• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)與基因分型

    2011-10-19 03:20:56楊軍張馳
    中國(guó)乳品工業(yè) 2011年3期
    關(guān)鍵詞:腸毒素葡菌乳源

    楊軍,張馳

    (南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,南京210028)

    乳源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)與基因分型

    楊軍,張馳

    (南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,南京210028)

    通過(guò)檢驗(yàn)各類乳制品收集了大量乳源性金葡菌菌株,應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法對(duì)菌株的腸毒素進(jìn)行檢測(cè)分析,并進(jìn)一步使用熒光定量PCR法對(duì)腸毒素基因進(jìn)行分型。結(jié)果表明,乳源性金葡菌腸毒素的檢出率與基因型分布均呈現(xiàn)一定顯著特征,應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法與熒光定量PCR法對(duì)腸毒素的檢測(cè)結(jié)果總體無(wú)顯著性差異。

    乳源性金黃色葡萄球菌;腸毒素;酶聯(lián)熒光免疫;熒光定量PCR;基因分型

    0 引言

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡(jiǎn)稱金葡菌)是導(dǎo)致人類食物中毒與化膿性感染的最主要病原體之一[1]。乳及乳制品是金葡菌主要食品宿主,我國(guó)生奶中金葡菌的污染率一般在15%~30%之間,奶酪、酸奶等乳制品中金葡菌的檢出率也一直居高不下[2,3]。在金葡菌的眾多毒力因子中,葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin,SE)是導(dǎo)致食物中毒的關(guān)鍵因素。如不計(jì)類腸毒素,SE可分為多種血清型,除20世紀(jì)60年代確認(rèn)的5種(SEA-SEE)外,近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)6種,即SEG–SEI,SER–SET[4-6]。金葡菌腸毒素的檢測(cè)與分型對(duì)乳品質(zhì)量控制與安全預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將對(duì)大量乳品中的腸毒素進(jìn)行檢測(cè)分析,并首次應(yīng)用熒光定量PCR法對(duì)產(chǎn)腸毒素菌株進(jìn)行高通量快速血清分型,探索金葡菌腸毒素檢測(cè)與分型的新方法。

    1 材料及方法

    1.1 儀器與試劑

    自動(dòng)酶聯(lián)熒光分析儀(Mini-VIDAS),熒光定量PCR儀(ABI 7500 Fast),水浴搖床,高速離心機(jī)(Sigma3-18K)。

    VIDAS Staph enterotoxin II檢測(cè)試劑條,SYBR Premix EX Taq試劑盒,細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒,培養(yǎng)基;溶菌酶,引物;化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 乳品的檢測(cè)與菌株的收集

    將國(guó)家乳制品專項(xiàng)監(jiān)督抽查中的生奶、巴氏殺菌乳、酸奶、奶酪等乳品,應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》的方法,即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基增菌、選擇性培養(yǎng)、血漿凝固酶試驗(yàn)的流程,對(duì)其中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。分別統(tǒng)計(jì)每種乳品中金葡菌的污染比率,收集并凍存所得到的乳源性金黃色葡萄球菌。

    1.2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)

    將凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜,將培養(yǎng)液以5 000 r/min離心5 min以沉淀菌體,取上清液0.5 mL檢測(cè)其中的金葡菌腸毒素。在mini-VIDAS儀器上按照檢測(cè)腸毒素的程序進(jìn)行設(shè)定后,分別將培養(yǎng)上清液、陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液加入試劑條的加樣孔內(nèi),運(yùn)行熒光酶聯(lián)免疫分析程序,儀器即可自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的腸毒素。mini-VIDAS試劑條整合了可特異性結(jié)合SEA-SEE的多克隆抗體,其定性檢測(cè)結(jié)果以“陰性”或“陽(yáng)性”表示。

    1.2.3 乳源性金葡菌腸毒素的血清型分型

    根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的各腸毒素基因序列sea-see,seg-sei,ser-set,設(shè)計(jì)用于金黃色葡萄球菌這11中腸毒素基因檢測(cè)的SYBR GREEN熒光定量PCR引物,擴(kuò)增片段的大小介于73-195 bp之間。具體的引物序列見(jiàn)表1。將所有凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜后,使用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,并測(cè)定其OD260與OD280驗(yàn)證其濃度與純度。使用TE緩沖液將基因組DNA稀釋至1 g/L用于腸毒素的熒光定量PCR分型。按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書配制20 μL PCR反應(yīng)體系,包含SYBR Premix EX Taq 10.0 μL,濃度為10 μmol/L擴(kuò)增引物各0.4 μL,ROX染料0.4 μL,DNA模板2 μL,滅菌雙蒸水6.8 μL。應(yīng)用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀的SYBR GREEN模式進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:95℃(30 s)、40個(gè)循環(huán)的95℃(3 s)加60℃(25 s)。反應(yīng)結(jié)束后,設(shè)定一個(gè)溶解曲線記錄循環(huán)以考察引物的特異性。當(dāng)擴(kuò)增曲線的Ct值小于35時(shí)即判定相應(yīng)的腸毒素基因型陽(yáng)性,計(jì)算每種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)的比率。表1為用于檢測(cè)11種腸毒素血清型的引物序列及其擴(kuò)增片段。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

    使用SPSS11軟件提供的卡方檢驗(yàn)比較分析mini-VIDAS法和SYBR GREEN熒光定量PCR法檢測(cè)乳源性金葡菌腸毒素SEA-SEE在所有菌株中出現(xiàn)的頻率。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)與菌株收集

    使用國(guó)家乳品標(biāo)準(zhǔn)中以培養(yǎng)和生化鑒定為基礎(chǔ)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法,以血漿凝固酶陽(yáng)性為判定依據(jù),對(duì)多種乳制品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)分析。共檢測(cè)來(lái)自江蘇26家乳品企業(yè)的生奶228份、巴氏殺菌乳134份、酸奶104份、奶酪78份,金葡菌的檢出率分別為生奶18%(42份陽(yáng)性)、酸奶6%(6份陽(yáng)性)、奶酪5%(4份陽(yáng)性),巴氏殺菌乳金葡菌未檢出。從上述陽(yáng)性樣品中各分離一株金葡菌,共收集并保存52株乳源性金葡菌菌株。

    2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)

    使用mini-VIDAS法對(duì)上述所有乳源性金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)腸毒素情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在52株菌株中,有22株為腸毒素陽(yáng)性,占42%。即在所收集的乳源性金葡菌中,有近一半菌株可產(chǎn)SEA-SEE中的至少一種。

    2.3 乳源性金葡菌腸毒素的分型

    將收集的52株乳源性金葡菌菌株分別擴(kuò)增后,提取其基因組DNA,使用SYBR GREEN熒光定量PCR法對(duì)每一菌株基因組中的sea-see,seg–sei,ser–set基因進(jìn)行鑒定。除對(duì)照孔外,在同一塊96孔擴(kuò)增板上可同時(shí)進(jìn)行8個(gè)菌株的這11種腸毒素基因的檢測(cè),檢測(cè)在45 min內(nèi)完成,典型的擴(kuò)增曲線與溶解曲線如圖1所示。由圖1可以看出,無(wú)論針對(duì)何種腸毒素血清型,陽(yáng)性菌株均呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增反應(yīng),溶解曲線的Tm值在72~82℃之間,表明本研究設(shè)計(jì)的針對(duì)11種金葡菌腸毒素基因的檢測(cè)引物特異性良好。52株金葡菌菌株中,各腸毒素血清型的陽(yáng)性率如表2所示。由表2可以看出,除新近報(bào)道的ses和set外,其余9種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌菌株中均有分布。與以往大量文獻(xiàn)報(bào)道的食品種的金葡菌腸毒素以sea為主不同[2,3,7]。本研究收集的乳源性金葡菌中,傳統(tǒng)的5種腸毒素血清型sea-see以sed最為常見(jiàn),陽(yáng)性率顯著高于其他4種血清型;其他血清型中,seg和sei作為腸毒素基因簇(egc)的組成基因,其出現(xiàn)頻率顯著高于其他腸毒素血清型。

    表1 引物序列及其擴(kuò)增片段

    表2 乳源性金葡菌11種腸毒素基因分型結(jié)果

    圖1 11種腸毒素血清型的擴(kuò)增和溶解曲線

    2.4 兩種方法檢測(cè)金葡菌腸毒素的比較

    應(yīng)用mini-VIDAS法對(duì)乳源性金葡菌腸毒素SEASEE檢測(cè)的陽(yáng)性率為42%,而應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)金葡菌腸毒素基因sea-see的陽(yáng)性率為48%,均低于文獻(xiàn)報(bào)道的源自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株中腸毒素的陽(yáng)性率。經(jīng)逐一對(duì)比,有3株金葡菌為VIDAS檢測(cè)陰性,但熒光定量PCR法檢出其至少包含一種sea-see基因,表明金葡菌自身的腸毒素基因的表達(dá)水平需達(dá)到VIDAS檢測(cè)的閾值才能被之檢出,這與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的最新研究結(jié)論相符[7]。經(jīng)卡方檢驗(yàn),應(yīng)用mini-VIDAS與熒光定量PCR法對(duì)金葡菌腸毒素SEA-SEE或其基因的檢出率總體無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明2種方法具備相似的可信度。

    3 結(jié)論

    (1)各類乳制品中的金葡菌檢出率以生奶最高,酸奶和奶酪中也均有檢出。使用熒光酶聯(lián)免疫分析對(duì)52株乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)表明,近半數(shù)的菌株為產(chǎn)腸毒素菌株,低于來(lái)自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株腸毒素的陽(yáng)性率。

    (2)使用熒光定量PCR法對(duì)52株乳源性金葡菌基因組中目前已知的11種腸毒素基因進(jìn)行快速分型,結(jié)果表明大多數(shù)腸毒素基因型在乳源性金葡菌中均有分布。與來(lái)源于臨床病例的菌株不同的是,乳源性菌株中腸毒素以sed和腸毒素基因簇基因(seg和sei)為主。

    (3)盡管應(yīng)用熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法分析腸毒素基因在少數(shù)乳源性菌株中出現(xiàn)了基因檢測(cè)陽(yáng)性而未檢出毒素蛋白的情況,但統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明兩種方法對(duì)于腸毒素SEA-SEE或其基因的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。

    總之,本研究是對(duì)乳源性金葡菌關(guān)鍵致病因子腸毒素的檢測(cè)與分型的首次探索,發(fā)現(xiàn)了乳源性金葡菌金葡菌腸毒素基因型分布的新特征,并對(duì)腸毒素檢測(cè)的熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法評(píng)價(jià)。此外,本研究首次建立的熒光定量PCR法對(duì)金葡菌腸毒素快速分型方法,相比于以往文獻(xiàn)報(bào)道采用的定性PCR與電泳檢測(cè)的方法,將分型速度與檢測(cè)通量提高了4-10倍,安全性也具有顯著優(yōu)勢(shì),將為乳品安全控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供新的技術(shù)支持。

    [1] ARVIDSON S,TEGMARK K.Regulation of Virulence Determinants in Staphylococcus aureus[J].Int.J.Med.Microbiol,2001,291(2):159-70.

    [2] 徐勤,巢國(guó)祥.生牛奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(8):972-973.

    [3] 巢國(guó)祥,焦新安,周麗萍,等.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特性及耐藥性研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(8):904-907.

    [4] MARRACK P,KAPPLER J.The Staphylococcal Enterotoxins and Their Relatives[J].Science,1990,248(1):705-711.

    [5] OMOE K,IMANISHI K,HU D L,et al.Characterization of Novel Staphylococcal Enterotoxin-Like Toxin Type P[J].Infect Immun,2005,73(1):5540-5546.

    [6] ONO H K,OMOE K,IMANISHI K,et al.Identification and Characterization of Two Novel Staphylococcal enterotoxins Types S and T[J].Infect Immun,2008,76(2):4999-5005.

    [7] PEREIRA V,LOPES C,CASTRO A,et al.Characterization for Enterotoxin Production,Virulence Factors,and Antibiotic Susceptibility of Staphylococcus aureus Isolates from Various Foods in Portugal[J].Food Microbiol,2009,26(1):278-282.

    Detection and serological type identification of enterotoxins in dairy-derived Staphylococcus aureus

    YANG Jun,ZHANG Chi
    (Nanjing Insititute of Supervision&Testing on Product Quality,Nanjing 210028,China)

    In the present study,we collected dairy-derived S.aureus strains in the inspection of various dairy products,and then examined the enterotoxin production of the isolates using enzyme-linked fluorescent assay(mini-VIDAS).Further,Real-time PCR analysis was performed to identify 11 of enterotoxin serological types in these strains.The frequency of enterotoxin-positive isolates presented unique characteristics,as well as the distribution of enterotoxin serological types.In addition,there was no significant difference between the test results of enterotoxin in dairy-derivedS.aureususing VIDAS assay and Real-time PCR.

    dairy-derivedStaphylococcus aureus;enterotoxin;enzyme-linked fluorescent assay;Real-time PCR;serological type identification

    Q939.9,TS252.7

    A

    1001-2230(2011)03-0014-03

    2010-12-15

    楊軍(1971-),男,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)。

    猜你喜歡
    腸毒素葡菌乳源
    產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病商用疫苗的研究進(jìn)展
    東方紅
    寶藏(2020年2期)2020-10-15 02:22:42
    漁舟唱晚
    寶藏(2019年5期)2019-06-21 01:23:22
    侗族情
    寶藏(2019年2期)2019-03-20 05:20:46
    某市致病性弧菌及腸毒素的檢測(cè)分析
    血流感染和皮膚軟組織感染金黃色葡萄球菌耐藥特征及多位點(diǎn)序列分型
    君臨天下
    寶藏(2018年7期)2018-07-25 08:08:54
    金黃色葡萄球菌腸毒素研究進(jìn)展
    重組輪狀病毒腸毒素NSP4肽段aa112-175的免疫佐劑活性研究
    中國(guó)北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進(jìn)展
    99热这里只有是精品在线观看| 大香蕉久久网| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一进一出抽搐动态| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲国产精品合色在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 少妇丰满av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一本久久中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 黑人高潮一二区| 久久久久久国产a免费观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 激情 狠狠 欧美| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久伊人网av| 99热只有精品国产| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产清高在天天线| 国产私拍福利视频在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 久久精品影院6| 九色成人免费人妻av| 91久久精品国产一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 少妇的逼好多水| 国产男人的电影天堂91| 国内精品宾馆在线| 中文字幕久久专区| 国产成人精品久久久久久| 久久久成人免费电影| 狠狠狠狠99中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 91在线观看av| 久久欧美精品欧美久久欧美| 舔av片在线| 亚洲人与动物交配视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 国产一区亚洲一区在线观看| 乱系列少妇在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 22中文网久久字幕| 舔av片在线| 久久人人爽人人片av| a级一级毛片免费在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产私拍福利视频在线观看| 午夜精品在线福利| 国产成人a区在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜激情欧美在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品无大码| av在线天堂中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| 日韩一区二区视频免费看| 国产免费一级a男人的天堂| 黑人高潮一二区| 亚洲最大成人手机在线| 国产视频内射| 亚洲图色成人| 国产在线男女| 国产乱人视频| 一级毛片久久久久久久久女| 国产91av在线免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 在线观看一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 国产亚洲精品久久久com| 乱系列少妇在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| av黄色大香蕉| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 悠悠久久av| 色噜噜av男人的天堂激情| 天堂√8在线中文| 久久久久久大精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲四区av| 国产单亲对白刺激| 亚洲在线自拍视频| 国产在线男女| 欧美最新免费一区二区三区| 日本五十路高清| 日日撸夜夜添| 欧美性猛交黑人性爽| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99久国产av精品国产电影| 女人被狂操c到高潮| 天堂影院成人在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 看免费成人av毛片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品一区av在线观看| 99热网站在线观看| 久久6这里有精品| 99热全是精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| av天堂中文字幕网| 午夜a级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲美女搞黄在线观看 | 黄片wwwwww| 日韩强制内射视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文字幕久久专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | АⅤ资源中文在线天堂| 俺也久久电影网| 又爽又黄无遮挡网站| 少妇的逼水好多| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一a级毛片在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜精品在线福利| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇的逼好多水| 毛片一级片免费看久久久久| 能在线免费观看的黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久久大av| 久久久久久大精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| .国产精品久久| 亚洲精品色激情综合| 成人性生交大片免费视频hd| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久国产成人免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久这里只有精品中国| 麻豆成人午夜福利视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 午夜老司机福利剧场| 久久人妻av系列| 我的老师免费观看完整版| 久久久久久大精品| 中文字幕免费在线视频6| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产亚洲精品av在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 六月丁香七月| 亚洲人成网站高清观看| 九九在线视频观看精品| 久久久久久国产a免费观看| 日本欧美国产在线视频| 国产成人a区在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 六月丁香七月| 尾随美女入室| 黑人高潮一二区| 国产日本99.免费观看| 国产精品国产高清国产av| 国产精品人妻久久久影院| 一级黄片播放器| 99久久九九国产精品国产免费| 久久中文看片网| 能在线免费观看的黄片| 日本成人三级电影网站| 亚洲熟妇熟女久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产三级中文精品| 成人无遮挡网站| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费av观看视频| avwww免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 看免费成人av毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费看日本二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产私拍福利视频在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩大尺度精品在线看网址| 久久国产乱子免费精品| 最近在线观看免费完整版| 国产午夜精品论理片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日本爱情动作片www.在线观看 | 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲人成网站高清观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产精品伦人一区二区| 黑人高潮一二区| av国产免费在线观看| 变态另类丝袜制服| 国产一区亚洲一区在线观看| 黄片wwwwww| 国产高潮美女av| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美中文日本在线观看视频| 午夜激情欧美在线| 六月丁香七月| 我要看日韩黄色一级片| av天堂中文字幕网| 黄色配什么色好看| a级一级毛片免费在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费搜索国产男女视频| 亚洲av熟女| 亚洲av中文av极速乱| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 此物有八面人人有两片| 又黄又爽又免费观看的视频| 99热6这里只有精品| 韩国av在线不卡| 综合色丁香网| 国产探花在线观看一区二区| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久九九精品影院| 美女免费视频网站| 欧美日本视频| 中文在线观看免费www的网站| 久久久久久久久大av| 欧美激情国产日韩精品一区| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产 一区精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产美女午夜福利| а√天堂www在线а√下载| 97碰自拍视频| 永久网站在线| 丝袜喷水一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 不卡一级毛片| 国产69精品久久久久777片| 丰满乱子伦码专区| 在线观看66精品国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 看免费成人av毛片| 亚洲国产精品合色在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av熟女| 激情 狠狠 欧美| 亚洲av.av天堂| 久久人人精品亚洲av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产乱人视频| 级片在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 永久网站在线| 身体一侧抽搐| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 男女之事视频高清在线观看| 嫩草影院新地址| 97超视频在线观看视频| 色在线成人网| 久久精品影院6| www日本黄色视频网| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 少妇高潮的动态图| 国产精品野战在线观看| 嫩草影院入口| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产一区二区三区av在线 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲av免费在线观看| 97在线视频观看| 国产精品人妻久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 国产一区二区激情短视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 99在线人妻在线中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 老司机午夜福利在线观看视频| 美女内射精品一级片tv| 淫秽高清视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久成人免费电影| 亚洲自偷自拍三级| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久国产乱子免费精品| 一区二区三区高清视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 成年av动漫网址| 亚洲不卡免费看| 综合色丁香网| 丰满乱子伦码专区| 一区二区三区高清视频在线| 九九在线视频观看精品| 1024手机看黄色片| 一区二区三区四区激情视频 | 小说图片视频综合网站| 国内精品美女久久久久久| 久久久午夜欧美精品| 少妇的逼水好多| 亚洲最大成人中文| 久久久午夜欧美精品| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲人与动物交配视频| 中文字幕av在线有码专区| 在线播放国产精品三级| 九九在线视频观看精品| 黄片wwwwww| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人av在线播放网站| 免费观看精品视频网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲av免费在线观看| 国产乱人偷精品视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩强制内射视频| 最近在线观看免费完整版| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲人与动物交配视频| 特大巨黑吊av在线直播| 一个人看的www免费观看视频| 插逼视频在线观看| 国产精品一区二区性色av| 淫秽高清视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线a可以看的网站| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产乱人视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久久国产a免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 真人做人爱边吃奶动态| 看非洲黑人一级黄片| a级毛片a级免费在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色综合色国产| 亚洲成人久久性| 日本与韩国留学比较| 日韩av不卡免费在线播放| 看免费成人av毛片| 色在线成人网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲七黄色美女视频| 禁无遮挡网站| av黄色大香蕉| 免费看av在线观看网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费人成在线观看视频色| 国产精品国产高清国产av| 久久精品91蜜桃| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在现免费观看毛片| 成人性生交大片免费视频hd| 别揉我奶头 嗯啊视频| 中文亚洲av片在线观看爽| or卡值多少钱| 国产精品三级大全| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜爱爱视频在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产日本99.免费观看| 日韩国内少妇激情av| 免费av毛片视频| 观看免费一级毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 午夜福利高清视频| 91久久精品电影网| 天堂动漫精品| 久久人人爽人人片av| 国产av一区在线观看免费| 国产精品亚洲一级av第二区| АⅤ资源中文在线天堂| 有码 亚洲区| 一级毛片我不卡| 最近2019中文字幕mv第一页| 联通29元200g的流量卡| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产黄片美女视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 97碰自拍视频| 1000部很黄的大片| 草草在线视频免费看| 我的女老师完整版在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久韩国三级中文字幕| 在线看三级毛片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色配什么色好看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜福利在线观看吧| 免费av毛片视频| 精品久久久久久久末码| 毛片女人毛片| 啦啦啦啦在线视频资源| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费看光身美女| 婷婷六月久久综合丁香| 成人漫画全彩无遮挡| 99久久精品国产国产毛片| 大香蕉久久网| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| av福利片在线观看| 不卡一级毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲va在线va天堂va国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲国产精品合色在线| av天堂在线播放| 天堂√8在线中文| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 特大巨黑吊av在线直播| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲美女黄片视频| 我要搜黄色片| 亚洲国产色片| 国产探花极品一区二区| 午夜影院日韩av| av福利片在线观看| 亚洲内射少妇av| 在线观看一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 精品久久久久久久久久免费视频| 此物有八面人人有两片| а√天堂www在线а√下载| 欧美xxxx性猛交bbbb| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人国产麻豆网| 国产精品精品国产色婷婷| 在线观看三级黄色| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一个人免费看片子| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产91av在线免费观看| 国产成人精品一,二区| 国产成人精品无人区| 国产精品三级大全| 日本黄色片子视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产精品三级大全| 欧美成人精品欧美一级黄| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲天堂av无毛| 99久国产av精品国产电影| 欧美+日韩+精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产一区二区三区综合在线观看 | 97超视频在线观看视频| 性色av一级| 日本黄色片子视频| 免费看光身美女| 国产伦精品一区二区三区视频9| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 街头女战士在线观看网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 久久久久久久久久成人| 国产综合精华液| 在线观看免费视频网站a站| 免费高清在线观看视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 赤兔流量卡办理| 国产精品人妻久久久影院| 一区二区三区免费毛片| 欧美高清成人免费视频www| 精品久久久久久电影网| 久久久久精品性色| 亚洲av日韩在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 女人久久www免费人成看片| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美性感艳星| 久热久热在线精品观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 嫩草影院新地址| 中国国产av一级| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美97在线视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久国内精品自在自线图片| 国产一区有黄有色的免费视频| 涩涩av久久男人的天堂| 黄片无遮挡物在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲不卡免费看| 日本与韩国留学比较| 在线观看国产h片| 成人美女网站在线观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 熟女电影av网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产亚洲最大av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费观看的影片在线观看| 国产精品久久久久成人av| 岛国毛片在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产成人精品一,二区| 国产免费福利视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 乱人伦中国视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热99国产精品久久久久久7| 精品一区二区三区视频在线| 天堂中文最新版在线下载| 欧美性感艳星| 国产亚洲精品久久久com| 一级,二级,三级黄色视频| 免费观看的影片在线观看| 国产成人精品无人区| 22中文网久久字幕| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美日本中文国产一区发布| 一区二区三区乱码不卡18| 大香蕉久久网| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 全区人妻精品视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 成人国产av品久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美 日韩 精品 国产| 成人美女网站在线观看视频| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲av.av天堂| 国产一区二区在线观看日韩| 免费观看的影片在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品第二区| 99久久精品一区二区三区| 国产永久视频网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 男的添女的下面高潮视频| 青青草视频在线视频观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品熟女久久久久浪| 尾随美女入室| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一区二区三区乱码不卡18| a级毛色黄片| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲国产av新网站| 日韩电影二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产美女午夜福利| 观看av在线不卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 尾随美女入室|