柱層析法提純羊毛脂中膽固醇的工藝

胡文娜，蘇寶根，蘇 云，楊亦文，任其龍

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，二次資源國家專業(yè)實驗室，浙江 杭州 310027）

研究開發(fā)

柱層析法提純羊毛脂中膽固醇的工藝

胡文娜，蘇寶根，蘇 云，楊亦文，任其龍

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，二次資源國家專業(yè)實驗室，浙江 杭州 310027）

采用柱層析法分離羊毛脂中的膽固醇，以膽固醇與雜質(zhì)羊毛甾醇的分離度為判定依據(jù)來篩選吸附劑及優(yōu)化層析工藝，同時對吸附劑進行了再生考察。實驗表明，當(dāng)以200～300目粗孔硅膠為吸附劑、丙酮/正己烷混合溶劑（體積比4∶96）為流動相、35 ℃下膽固醇上載量為2.4%（質(zhì)量分數(shù)）時，膽固醇的分離效果較好，所得膽固醇含量可達84.36%，收率為85.67%。另外選用丙酮/正己烷混合溶劑（體積比50∶50）對吸附劑進行再生處理，硅膠經(jīng)7次使用再生循環(huán)，分離效果未降低。

膽固醇；羊毛甾醇；柱層析；硅膠；再生

膽固醇也稱膽甾醇，是動物組織細胞不可缺少的重要物質(zhì)，工業(yè)上主要用于化妝品[1]、乳化劑、醫(yī)藥等。膽固醇既可以從動物腦組織和脊髓組織中提取，又可以從羊毛脂中提取。前種方法由于其資源有限，無法滿足日益增長的需求。羊毛脂[2]中不僅有較高的膽固醇含量，而且在我國有較豐富的資源，可成為膽固醇的主要來源[3]，因此如何將膽固醇從羊毛脂中分離出來就成為關(guān)鍵技術(shù)。

目前提純膽固醇的方法主要有溴化法、分子蒸餾法、超臨界萃取法、結(jié)晶法、絡(luò)合法和色譜法等[4]。溴化法所得收率偏低，而且溴的使用限制了此方法的應(yīng)用；分子蒸餾法[5]得到的膽固醇含量較低[6]，適合作為前處理步驟；超臨界萃取法對膽固醇選擇性不高，而且其在CO2的溶解度有限[7-8]；結(jié)晶法的優(yōu)點在于過程簡單，但結(jié)晶步驟和相應(yīng)的工藝條件需要嚴格控制，且膽固醇收率低，操作難度較大；絡(luò)合法是目前應(yīng)用較多的方法，但其操作復(fù)雜，且金屬離子對環(huán)境不友好[9]；色譜法是應(yīng)用比較成熟的一種工業(yè)方法[10-11]，操作方便，分離效果較好。van Dam[12]曾使用Merck60硅膠層析色譜將皂化預(yù)處理過的羊毛脂進行分離純化，膽固醇產(chǎn)品含量為 60%～80%，但其流動相采用甲苯與乙酸丁酯的混合溶劑，有一定毒性，不適合工業(yè)應(yīng)用。

本文作者采用與文獻[12]不同的原料，該原料為羊毛脂經(jīng)轉(zhuǎn)酯化與分子蒸餾預(yù)處理所得，主要是多種鏈狀脂肪醇與甾醇的混合物羊毛醇[13]。下文將以產(chǎn)品中膽固醇與雜質(zhì)代表物羊毛甾醇[14]的分離度為依據(jù)，最終產(chǎn)品膽固醇含量和回收率為目標，通過篩選合適的固定相和流動相組成，考察溫度和上載量等主要參數(shù)對分離的影響，得到柱層析法分離膽固醇的優(yōu)化工藝條件，并完成對吸附劑的再生[15]。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

甲醇、正己烷、硫酸、乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；丙酮（分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司）；200～300目粗孔硅膠（青島海洋化學(xué)試劑）；SRC活性炭（先科有限公司）；HZ-816樹脂（上海華震科技有限公司）；GF254硅膠板（青島海洋化學(xué)試劑）；膽固醇標樣（含量95%，sigma公司）。 原料為羊毛脂經(jīng)轉(zhuǎn)酯化和分子蒸餾預(yù)處理的產(chǎn)物，其中膽固醇含量為20%～30%，由浙江花園生物高科股份有限公司提供。

1.2 儀器

層析柱，φ1.54 cm×50 cm，帶水浴夾套；Waters高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，包括Waters 510高壓泵，Waters717自動進樣器，Waters 2487紫外檢測器。

1.3 高效液相色譜定量分析條件

色譜柱，Waters Symmetry C18柱（5 μm，φ0.46 cm×15 cm）；流動相，無水甲醇；流速，1.0 mL/min，檢測波長，205 nm；柱溫，35 ℃；進樣量，10 μL。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品溶液制備

原料用正己烷溶解，配制成濃度為100 mg/mL的溶液備用。

1.4.2 分離條件選擇

使用規(guī)格為φ0.39 cm×15 cm不銹鋼色譜空柱，干法填入吸附劑，將色譜柱連入HPLC系統(tǒng)，在設(shè)定操作條件下平衡色譜柱后，進10 μL樣品溶液，根據(jù)色譜流出曲線計算膽固醇與羊毛甾醇的分離度，以此篩選合適的流動相組成和操作溫度。

1.4.3 層析柱制備與樣品分離

稱取18 g粗孔硅膠的吸附劑，加入80 mL流動相制成勻漿，濕法裝柱，床層體積約為50 mL。使用3倍床層體積以上的流動相平衡固定相，再將10 mL樣品溶液從柱頂端緩緩加入，進樣完畢后使用流動相洗脫?？刂屏魉僭?1～1.2 mL/min，每收集15 mL流出液作為一個餾分，每一餾分中的膽固醇與羊毛甾醇濃度由HPLC定量分析，分別合并富含羊毛甾醇與含膽固醇的餾分，并真空濃縮，再用HPLC進行膽固醇含量分析，計算回收率。

1.5 再生條件考察

1.5.1 薄層色譜法篩選再生溶劑

取活化后的GF254硅膠板，用樣品溶液點樣，以丙酮/正己烷的混合溶液為展開劑，考察展開劑中丙酮與正己烷體積比（1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1）對薄層色譜分離的影響，硅膠板晾干后用硫酸的乙醇溶液（1∶9，體積比）顯色。

1.5.2 再生實驗

使用粗孔硅膠裝填不銹鋼色譜空柱，進樣分離測試羊毛甾醇與膽固醇的分離度，之后使用不低于5倍床層體積的樣品連續(xù)通過硅膠柱后，使用再生溶劑對硅膠柱進行再生，待再生完全后進樣分離測試此時硅膠柱對羊毛甾醇與膽固醇的分離度，多次重復(fù)循環(huán)上述步驟比較分離度，考察重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相篩選

膽固醇分子尺寸為 1.91 nm×0.77 nm×0.40 nm[16]，分子體積較大，應(yīng)選擇大孔徑吸附劑。本研究選取了活性炭、大孔樹脂與硅膠3種吸附劑，將其裝填于色譜柱內(nèi)，在35 ℃、流速0.4 mL/min條件下，使用優(yōu)化的流動相色譜分離考察羊毛甾醇與膽固醇的分離效果，結(jié)果如圖1所示。

以羊毛甾醇為雜質(zhì)組分代表，通過羊毛甾醇與膽固醇兩峰的分離度作為實驗判斷依據(jù)。當(dāng)樹脂與活性炭作為色譜柱固定相時，得到的洗脫曲線僅有單一的峰，無分離效果。以硅膠為固定相時，可將膽固醇與雜質(zhì)進行分離，硅膠柱分離效果好，選擇硅膠為吸附劑進行后續(xù)研究。經(jīng)標定，保留時間在 15～20 min的峰是羊毛甾醇在紫外檢測下的峰，在25～30 min的峰是膽固醇在紫外檢測下的響應(yīng)峰，脂肪醇等雜質(zhì)在選定的紫外波長下沒有明顯響應(yīng)。

圖1 3種吸附劑的洗脫曲線

2.2 流動相的選擇

硅膠層析是一個正相色譜洗脫的過程，應(yīng)選擇非極性的流動相。選擇正己烷為流動相主體，考察在其中加入不同類型及不同比例極性溶劑的分離效果。極性溶劑的含量越高，流動相極性越大，洗脫能力越強，若極性過大會無法實現(xiàn)分離，因此需要尋找合適的極性溶劑及配比。本研究分別選用甲醇和丙酮作為極性溶劑。

按照 1.4.2節(jié)中測試分離效果的步驟，分別以不同體積比的甲醇/正己烷（0.5∶99.5，1∶99，2∶98）和丙酮/正己烷（2∶98，3∶97，4∶96，5∶95）為流動相測試分離效果，結(jié)果見圖2。

圖2 流動相組成對分離度的影響

結(jié)果表明，正己烷很難將甾醇從硅膠上洗脫下來，而在正己烷溶液中加入少量甲醇或丙酮后，洗脫能力有顯著提高。當(dāng)甲醇與正己烷體積比在（0.5∶99）～（2∶98）范圍內(nèi)時膽固醇與羊毛甾醇的分離度均小于 1.7，而當(dāng)丙酮與正己烷體積比在（2∶98）～（5∶95）范圍內(nèi)時分離度均大于2，可以較好地實現(xiàn)羊毛甾醇和膽固醇峰的分離，因此選擇正己烷與丙酮的混合溶劑作為流動相。膽固醇峰的對稱因子隨丙酮體積分數(shù)的增加趨近 1，峰形對稱性更好并且拖尾較小。當(dāng)丙酮與正己烷體積比為4∶96時，分離度略低于3∶97條件下的分離度，但兩峰已可實現(xiàn)基線分離，對最終產(chǎn)品純度影響有限，并且洗脫體積減少了不低于2個床層，降低了洗脫時間及流動相的使用量。綜合上述因素，選擇適宜的流動相為丙酮/正己烷（4∶96，體積比）。

2.3 溫度的影響

溫度對吸附平衡有一定影響，在常用溫度范圍內(nèi)對其進行考察。在丙酮/正己烷（4∶96，體積比）為流動相、流速0.4 mL/min條件下，分別考察了25℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃下羊毛甾醇雜質(zhì)峰與膽固醇峰的分離度，結(jié)果見表1。由表1可知，分離度相差不大，均能實現(xiàn)基線分離。但較低溫度需要較長的洗脫時間且拖尾現(xiàn)象較嚴重，而溫度過高增加溶劑揮發(fā)，最終選擇操作溫度為35 ℃。

2.4 上載量的影響

層析過程中，需要尋找一個合適的上載量，使吸附劑得到充分利用，同時不因過高的上載量造成色譜柱過載而降低分離效果。固定分離條件為：35℃，玻璃柱規(guī)格φ1.54 cm×50 cm，硅膠裝填量18.0 g（50 mL），丙酮/正己烷（4∶96，體積比）為流動相，流速保持在每小時一個床層體積（BV/h）左右，考察3個不同上載量下膽固醇的含量與回收率，實驗結(jié)果見表2。

上述數(shù)據(jù)表明，對吸附分離羊毛脂中膽固醇的體系來說，硅膠體現(xiàn)出較高的處理能力，以膽固醇的質(zhì)量計算，上載量在 3%以下，膽固醇含量與回收率均不低于70%；而當(dāng)上載量為2.407%時，得到的膽固醇含量與回收率均在85%左右。圖3即為此上載量下得到的流出曲線，分離條件為丙酮/正己烷（4∶96，體積比）洗脫，35 ℃，流速1 BV/h。從流出曲線可以看出，羊毛甾醇等雜質(zhì)與膽固醇的流出峰有部分重合，因此切割位點的選擇也會對含量與回收率有一定影響。

表1 溫度的影響

表2 上載量對膽固醇含量與收率的影響 單位：%

圖3 上載量2.407%下的硅膠柱流出曲線

2.5 硅膠再生

吸附劑無法重復(fù)利用是限制柱層析工藝廣泛應(yīng)用的一個因素，可重復(fù)使用的吸附劑不僅壓縮了生產(chǎn)成本，同時減少了環(huán)境負擔(dān)，使層析工藝得以推廣。本研究選定了不同的再生溶劑，并考察再生后硅膠柱的分離效果。

2.5.1 再生溶劑的選擇

丙酮對附著于硅膠吸附劑的極性物質(zhì)具有較強的洗脫能力，且之前的分離過程使用了正己烷與丙酮的混合溶劑，選擇適當(dāng)比例的丙酮正己烷混合溶劑為再生溶劑效果好，并減少了溶劑更換，操作簡易。表3為對多次點板上樣后的硅膠板使用丙酮與正己烷體積比例分別為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1的溶劑為展開劑時硅膠板再生效果。

當(dāng)丙酮與正己烷體積比為1∶9和3∶7時，體系仍能表現(xiàn)出一定的分離效果，羊毛甾醇與膽固醇Rf值有明顯差異，并且在原料點附近有某種較難洗脫的雜質(zhì)殘留；使用體積比5∶5和7∶3的丙酮/正己烷展開液時，兩種甾醇的相對Rf比均為1，且其在5∶5的比例下有較大的Rf值；當(dāng)丙酮/正己烷體積比為 9∶1時，可能由于對甾醇溶解度下降，Rf值有所減小。能同時將所有物質(zhì)快速洗脫是理想的再生溶劑，因此本研究選擇了體積比為5∶5的丙酮/正己烷作為再生溶劑。

表3 不同溶劑配比再生效果

2.5.2 再生效果的考察

為保證吸附劑可以多次再生使用，本研究進行了重復(fù)性實驗來驗證硅膠在多次分離并再生后的分離效果，結(jié)果如圖4所示。

按照1.5.2節(jié)的操作步驟再生7次的過程中，實驗使用的填充硅膠柱分離羊毛脂中膽固醇與羊毛甾醇的分離度并未下降，而是在2.7附近略有波動，可認為波動基本是由實驗誤差引起的。因此實驗用的硅膠可以再生完全，并重復(fù)使用而不影響分離效果。

3 結(jié) 論

通過硅膠柱層析法提純羊毛脂中膽固醇的實驗研究，得到以下結(jié)論。

圖4 再生不同次數(shù)后的硅膠對膽固醇與羊毛甾醇的分離度

（1）從3種不同的吸附劑中，優(yōu)選出200～300目層析用粗孔硅膠做為柱層析的固定相。

（2）最佳分離工藝條件為：35 ℃下，固定相為粗孔硅膠，流動相為體積比4∶96的丙酮/正己烷混合溶劑，膽固醇上載量在2.4%（體積分數(shù)）時，產(chǎn)品中膽固醇含量在 84.36%，回收率為 85.67%，可進一步結(jié)晶純化。

（3）選擇了體積分數(shù)為 50%丙酮正己烷混合溶劑為適宜的再生溶劑，經(jīng)7次使用再生后硅膠仍能保持其分離能力，分離度未降低。

[1]Lower E S. Cholesterol in cosmetic formulation—Review[J].Drug & Cosmetic Industry，1975，116：54-57.

[2]Motiuk K. Wool wax alcohols：A review[J].Journal of American Oil Chemists’Society，1978，56：651-658.

[3]邵妙娟. 不同催化劑催化羊毛脂轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備膽固醇的工藝[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[4]劉勇，楊揚，楊景昌. 從羊毛醇中提取膽甾醇方法的評述[J]. 日用化學(xué)工業(yè)，2006，36（2）：107-130.

[5]林濤，王宇，梁曉光，等. 分子蒸餾技術(shù)濃縮合成維生素E[J]. 化工進展，2009，28（3）：496-503.

[6]Guengrous J，Lutisan J. Process for preparing sterol alcohols from lanolin：CZ，279996[P]. 1995-09-13.

[7]Jones F W，Bateup B O，Dixon D R，et al. Solubility of wool wax in supercritical carbon dioxide[J].Journal of Supercritical Fluids，1997，10：105-111.

[8]Chen W，Su B G，Xing H B，et al. Solubility of cholesterol and desmosterol inn-hexane + ethanol mixed solvents[J].Fluid Phase Equilibra，2009，287（1）：1-6.

[9]胡芬，譚蘭蘭，楊景昌，等. 從羊毛醇中提取膽甾醇的工藝研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2008，20（11）：1441-1446.

[10]張穎穎，楊亦文，任其龍，等. 硅膠柱層析法提純大豆磷脂酰膽堿的研究[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2006，20（5）：685-689.

[11]張琳，楊磊，祖元剛，等. pH梯度萃取-堿性氧化鋁柱層析分離長春花中的文多靈和長春質(zhì)堿[J]. 化工進展，2009，28（7）：1282-1286.

[12]van Dam. Method of isolating sterols in commercial quantities from sterol-containing material：US，4664807[P]. 1987-05-12.

[13]Lamparcayk H，Miszkiel M. Gas chromatographic evaluation of wool wax alcohols supported by principal component analysis[J].Chromatographia，1991，31（5-6）：243-246.

[14]Levan K K，Merilyn M H，Brian K N. A low-toxicity method for the separation of lanosterol and dihydrolanosterol from commercial mixtures[J].Steroids，2004，69：697-700.

[15]董亮，農(nóng)紹莊，王偉，等. 層析用硅膠G再生的可行性及方法研究[J]. 離子交換與吸附，2007，23（1）：82-87.

[16]Hsu C W，Yang M C. Enhancement of the imprinting effect in cholesterol-imprinted microporous silica[J].Journal of Non-Crystalline Solids，2008，354：4037-404.

Purification of cholesterol from lanolin by column chromatography

HU Wenna，SU Baogen，SU Yun，YANG Yiwen，REN Qilong
（Department of Chemical and Biological Engineering，National Laboratory of Secondary Resources Chemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China）

Cholesterol was purified from lanolin by column chromatography. The separation process was optimized based on the resolution between cholesterol and lanosterol，which was one of the impurities. The regeneration of adsorbent was also studied. The optimum purification condition was as follows：adsorbent was silica gel，mixture solvent of acetone/hexane（4∶96，volume ratio）was used as eluent and proper temperature was 35℃. After the separation，the purity of cholesterol was determined by HPLC to be 84.36% and the recovery was 85.67% when the column charge of cholesterol was 2.407% by weight. Additionally，the adsorbent was regenerated by the mixture solvent of acetone/ hexane（50∶50，volume ratio）. The separation ability of silica gel remained almost unchanged after 7 cycles of usage and regeneration.

cholesterol；lanosterol；column chromatography；silica gel；regeneration

TQ 645.9

A

1000–6613（2011）07–1426–05

2010-12-17；修改稿日期：2010-12-30。

國家自然科學(xué)基金重點項目（20936005）及國家863計劃重點項目（2010AA101503）。

胡文娜（1986—），女，碩士研究生，主要研究天然產(chǎn)物分離方向。E-mail foxhu@zju.edu.cn。聯(lián)系人：蘇寶根，副教授，主要從事天然產(chǎn)物分離和超臨界流體技術(shù)研究。E-mail subg@zju.edu.cn。