LE540對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮bFGF及TGF-β2的影響

苗英彬，張未娟，鄧志宏，曾麗明，楊瑞波，張 琛，趙少貞

（天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心屈光角膜科，天津300384）

近年來(lái)，視網(wǎng)膜色素上皮（retinalpigmentepithelium，RPE）細(xì)胞在近視發(fā)生中的作用已成為眼科研究中的熱點(diǎn)。體外研究表明視黃酸可以調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞分泌堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子 β2（transfergrowth factor-β2，TGF-β2）等生長(zhǎng)因子，而這些細(xì)胞因子都和近視的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[1]。但RPE細(xì)胞內(nèi)通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌尚未明確。本研究通過(guò)在培養(yǎng)的豚鼠RPE細(xì)胞加入全反式視黃酸和視黃酸β受體阻斷劑LE540來(lái)觀察其對(duì)細(xì)胞分泌bFGF和TGF-β2的影響，尋找控制人類近視發(fā)展的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó)Forma公司）；倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；小鼠抗大鼠廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin,PCK）單克隆抗體（1∶200）（武漢博士德公司）；LE540(日本 Wako)；bFGF、TGF-β2ELISA 試劑盒（美國(guó)ADL公司）。

1.2 豚鼠RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 2~3周齡健康普通級(jí)三色豚鼠4只，雌雄不限（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），腹腔注射過(guò)量水合氯醛處死，摘除眼球，去除眼周組織，PBS沖洗，于含0.2 g/L慶大霉素的PBS中4℃浸泡20～30min后取出眼球用PBS沖洗2～3次，于裝滿PBS的培養(yǎng)皿中沿鋸齒緣剪開(kāi)眼球去除眼前節(jié)部分，去除玻璃體和神經(jīng)視網(wǎng)膜層，置于干凈平皿中撕下色素膜浸于0.25%的胰蛋白酶中37℃消化10～15min。加入培養(yǎng)液吹打，1 000 r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液吹打，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，收集于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，傳代后用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)。2～3 d后第1次換液，洗掉未貼壁的細(xì)胞。5～7 d后細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代。先加入少量0.25%的胰蛋白酶消化30 s，用PBS洗滌，棄去洗液以去除貼壁不牢的其他細(xì)胞。再加入胰蛋白酶于37℃孵箱中消化1～2min，震蕩后可見(jiàn)細(xì)胞脫落時(shí)加入含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，吹打后移入離心管，1 000 r/min離心5min，按1∶3傳代。培養(yǎng)30～60min，稍震蕩后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至另一培養(yǎng)瓶以去除貼壁較快的成纖維細(xì)胞。取第2代細(xì)胞，進(jìn)行上皮細(xì)胞特異的角蛋白免疫組織化學(xué)染色，采用小鼠抗大鼠PCK單克隆抗體一抗（1∶200）鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 ELISA檢測(cè)bFGF、TGF-β2的分泌 第2代細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后換無(wú)血清培養(yǎng)液，24 h后分別換含10×10-6mol/LATRA和5×10-6mol/L LE540 的無(wú)血清培養(yǎng)液，分別于換液后 2、4、6、8、16 h收集培養(yǎng)液，-20℃保存。按試劑盒說(shuō)明步驟嚴(yán)格操作檢測(cè) bFGF、TGF-β2的分泌量：（1）取出酶標(biāo)板分別加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于空白孔。（2）在樣品孔中加入10μL生物素標(biāo)記液。（3）在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加入100μL酶標(biāo)記液。（4）37℃孵育60min。（5）清洗5次。（6）每孔加入底物A液、B液各50μL，37℃避光孵育15min。（7）每孔加入終止液50μL終止反應(yīng)。（8）測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處各孔的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以用表示，ATRA處理組、LE540處理組與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)bFGF、TGF-β2分泌量的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析，同時(shí)間點(diǎn)組間比較及不同時(shí)間點(diǎn)間的多重比較采用Dunnett t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPE細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 原代豚鼠RPE細(xì)胞含有豐富的色素，體積大而扁平，呈多角形或圓形向周圍伸展，可見(jiàn)細(xì)胞核分裂相（圖1）。傳代后色素減少，細(xì)胞近融合時(shí)形態(tài)近六角形（圖2）。免疫組織化學(xué)角蛋白染色RPE細(xì)胞顯示為棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)（圖 3）。

2.2 視黃酸和LE540對(duì)RPE細(xì)胞分泌的TGF-β2影響 加入ATRA和LE540后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組三者的比較結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者在 2、4、6、8、16 h TGF-β2的分泌量存在差別，F(xiàn)=297.776，P<0.001。ATRA與對(duì)照組比較，P<0.001；LE540與對(duì)照組比較，P<0.001。差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處理因素與時(shí)間有交互作用，P<0.001。加入10×10-6mol/L的ATRA后，2、4、6、8、16 h 時(shí)，TGF-β2的分泌量 ATRA 組較對(duì)照組均明顯增加（t=28.178，P=0.000；t=37.133，P=0.000；t=25.839，P=0.000；t=7.283，P=0.005；t=10.271，P=0.002）。加入 5×10-6mol/L 的 LE540后，2、4、6、8、16 h 時(shí)，TGF-β2的分泌量 LE540 組較對(duì)照組均明顯減少（t=-9.689，P=0.002；t=-21.714，P=0.000；t=-14.461，P=0.000；t=-33.906，P=0.000；t=-3.204，P=0.049)（表1）。

表1 ATRA和LE540處理組各時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞的TGF-β2分泌量比較 (pg,n=4）Tab 1 Comparison of TGF-β2 secreted by RPE cell in different time pointof thegroup treatedwith ATRA and LE540(pg,n=4）

表1 ATRA和LE540處理組各時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞的TGF-β2分泌量比較 (pg,n=4）Tab 1 Comparison of TGF-β2 secreted by RPE cell in different time pointof thegroup treatedwith ATRA and LE540(pg,n=4）

不同時(shí)間點(diǎn)上RPE分泌TGF-β2的水平組別 6 h 119.5±4.3 168.8±1.7 145.9±1.3 4 h 119.6±1.3 168.0±1.6 138.2±0.6 2 h 100.1±0.7 195.9±1.8 123.5±4.2 8 h 124.6±1.9 176.8±1.8 159.7±3.7 16 h 120.6±1.9 131.6±0.7 125.3±1.8 LE540組ATRA組對(duì)照組

2.3 視黃酸和LE540對(duì)RPE細(xì)胞分泌的bFGF影響 ATRA組、LE540組及對(duì)照組3者總體比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=914.432，P<0.001。LE540組、ATRA分別與對(duì)照組比較采取Dunnett t檢驗(yàn)：LE540與對(duì)照組比較，P=0.178，差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ATRA與對(duì)照組比較，P<0.001，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處理因素和時(shí)間之間存在交互作用，P<0.001。加入10×10-6mol/L 的 ATRA 后，2、4、6、8、16 h 時(shí)，bFGF分泌量ATRA組較對(duì)照組均明顯減少（t=-5.328，P=0.033；t=-7.348，P=0.018；t=-8.448，P=0.014；t=-25.062，P=0.002；t=-29.375，P=0.001)（表2）。

表2 ATRA處理組各時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞的bFGF分泌量比較pg,n=4）Tab 2 Com parison of bFGF secreted by RPE cell in different time pointof thegroup treated w ith ATRA(pg,n=4）

表2 ATRA處理組各時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞的bFGF分泌量比較pg,n=4）Tab 2 Com parison of bFGF secreted by RPE cell in different time pointof thegroup treated w ith ATRA(pg,n=4）

不同時(shí)間點(diǎn)上RPE分泌bFGF的水平組別 6 h 309.0±1.1 346.7±6.7 4 h 313.9±1.6 342.6±6.9 2 h 303.4±10.1 352.8±6.9 8 h 300.6±2.2 357.9±2.0 16 h 210.3±0.89 230.5±1.82 ATRA組對(duì)照組

3 討論

近視發(fā)病機(jī)制的研究已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。Heber和Mosest[2]較早闡述了“局部視網(wǎng)膜調(diào)控”機(jī)制，這種機(jī)制認(rèn)為：視網(wǎng)膜感知外界環(huán)境變化后產(chǎn)生一級(jí)近視信號(hào)因子（如視黃酸、多巴胺、血管活性腸肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子等），并作用于視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜，使之產(chǎn)生二級(jí)信號(hào)因子（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ、肝細(xì)胞生長(zhǎng)HGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF等），從而啟動(dòng)了視網(wǎng)膜-視網(wǎng)膜色素上皮層-脈絡(luò)膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),把局部視網(wǎng)膜信號(hào)轉(zhuǎn)化為調(diào)控鞏膜ECM重塑的信號(hào),眼軸增長(zhǎng)而近視形成[3]。

bFGF和TGF-β2已被證實(shí)與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它們是RPE細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，此外RPE也分泌其他細(xì)胞因子[4]如色素上皮源性因子、白介素-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF等，這些因子又可以反作用于RPE細(xì)胞本身，影響其功能。對(duì)于近視形成的過(guò)程中，鞏膜[5-6]、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜中[7]TGF-β2水平均降低，它的變化要早于近視鞏膜的變化，但是還沒(méi)有直接的證據(jù)說(shuō)明TGF-β2的變化引起了近視的發(fā)生[8]。也有研究顯示近視眼的視網(wǎng)膜、RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體及鞏膜的TGF-β2濃度升高[5]，并且通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2對(duì)鞏膜發(fā)生重塑起到了重要的作用也影響到鞏膜細(xì)胞的表型變化[6]。但都肯定了TGF-β2與近視發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具體如何變化還需要大家探討，我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)視黃酸引起TGF-β2分泌的增加，支持在近視發(fā)生過(guò)程中TGF-β2是近視促進(jìn)因素的觀點(diǎn)。在形覺(jué)剝奪的近視眼的后極部bFGF的表達(dá)明顯減少[9]，大量研究表明bFGF是實(shí)驗(yàn)性近視的終止信號(hào)，能夠阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮的凋亡，bFGF有可能成為治療人類近視的突破點(diǎn)[10]。

視黃酸（retinoic acid,RA）是眼及視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分化發(fā)育中不可缺少的物質(zhì)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)RA與實(shí)驗(yàn)性近視的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，RA可能作為一種信使通過(guò)某種機(jī)制來(lái)調(diào)控鞏膜重塑而誘發(fā)形覺(jué)剝奪性近視[11]，大量的研究表明RA確實(shí)促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)性近視的進(jìn)展。RA受體屬于細(xì)胞核受體，包括視黃酸受體(retinoic acid receptor,RAR)和視黃素X受體(retinoic X receptor,RXR)，它們各有α、β和γ 3種亞型。而在視黃酸受體中，RARβ是由視黃酸誘導(dǎo)產(chǎn)生并受視黃酸自身調(diào)節(jié)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼球的發(fā)育中起著非常重要的作用，它通過(guò)與RA結(jié)合，調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞DNA的合成，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化。研究表明，RARβ可能參與雞的形覺(jué)剝奪性近視的形成，形覺(jué)剝奪2周后雛雞眼視網(wǎng)膜RARβmRNA的表達(dá)增高[12]，體外實(shí)驗(yàn)同樣證明了這點(diǎn)。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)形覺(jué)剝奪的眼的后極部視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜鞏膜的RARβmRNA的表達(dá)增高，對(duì)豚鼠鞏膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)RA抑制成纖維細(xì)胞的增生[13]。這些結(jié)果提示我們RARβ參與豚鼠FDM的形成,其變化可能受RA變化的誘導(dǎo)。并且有證據(jù)提示RA的變化要早于眼球形態(tài)學(xué)的改變[14]。但是最近通過(guò)對(duì)高度近視的群體研究發(fā)現(xiàn)：RARβ在高度近視的人群的基因序列并沒(méi)有變化[15]。我們團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)豚鼠后極部鞏膜中RARβ蛋白含量改變與RA水平的變化趨勢(shì)和方向相同。因此RA促進(jìn)近視發(fā)展引起bFGF和TGF-β變化是否通過(guò)RARβ成為本實(shí)驗(yàn)的研究范圍，為視網(wǎng)膜近視的信號(hào)通路的研究提供更為有力的證據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別在培養(yǎng)的豚鼠RPE細(xì)胞加入ATRA和視黃酸β受體阻斷劑LE540來(lái)觀察其對(duì)細(xì)胞分泌bFGF和TGF-β2的影響，結(jié)果顯示視黃酸能明顯促進(jìn)RPE細(xì)胞分泌TGF-β2，同時(shí)又明顯抑制bFGF的分泌；培養(yǎng)的RPE細(xì)胞加入LE540后，TGF-β2的分泌量比對(duì)照組明顯減弱，而bFGF的分泌沒(méi)有明顯變化。TGF-β2的分泌與視黃酸引起的作用正好相反，提示我們視黃酸引起的TGF-β2分泌變化是通過(guò)視黃酸β受體而實(shí)現(xiàn)的。bFGF的分泌受到視黃酸的影響，但是視黃酸β受體阻斷對(duì)bFGF的分泌沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明視黃酸引起bFGF分泌的變化是通過(guò)其他受體起作用的，而非視黃酸β受體。

本研究認(rèn)為全反式視黃酸能夠調(diào)控RPE細(xì)胞分泌bFGF和TGF-β2，不過(guò)只有TGF-β2的分泌是通過(guò)視黃酸β受體而進(jìn)行調(diào)節(jié)的，bFGF的分泌與此受體沒(méi)有直接關(guān)系。我們推測(cè)，在近視發(fā)生過(guò)程中首先是視黃酸的分泌增加，然后RA進(jìn)一步作用于RPE細(xì)胞，與視黃酸β受體結(jié)合來(lái)促進(jìn)TGF-β2的分泌，TGF-β2或者直接起到促進(jìn)近視發(fā)生的作用，或者通過(guò)拮抗bFGF而起作用。總之視黃酸β受體是視黃酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要分子，在近視的發(fā)生中起到重要作用。而RA是通過(guò)何種途徑而引起bFGF分泌變化需要進(jìn)一步探討。本研究為探索近視形成的機(jī)制及藥物治療提供線索。但體內(nèi)環(huán)境較體外復(fù)雜多變，LE540在體內(nèi)是否會(huì)有相同作用尚有待進(jìn)一步研究。

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