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    乳源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)與基因分型

    2011-10-19 03:20:56楊軍張馳
    中國(guó)乳品工業(yè) 2011年3期
    關(guān)鍵詞:腸毒素葡菌乳源

    楊軍,張馳

    (南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,南京210028)

    乳源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)與基因分型

    楊軍,張馳

    (南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,南京210028)

    通過(guò)檢驗(yàn)各類乳制品收集了大量乳源性金葡菌菌株,應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法對(duì)菌株的腸毒素進(jìn)行檢測(cè)分析,并進(jìn)一步使用熒光定量PCR法對(duì)腸毒素基因進(jìn)行分型。結(jié)果表明,乳源性金葡菌腸毒素的檢出率與基因型分布均呈現(xiàn)一定顯著特征,應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法與熒光定量PCR法對(duì)腸毒素的檢測(cè)結(jié)果總體無(wú)顯著性差異。

    乳源性金黃色葡萄球菌;腸毒素;酶聯(lián)熒光免疫;熒光定量PCR;基因分型

    0 引言

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡(jiǎn)稱金葡菌)是導(dǎo)致人類食物中毒與化膿性感染的最主要病原體之一[1]。乳及乳制品是金葡菌主要食品宿主,我國(guó)生奶中金葡菌的污染率一般在15%~30%之間,奶酪、酸奶等乳制品中金葡菌的檢出率也一直居高不下[2,3]。在金葡菌的眾多毒力因子中,葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin,SE)是導(dǎo)致食物中毒的關(guān)鍵因素。如不計(jì)類腸毒素,SE可分為多種血清型,除20世紀(jì)60年代確認(rèn)的5種(SEA-SEE)外,近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)6種,即SEG–SEI,SER–SET[4-6]。金葡菌腸毒素的檢測(cè)與分型對(duì)乳品質(zhì)量控制與安全預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將對(duì)大量乳品中的腸毒素進(jìn)行檢測(cè)分析,并首次應(yīng)用熒光定量PCR法對(duì)產(chǎn)腸毒素菌株進(jìn)行高通量快速血清分型,探索金葡菌腸毒素檢測(cè)與分型的新方法。

    1 材料及方法

    1.1 儀器與試劑

    自動(dòng)酶聯(lián)熒光分析儀(Mini-VIDAS),熒光定量PCR儀(ABI 7500 Fast),水浴搖床,高速離心機(jī)(Sigma3-18K)。

    VIDAS Staph enterotoxin II檢測(cè)試劑條,SYBR Premix EX Taq試劑盒,細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒,培養(yǎng)基;溶菌酶,引物;化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 乳品的檢測(cè)與菌株的收集

    將國(guó)家乳制品專項(xiàng)監(jiān)督抽查中的生奶、巴氏殺菌乳、酸奶、奶酪等乳品,應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》的方法,即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基增菌、選擇性培養(yǎng)、血漿凝固酶試驗(yàn)的流程,對(duì)其中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。分別統(tǒng)計(jì)每種乳品中金葡菌的污染比率,收集并凍存所得到的乳源性金黃色葡萄球菌。

    1.2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)

    將凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜,將培養(yǎng)液以5 000 r/min離心5 min以沉淀菌體,取上清液0.5 mL檢測(cè)其中的金葡菌腸毒素。在mini-VIDAS儀器上按照檢測(cè)腸毒素的程序進(jìn)行設(shè)定后,分別將培養(yǎng)上清液、陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液加入試劑條的加樣孔內(nèi),運(yùn)行熒光酶聯(lián)免疫分析程序,儀器即可自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的腸毒素。mini-VIDAS試劑條整合了可特異性結(jié)合SEA-SEE的多克隆抗體,其定性檢測(cè)結(jié)果以“陰性”或“陽(yáng)性”表示。

    1.2.3 乳源性金葡菌腸毒素的血清型分型

    根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的各腸毒素基因序列sea-see,seg-sei,ser-set,設(shè)計(jì)用于金黃色葡萄球菌這11中腸毒素基因檢測(cè)的SYBR GREEN熒光定量PCR引物,擴(kuò)增片段的大小介于73-195 bp之間。具體的引物序列見(jiàn)表1。將所有凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜后,使用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,并測(cè)定其OD260與OD280驗(yàn)證其濃度與純度。使用TE緩沖液將基因組DNA稀釋至1 g/L用于腸毒素的熒光定量PCR分型。按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書配制20 μL PCR反應(yīng)體系,包含SYBR Premix EX Taq 10.0 μL,濃度為10 μmol/L擴(kuò)增引物各0.4 μL,ROX染料0.4 μL,DNA模板2 μL,滅菌雙蒸水6.8 μL。應(yīng)用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀的SYBR GREEN模式進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:95℃(30 s)、40個(gè)循環(huán)的95℃(3 s)加60℃(25 s)。反應(yīng)結(jié)束后,設(shè)定一個(gè)溶解曲線記錄循環(huán)以考察引物的特異性。當(dāng)擴(kuò)增曲線的Ct值小于35時(shí)即判定相應(yīng)的腸毒素基因型陽(yáng)性,計(jì)算每種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)的比率。表1為用于檢測(cè)11種腸毒素血清型的引物序列及其擴(kuò)增片段。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

    使用SPSS11軟件提供的卡方檢驗(yàn)比較分析mini-VIDAS法和SYBR GREEN熒光定量PCR法檢測(cè)乳源性金葡菌腸毒素SEA-SEE在所有菌株中出現(xiàn)的頻率。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)與菌株收集

    使用國(guó)家乳品標(biāo)準(zhǔn)中以培養(yǎng)和生化鑒定為基礎(chǔ)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法,以血漿凝固酶陽(yáng)性為判定依據(jù),對(duì)多種乳制品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)分析。共檢測(cè)來(lái)自江蘇26家乳品企業(yè)的生奶228份、巴氏殺菌乳134份、酸奶104份、奶酪78份,金葡菌的檢出率分別為生奶18%(42份陽(yáng)性)、酸奶6%(6份陽(yáng)性)、奶酪5%(4份陽(yáng)性),巴氏殺菌乳金葡菌未檢出。從上述陽(yáng)性樣品中各分離一株金葡菌,共收集并保存52株乳源性金葡菌菌株。

    2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)

    使用mini-VIDAS法對(duì)上述所有乳源性金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)腸毒素情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在52株菌株中,有22株為腸毒素陽(yáng)性,占42%。即在所收集的乳源性金葡菌中,有近一半菌株可產(chǎn)SEA-SEE中的至少一種。

    2.3 乳源性金葡菌腸毒素的分型

    將收集的52株乳源性金葡菌菌株分別擴(kuò)增后,提取其基因組DNA,使用SYBR GREEN熒光定量PCR法對(duì)每一菌株基因組中的sea-see,seg–sei,ser–set基因進(jìn)行鑒定。除對(duì)照孔外,在同一塊96孔擴(kuò)增板上可同時(shí)進(jìn)行8個(gè)菌株的這11種腸毒素基因的檢測(cè),檢測(cè)在45 min內(nèi)完成,典型的擴(kuò)增曲線與溶解曲線如圖1所示。由圖1可以看出,無(wú)論針對(duì)何種腸毒素血清型,陽(yáng)性菌株均呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增反應(yīng),溶解曲線的Tm值在72~82℃之間,表明本研究設(shè)計(jì)的針對(duì)11種金葡菌腸毒素基因的檢測(cè)引物特異性良好。52株金葡菌菌株中,各腸毒素血清型的陽(yáng)性率如表2所示。由表2可以看出,除新近報(bào)道的ses和set外,其余9種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌菌株中均有分布。與以往大量文獻(xiàn)報(bào)道的食品種的金葡菌腸毒素以sea為主不同[2,3,7]。本研究收集的乳源性金葡菌中,傳統(tǒng)的5種腸毒素血清型sea-see以sed最為常見(jiàn),陽(yáng)性率顯著高于其他4種血清型;其他血清型中,seg和sei作為腸毒素基因簇(egc)的組成基因,其出現(xiàn)頻率顯著高于其他腸毒素血清型。

    表1 引物序列及其擴(kuò)增片段

    表2 乳源性金葡菌11種腸毒素基因分型結(jié)果

    圖1 11種腸毒素血清型的擴(kuò)增和溶解曲線

    2.4 兩種方法檢測(cè)金葡菌腸毒素的比較

    應(yīng)用mini-VIDAS法對(duì)乳源性金葡菌腸毒素SEASEE檢測(cè)的陽(yáng)性率為42%,而應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)金葡菌腸毒素基因sea-see的陽(yáng)性率為48%,均低于文獻(xiàn)報(bào)道的源自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株中腸毒素的陽(yáng)性率。經(jīng)逐一對(duì)比,有3株金葡菌為VIDAS檢測(cè)陰性,但熒光定量PCR法檢出其至少包含一種sea-see基因,表明金葡菌自身的腸毒素基因的表達(dá)水平需達(dá)到VIDAS檢測(cè)的閾值才能被之檢出,這與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的最新研究結(jié)論相符[7]。經(jīng)卡方檢驗(yàn),應(yīng)用mini-VIDAS與熒光定量PCR法對(duì)金葡菌腸毒素SEA-SEE或其基因的檢出率總體無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明2種方法具備相似的可信度。

    3 結(jié)論

    (1)各類乳制品中的金葡菌檢出率以生奶最高,酸奶和奶酪中也均有檢出。使用熒光酶聯(lián)免疫分析對(duì)52株乳源性金葡菌腸毒素的檢測(cè)表明,近半數(shù)的菌株為產(chǎn)腸毒素菌株,低于來(lái)自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株腸毒素的陽(yáng)性率。

    (2)使用熒光定量PCR法對(duì)52株乳源性金葡菌基因組中目前已知的11種腸毒素基因進(jìn)行快速分型,結(jié)果表明大多數(shù)腸毒素基因型在乳源性金葡菌中均有分布。與來(lái)源于臨床病例的菌株不同的是,乳源性菌株中腸毒素以sed和腸毒素基因簇基因(seg和sei)為主。

    (3)盡管應(yīng)用熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法分析腸毒素基因在少數(shù)乳源性菌株中出現(xiàn)了基因檢測(cè)陽(yáng)性而未檢出毒素蛋白的情況,但統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明兩種方法對(duì)于腸毒素SEA-SEE或其基因的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。

    總之,本研究是對(duì)乳源性金葡菌關(guān)鍵致病因子腸毒素的檢測(cè)與分型的首次探索,發(fā)現(xiàn)了乳源性金葡菌金葡菌腸毒素基因型分布的新特征,并對(duì)腸毒素檢測(cè)的熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法評(píng)價(jià)。此外,本研究首次建立的熒光定量PCR法對(duì)金葡菌腸毒素快速分型方法,相比于以往文獻(xiàn)報(bào)道采用的定性PCR與電泳檢測(cè)的方法,將分型速度與檢測(cè)通量提高了4-10倍,安全性也具有顯著優(yōu)勢(shì),將為乳品安全控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供新的技術(shù)支持。

    [1] ARVIDSON S,TEGMARK K.Regulation of Virulence Determinants in Staphylococcus aureus[J].Int.J.Med.Microbiol,2001,291(2):159-70.

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    [3] 巢國(guó)祥,焦新安,周麗萍,等.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特性及耐藥性研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(8):904-907.

    [4] MARRACK P,KAPPLER J.The Staphylococcal Enterotoxins and Their Relatives[J].Science,1990,248(1):705-711.

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    [7] PEREIRA V,LOPES C,CASTRO A,et al.Characterization for Enterotoxin Production,Virulence Factors,and Antibiotic Susceptibility of Staphylococcus aureus Isolates from Various Foods in Portugal[J].Food Microbiol,2009,26(1):278-282.

    Detection and serological type identification of enterotoxins in dairy-derived Staphylococcus aureus

    YANG Jun,ZHANG Chi
    (Nanjing Insititute of Supervision&Testing on Product Quality,Nanjing 210028,China)

    In the present study,we collected dairy-derived S.aureus strains in the inspection of various dairy products,and then examined the enterotoxin production of the isolates using enzyme-linked fluorescent assay(mini-VIDAS).Further,Real-time PCR analysis was performed to identify 11 of enterotoxin serological types in these strains.The frequency of enterotoxin-positive isolates presented unique characteristics,as well as the distribution of enterotoxin serological types.In addition,there was no significant difference between the test results of enterotoxin in dairy-derivedS.aureususing VIDAS assay and Real-time PCR.

    dairy-derivedStaphylococcus aureus;enterotoxin;enzyme-linked fluorescent assay;Real-time PCR;serological type identification

    Q939.9,TS252.7

    A

    1001-2230(2011)03-0014-03

    2010-12-15

    楊軍(1971-),男,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)。

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