金屬離子對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113厭氧發(fā)酵代謝的影響

鄭曉宇，李 建，方曉江，陳可泉，奚永蘭，姜 岷

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

研究開發(fā)

金屬離子對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113厭氧發(fā)酵代謝的影響

鄭曉宇，李 建，方曉江，陳可泉，奚永蘭，姜 岷

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

考察了培養(yǎng)基中分別添加Mg2+、Mn2+、Co2+3種金屬離子對Actinobacillus succinogenesNJ113菌體生長及產(chǎn)酸的影響，并進(jìn)行了代謝通量分析。結(jié)果表明培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后流向HMP途徑的通量r17比對照組分別提高了445.38%、176.23 %和171.67%，使得還原力不足的矛盾得到緩解；流向C4途徑的通量r13比對照組分別提高了57.70%、15.94%和2.91%；最終使得流向丁二酸的通量r16比對照組分別提高了 62.69%、18.91%和 5.01%。此外，關(guān)鍵酶活分析結(jié)果顯示分別添加 Mg2+、Mn2+以及 Co2+后，PEP羧化激酶（Pck）比活力由對照組的339.18 U/mg分別提高到568.732 U/mg、728.049 U/mg和339.686 U/mg。最終當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸產(chǎn)量分別為27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比對照的22.79 g/L分別提高22.11%、15.27%以及3.4%。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113；丁二酸；Mg2+、Mn2+、Co2+；代謝通量分析

丁二酸（俗名琥珀酸）是生物煉制產(chǎn)品工程中優(yōu)秀的碳四平臺化合物，其可以作為許多重要的中間產(chǎn)物和專業(yè)化學(xué)制品。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是采用石化法，污染大，成本高，嚴(yán)重抑制了丁二酸作為大宗化學(xué)品的發(fā)展?jié)摿?。隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)丁二酸由于其高效率、環(huán)保性以及原料的可再生性而引起許多研究者的注意[1-2]。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）是從瘤胃中篩選出的丁二酸高產(chǎn)菌株，McKlinlay等[3]利用13C原子標(biāo)記確定了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的代謝途徑，結(jié)果表明磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是代謝過程中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，而代謝途徑中關(guān)鍵酶則是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（Pck）和丙酮酸激酶（Pyk）[4-5]。一方面Pck催化PEP生成草酰乙酸（OAA），進(jìn)而合成丁二酸；另一方面PEP又在Pyk的催化下生成丙酮酸（PYR），進(jìn)而生成甲酸、乙酸等副產(chǎn)物。因此這兩個(gè)過程所占通量比例大小直接影響丁二酸的產(chǎn)量，而Pck和Pyk這兩種酶的酶活直接影響了這兩個(gè)通量的比例。影響Pck和Pyk酶活的因素有很多，除了發(fā)酵液中的CO2[6-7]和發(fā)酵液pH值[8]會對兩種酶的酶活有影響外，一些二價(jià)金屬離子也會對兩者有影響。國內(nèi)外眾多研究者[9-13]對Pck進(jìn)行生化特性分析發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Mn2+和Co2+對Pck酶活有明顯的激活作用。

作者利用實(shí)驗(yàn)室篩選的一株丁二酸高產(chǎn)菌Actinobacillus succinogenesNJ113，從代謝通量分析角度，考察適量添加 Mg2+、Mn2+和 Co2+對A. succinogenesNJ113代謝通量分布及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的影響，并結(jié)合關(guān)鍵酶酶活分析說明其影響機(jī)理，為優(yōu)化發(fā)酵過程提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 生產(chǎn)菌株

Actinobacillus succinogenesNJ113（本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 10 g/L（分開滅菌），酵母膏 5 g/L，玉米漿干粉 2.5 g/L，NaHCO310 g/L，NaH2PO4·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4·3H2O 15.5 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 40 g/L（分開滅菌），酵母膏 10 g/L，玉米漿干粉 7.5 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，K2HPO43 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.2 g/L，NaH2PO4·2H2O 1.6 g/L，Na2HPO4·3H2O 0.31 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

種子用100 mL血清瓶培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量2 %，于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h；3 L（BioFlo 110 fermentor；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.）發(fā)酵罐裝液量1.5 L，接種量7 %（體積分?jǐn)?shù)），在37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、CO2通氣量0.5 L/min、以25% Na2CO3為pH值調(diào)節(jié)劑維持pH值在6.8。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖含量的測定

生物傳感分析儀（SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所）。

1.4.2 菌體密度的測定

將發(fā)酵液用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使A660值在0.2～0.8之間，用紫外可見分光光度計(jì)測定。菌液濁度OD660=A660×稀釋倍數(shù)。

1.4.3 細(xì)胞干重的測定

稱出干燥10 mL離心管質(zhì)量（G1），取5 mL發(fā)酵液置于離心管中，9000 r/min離心5 min，棄上清液；再用5 mL生理鹽水清洗兩次，離心，于60 ℃烘箱中干燥至恒重，稱重（G2），則細(xì)胞干重DCW＝(G2－G1)/5。

1.4.4 產(chǎn)物含量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為Aminex? HPX-87H型離子排斥色譜柱（300 mm ×φ7.8 mm，5 μm），流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4水溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫55 ℃，丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸等利用紫外檢測器檢測，檢測波長為215 nm，乙醇利用折光示差檢測器檢測[14]。

1.4.5 酶活的測定

細(xì)胞提取液的制備：取5 mL發(fā)酵液于10 mL離心管中，8000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，用5 mL Tris-HCl（0.1 mol/L，pH值7.0）溶液洗滌兩次后將細(xì)胞懸浮，置于冰槽中超聲破碎 20 min；結(jié)束后8000 r/min、4 ℃離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，保存在－80 ℃冰箱內(nèi)待用。

蛋白質(zhì)濃度的測定：Bradford法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)[15]。

Pck酶活測定體系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值6.6），0.3 mol/L MgCl2，0.15 mol/L MnCl2，1.125 mol/L NaHCO3，12 U/mL 蘋果酸脫氫酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L煙酰胺腺嘌吟二核苷酸（NADH），0.15 mol/L PEP，細(xì)胞提取液；所有底物于37 ℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機(jī)紫外可見分光光度計(jì)于340 nm處測定反應(yīng)的初速度。

Pyk酶活測定體系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值7.5），0.3 mol/L MgCl2，0.75 mol/L KCl， 12 U/mL 乳酸脫氫酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，0.15 mol/L PEP，細(xì)胞提取液；所有底物于37 ℃水浴 20 min，然后采用聯(lián)機(jī)紫外可見分光光度計(jì)于340 nm處測定反應(yīng)的初速度。

一個(gè)酶活力單位（U）定義為1 min催化1 nmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量；比活力為每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)。

式中，V為反應(yīng)體系體積，mL；ε為摩爾消光系數(shù)，cm2/mol；v為樣品量，mL；L為比色杯光徑，cm；ΔA為吸光度變化、109為將mol換算成nmol。

1.4.6 代謝過程及通量分析

利用姜岷等[16]建立的A. succinogenesNJ113以葡萄糖作為碳源合成丁二酸的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝通量計(jì)算方法，采用擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，根據(jù)發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率，丁二酸、甲酸、乙酸、乳酸、乙醇以及生物量的合成速率（r1、r16、r11、r9、r10、r12、rBM），并利用 MATLAB軟件計(jì)算出各個(gè)途徑的代謝通量。整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)包括24個(gè)代謝反應(yīng)方程，18種代謝中間產(chǎn)物，見表1、表2。

表1 代謝反應(yīng)方程

續(xù)表

表2 代謝通量方程

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同濃度的金屬離子對發(fā)酵的影響

本實(shí)驗(yàn)在100 mL血清瓶中發(fā)酵考察培養(yǎng)基中添加不同濃度的 Mg2+、Mn2+及 Co2+，在初始葡萄糖濃度為20 g/L時(shí)對菌體產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，添加不同金屬離子對丁二酸產(chǎn)量都有一定的影響。其中添加Mg2+、Mn2+對產(chǎn)酸均有一定的促進(jìn)作用，其中添加Mg2+的效果最好，Mn2+其次，Co2+影響最小。當(dāng)Mg2+離子添加濃度為6 mmol/L時(shí)，丁二酸產(chǎn)量達(dá)16.71 g/L，丁二酸收率達(dá)到 83.55%，較對照提高 25.9%；當(dāng)Mn2+離子添加濃度為6 mmol/L時(shí)，丁二酸產(chǎn)量達(dá)15.36 g/L，丁二酸收率達(dá) 76.80%，較對照提高19.2%；當(dāng)Co2+離子添加濃度為2 mmol/L時(shí)，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到最大，為 12.39 g/L，丁二酸收率達(dá)61.95%，較對照組提高4.3%。而繼續(xù)增加離子濃度對菌體生長及丁二酸產(chǎn)量有一定的抑制作用，甚至出現(xiàn)下降趨勢。

表3 添加不同金屬離子對發(fā)酵的影響

2.2 添加不同金屬離子對發(fā)酵結(jié)果的影響

在3 L罐中分別考察初糖濃度為40 g/L時(shí)培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+對A. succinogenesNJ113厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出添加不同金屬離子對菌體生長和丁二酸產(chǎn)量均有一定的影響。其中培養(yǎng)基中添加6 mmol/L Mn2+菌體最高OD達(dá)11.93，較對照的9.46增加26.1%，培養(yǎng)基中添加6 mmol/L Mg2+時(shí)菌體最高OD達(dá)10.33，比對照提高9.1%，另外當(dāng)培養(yǎng)基中添加2 mmol/L Co2+菌體最高OD為9.80，雖然僅與對照相差不大，但是其穩(wěn)定期維持時(shí)間較長，也有利于丁二酸產(chǎn)量的增加。金屬離子對菌體生長的促進(jìn)作用也使得丁二酸產(chǎn)量的提高，培養(yǎng)基中未添加金屬離子時(shí)丁二酸的產(chǎn)量為22.79 g/L，當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+時(shí)丁二酸最終產(chǎn)量分別為27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比對照分別提高22.11%、15.27%以及3.40%。

2.3 添加不同金屬離子對代謝通量分布的影響

圖2為A. succinogenesNJ113代謝途徑，代謝通量分析可以直觀地反映細(xì)胞的代謝能力[17]。對A. succinogenesNJ113進(jìn)行代謝通量分析，分別選擇在9 h、9.5 h、10 h、10.5 h、11 h（即穩(wěn)定期）取樣分析發(fā)酵液中的細(xì)胞干重、葡萄糖、丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸以及乙醇的濃度，得到在10 h時(shí)的單位時(shí)間濃度變化率[mmol/(gDCW·h)]，并計(jì)算得到各反應(yīng)的代謝通量。添加不同金屬離子后代謝通量分布情況見表4。

由表4可以看出在發(fā)酵穩(wěn)定期（10 h），添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+時(shí)生物量通量分別為25.76 mmol/(gDCW·h)、25.66 mmol/(gDCW·h)，與對照24.89 mmol/(gDCW·h)相差不大；當(dāng)培養(yǎng)基中添加 2 mmol/LCo2+時(shí)生物量通量為 37.28 mmol/(gDCW·h)，比對照提高了49.78%，使得發(fā)酵穩(wěn)定期延長。

圖1 添加不同金屬離子對A. succinogenes NJ113發(fā)酵過程的影響

圖2 A. succinogenes NJ113的代謝途徑

表4 不同金屬離子對代謝通量分布的影響

通量變化主要在糖酵解途徑（EMP）（r2）、磷酸戊糖途徑（HMP）（r17）、C3（r6）及C4（r13）途徑的摩爾通量上，其中PEP是影響丁二酸合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，PYR是影響乙酸、甲酸等副產(chǎn)物生成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。培養(yǎng)基中添加金屬離子Mg2+、Mn2+、Co2+后流向HMP與EMP途徑的通量比（r17∶r2）分別為45.43∶54.23、23.01∶75.71和22.69∶76.04，而對照的r17∶r2僅為8.33∶88.54。丁二酸生成過程中，菌體通過EMP途徑將1 mol葡萄糖生成2 mol PEP的同時(shí)生成2 mol NADH，但是2 mol PEP生成2 mol丁二酸的同時(shí)則需消耗4 mol NADH，乙酸、甲酸等副產(chǎn)物的生成過程未涉及 NADH的消耗和生成，可見，丁二酸合成過程中存在還原力不足的現(xiàn)象；而HMP途徑中1 mol G6P生成1 mol RL5P的同時(shí)生成 2 mol煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），2 mol NADPH能生成2 mol NADH。因此，HMP途徑通量r17越大越有利于菌體代謝過程中還原力[H]的生成，進(jìn)而有利于丁二酸的產(chǎn)生，由代謝通量分布看出，培養(yǎng)基中添加這3種金屬離子均使得HMP途徑通量比提高，其中添加Mg2+時(shí) HMP途徑通量比最高，Mn2+次之，Co2+最低。

此外培養(yǎng)基中分別添加Mg2+、Mn2+、Co2+后流向 C4途徑的通量r13分別為 160.14 mmol/（gDCW·h）、117.74 mmol/（gDCW·h）、104.51mmol/（gDCW·h），比對照組分別提高了57.70%、15.94%和2.91%；丁二酸代謝通量r16分別為157.83 mmol/（gDCW·h）、115.35 mmol/（gDCW·h）和 101.87 mmol/（gDCW·h），與對照組丁二酸通量97.01 mmol/（gDCW·h）相比，分別提高了62.69%、18.90%和5.01%。同時(shí)，培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mn2+、6 mmol/L Mg2+、2 mmol/L Co2+后流向C3途徑的通量r6均有所降低，使得更多的碳源用于合成產(chǎn)物丁二酸，最終提高了丁二酸產(chǎn)量。

2.4 添加不同金屬離子對關(guān)鍵酶活的影響

菌體代謝過程中的每一個(gè)代謝反應(yīng)都是由特定的酶催化的，酶活力的大小直接影響各代謝反應(yīng)速率，進(jìn)而影響整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布，因此引起上述代謝通量分布變化的原因可能是這3種二價(jià)金屬離子影響了A. succinogenesNJ113代謝過程中的一些關(guān)鍵酶尤其是 Pck和 Pyk酶的酶活。Podkovyrov等[9]研究發(fā)現(xiàn)這3種金屬離子對Pck酶活均有影響。本實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)基中添加3種金屬離子后對發(fā)酵穩(wěn)定期時(shí)（10 h）過程中關(guān)鍵酶的酶活，并與對照比較，結(jié)果見圖3。

圖3 不同金屬離子對關(guān)鍵酶活的影響

由圖3可以看出，這3種金屬離子對Pck和Pyk都有不同程度的影響。Mn2+對Pck和Pyk酶活影響最大，Pck比活力分別由對照組的339.18 U/mg增至728.05 U/mg，提高了135.48%，Pyk比活力由262.34 U/mg增至435.19 U/mg，提高了65.88%，雖然Mn2+使得Pck酶活提高最多，但同時(shí)它使得Pyk酶活大大提高，這對C4途徑通量增加是不利的；Mg2+對 Pck酶活影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中添加Mg2+后 Pck增至 568.73 U/mg，比對照提高了83.95%，Pyk比活力則為282.33 U/mg，比對照提高了7.62%；當(dāng)培養(yǎng)基中添加Co2+后Pck和Pyk比活力分別達(dá)到339.69 U/mg 和273.55 U/mg，與對照相比分別提高了 9.87%和 4.27%。顯然這 3種二價(jià)金屬離子均有利于提高Pck酶活，進(jìn)而使得進(jìn)入C4途徑的通量增加，進(jìn)入 C3途徑的通量減少，最終合成更多的丁二酸，同時(shí)降低乙酸、甲酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)量。經(jīng)過比較，在培養(yǎng)基中添加 Mn2+在提高 Pck酶活的同時(shí)也提高了 Pyk酶活，不利于提高C4途徑通量，進(jìn)而影響丁二酸產(chǎn)量；而Mg2+在提高Pck酶活的同時(shí)對Pyk酶活的影響不大，因此 Mg2+最有利于A.succinogenesNJ113產(chǎn)丁二酸。

3 結(jié) 論

添加上述3種二價(jià)金屬離子對菌體生長及發(fā)酵產(chǎn)丁二酸均有一定的影響，并且均有利于A. succinogenesNJ113 產(chǎn)丁二酸。通過代謝通量分析方法，結(jié)果表明培養(yǎng)基中分別添 Mg2+、Mn2+以及Co2+后流向HMP途徑的通量r17和流向C4途徑的通量r13較對照都有不同程度提高，最終導(dǎo)致流向丁二酸的通量r16提高。此外，關(guān)鍵酶活分析結(jié)果顯示Mg2+、Mn2+以及Co2+對Pck和Pyk酶活均有不同程度的影響，其中Co2+對Pck和Pyk酶活均有提高，但影響最小；Mn2+在提高Pck酶活的同時(shí)也使得 Pyk酶活大大提高，這對 C4途徑通量增加是不利的；Mg2+在提高Pck酶活的同時(shí)對Pyk酶活的影響不大，因此最有利于A.succinogenesNJ113產(chǎn)丁二酸。最終當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加 6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸產(chǎn)量分別為27.83 g/L、26.27 g/L、和23.54 g/L，比對照的22.79 g/L分別提高22.11%、15.27%以及3.4%。

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Effect of metal ions on fermentation and metabolization ofActinobacillus SuccinogenesNJ113

ZHENG Xiaoyu，LI Jian，F(xiàn)ANG Xiaojiang，CHEN Kequan，XI Yonglan，JIANG Min
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

The effects of adding Mg2+，Mn2+，Co2+on cell growth and succinic acid production was investigated. The metabolic flux ofActinobacillus succinogenesNJ113 was calculated. It was found that the flux of HMP increased by 445.38%，176.23 % and 171.67% after adding 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+， 2 mmol/L Co2+respectively，thus the reducing power was better balanced. The flux of C4was 57.70%，15.94% and 2.91% higher respectively，which led to the improvement of succinic acid flux by 62.69%，18.91% and 5.01%. The key enzyme activity analysis showed that the specific activity of PEP carboxykinase（Pck）reached 568.732 U/mg，728.049 U/mg and 339.686 U/mg with 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+，2 mmol/L Co2+addition respectively. As a result，the concentration of succinc acid was 27.83 g/L，26.27 g/L，and 23.54 g/L，while the concentration of control was only 22.79 g/L.

Actinobaccilus succinogenesNJ113；succinic acid；Mg2+，Mn2+，Co2+；metabolic flux analysis

T 921

A

1000–6613（2011）07–1591–07

2010-12-21；修改稿日期：2011-02-18。

國家 973計(jì)劃（2011CB707405）、國家自然科學(xué)基金（21076105）、材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金及江蘇省“青藍(lán)工程”共同資助項(xiàng)目。

鄭曉宇（1986—），女，碩士研究生。E-mail zhengxiaoyu123 @sina.cn。聯(lián)系人：姜岷，教授。E-mail bioengine@njut.edu.cn。