài)(×200)；C：分選后SMSC免疫熒光，可見cy3熒光陽(yáng)性(×200)；D：未分選SMSC免疫熒光(×200)；E：分選后SMSC流式細(xì)胞學(xué)鑒定圖2 CD105+SMSC的光鏡觀察、免疫熒光和流式細(xì)胞學(xué)鑒定Fig.2 Identification of CD105+SMSC by microscopic observation，immunofluorescence and flow cytometry

A：ACC光鏡形態(tài)(×200)；B：ACC甲苯胺藍(lán)染色鑒定(×200)圖3 ACC形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色鑒定Fig.3 Microscopic observation and toluidine blue staining of ACC

3 討論

目前，各種創(chuàng)傷和退變所導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎及軟骨損傷、缺損類關(guān)節(jié)疾病在不斷地增加，并嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。成熟的軟骨組織自我修復(fù)能力很差，損傷后經(jīng)常以瘢痕愈合的形式修復(fù)。形成的瘢痕組織缺乏彈性和組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并不能達(dá)到原有的功能。因而最終會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的退變、缺損[7]。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 各組成軟骨指標(biāo)與炎癥指標(biāo)表達(dá)情況Fig.4 Gene expression levels of chondrogenic and inflammation indicators

在針對(duì)病因治療方面，雖然已經(jīng)有很多相關(guān)研究，但至今并未取得逆轉(zhuǎn)軟骨退變等突破性進(jìn)展。近年來組織工程技術(shù)的興起與發(fā)展為此類疾病的治療帶來了新的治療思路與希望，使用組織工程技術(shù)構(gòu)建工程化軟骨，用來替代受損的組織，可以達(dá)到治療的目的[8]。

組織工程的三要素為支架、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子。基于之前的文獻(xiàn)報(bào)道和我們的前期研究，我們選用了CD105+SMSC作為種子細(xì)胞。生長(zhǎng)因子方面，TGF-β3可誘導(dǎo)其成軟骨分化，但是細(xì)胞因子價(jià)格昂貴且不易保存從而限制了其使用范圍，而如果使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染等方法，又常受其載體毒性、效率所限制。

常用的間接共培養(yǎng)技術(shù)即通過濾膜將2種細(xì)胞分隔開，濾膜的孔徑不允許細(xì)胞通過，而細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中的細(xì)胞因子等成分可以通過。軟骨細(xì)胞在體外分泌的過程中，為了維持自身表型會(huì)分泌一些細(xì)胞因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、TGF-β3等，因此我們推測(cè)，將這二者共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)體系中，軟骨細(xì)胞可能通過分泌這些因子而使CD105+SMSC向成軟骨方向進(jìn)行分化，而在此過程中一部分SMSC分化后，新生軟骨細(xì)胞分泌的因子又能夠進(jìn)一步起正反饋?zhàn)饔?。并在此過程中，對(duì)炎癥反應(yīng)也具有一定的影響作用。

本實(shí)驗(yàn)中已使用Real-time PCR證實(shí)了這一點(diǎn)，在2∶1和(或)1∶1組，其4種成軟骨指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)。但TGF-β3不同，它在4∶1組的表達(dá)最高，隨著共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞的增多而呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這和我們預(yù)期中的，隨著軟骨細(xì)胞密度的增加，上清液中應(yīng)該含有更多的成分這一點(diǎn)不符合，并且這個(gè)組內(nèi)的Col2A1、Aggrecan、SOX-9等3個(gè)基因表達(dá)均不是最高的，這個(gè)矛盾點(diǎn)值得進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)來探究。

而關(guān)于其中炎癥指標(biāo)情況，MMP-3和MMP-13這2種基質(zhì)金屬蛋白酶，在關(guān)節(jié)炎的病理過程中起重要的作用。多個(gè)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了它們對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，尤其是Col2A1的降解起作用[9-11]。它們的降低說明了經(jīng)誘導(dǎo)或共培養(yǎng)，可以克服這些軟骨分化的不利因素。ADAMTS-5又稱Aggrecanase-2，它對(duì)于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)尤其是Aggrecan的降解起作用，據(jù)報(bào)道和關(guān)節(jié)炎有關(guān)，有研究證實(shí)沉默ADAMTS-5的siRNA慢病毒注射大鼠關(guān)節(jié)腔可以治療關(guān)節(jié)炎[6]。RUNX-2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，通常在成骨、骨肉瘤發(fā)生侵襲等病理生理過程中起作用，近些年來有報(bào)道證實(shí)了它在關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程的軟骨基質(zhì)降解中所起的作用。這些因子表達(dá)水平的上升可能有兩種解釋，一是在SMSC分化的過程中伴發(fā)有炎性反應(yīng)，從而阻礙其進(jìn)一步分化作用，還有一種可能就是它們對(duì)新生軟骨具有塑形作用，阻止了軟骨的過度肥大[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)組織工程方法進(jìn)行了初步的探索，既說明了選用SMSC的可行性，探索了一種簡(jiǎn)易有效的促成軟骨分化方法和細(xì)胞比例。也為直接接觸式共培養(yǎng)、支架上的三維共培養(yǎng)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分析了Transwell共培養(yǎng)條件下各比例的結(jié)果，通過成軟骨指標(biāo)和炎癥指標(biāo)進(jìn)行了兩個(gè)方面的分析。在ACC與CD105+SMSC為2∶1的比例下，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)Col2A1和Aggrecan水平均顯著提高，而MMP-3及MMP-13水平均有明顯降低。提示本組可能是進(jìn)行共培養(yǎng)成軟骨分化的最佳比例，對(duì)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)有一定的指導(dǎo)作用。