• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

    2011-10-18 04:17:12李海波
    食品科學(xué) 2011年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)抑制率黃酮

    劉 濤,馬 龍,*,趙 軍,李海波

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

    瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

    劉 濤1,馬 龍1,*,趙 軍2,李海波3

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

    目的:考察瑣瑣葡萄總黃酮體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果。方法:用HBV DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞所得的HepG 2.2.15細(xì)胞株為模型,ELISA法測(cè)定用藥后8d細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量,計(jì)算瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的抑制率,熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA的變化,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果:瑣瑣葡萄總黃酮在12.5~100μg/mL范圍內(nèi),均能不同程度地減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量,且細(xì)胞毒性小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL,對(duì)HBsAg半數(shù)有效劑量(IC50)為327.56μg/mL、對(duì)HBeAg為215.34μg/mL,對(duì)HBsAg治療指數(shù)(TI)為0.87、對(duì)HBeAg治療指數(shù)為1.32;總黃酮質(zhì)量濃度100μg/mL時(shí)對(duì)HBV DNA的抑制率為47.63%。結(jié)論:瑣瑣葡萄總黃酮具有一定的體外抗HBV作用。

    瑣瑣葡萄;總黃酮;乙型肝炎病毒;細(xì)胞培養(yǎng)

    乙型肝炎病毒(HBV)感染不僅會(huì)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生,而且與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)天然藥物的抗病毒研究日益重視,抗乙肝病毒藥物研究雖然取得了一些進(jìn)展,但目前仍缺乏比較理想的治療藥物[1]。因此,從豐富的中草藥植物資源中尋找新的有效抗HBV藥物,已成為我國(guó)抗病毒中藥發(fā)展的必然趨勢(shì)。1987年,美國(guó)Sells等[2]將帶有HBV DNA全基因組及抗G418的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Hep G建立了2.2.15細(xì)胞株,它能長(zhǎng)期穩(wěn)定地向細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane’s顆粒,是目前體外篩選和評(píng)價(jià)抗乙肝病毒藥物較理想的細(xì)胞模型[3]。黃酮是維吾爾藥瑣瑣葡萄(Vitis vinifer L.)的主要組成成分之一[4],具有調(diào)節(jié)免疫[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗輻射[9]等多種生物活性。課題組前期研究顯示瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)免疫性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[10],且對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用[11]。為探討瑣瑣葡萄總黃酮的抗HBV效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)以Hep G 2.2.15細(xì)胞株為模型,研究瑣瑣葡萄總黃酮在體外抗HBV的生物活性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HepG 2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)物種保藏中心,傳代于高糖DMEM培養(yǎng)基(每1000mL含100萬(wàn)單位青霉素、1.0g鏈霉素、100mg G418和10%滅活胎牛血清)中培養(yǎng)。

    DMEM培養(yǎng)基、G418(Geneticin)、青霉素-鏈霉素美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物制品公司;HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒 上海華美生物工程公司;HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒 上海申友生物技術(shù)有限公司;噻唑藍(lán)(MTT) 美國(guó)Amresco公司;二甲基亞砜(DMSO)、0.025%胰蛋白酶-EDTA美國(guó)Sigma公司;拉米夫定(3-TC,批號(hào)06120028) 葛蘭素史克制藥蘇州有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Napco公司;XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司;生物安全柜 美國(guó)Labconco公司;XD 711型酶標(biāo)儀 上海迅達(dá)醫(yī)療器械有限公司;Thermo IEC冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)熱電公司;Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)MJ Research公司;AB104-N型分析天平 Mettler-Toledo上海有限公司。

    1.3 瑣瑣葡萄總黃酮的制備

    瑣瑣葡萄藥材粉碎后以去離子水回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至一定量,加入5倍體積95%乙醇,充分混勻,靜置12h,過(guò)濾得濾液A。藥渣以8倍量95%乙醇回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至浸膏,浸膏以水混懸后,石油醚萃取脫脂,再經(jīng)乙酸乙酯萃取,其中乙酸乙酯部分減壓濃縮后,以95%乙醇溶解,放置12h,析出沉淀,過(guò)濾得濾液B;濾液A、濾液B及乙酸乙酯萃取后液體合并,減壓濃縮,上AB-8 型大孔吸附樹脂,依次以水、50%和95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,收集50%乙醇洗脫餾分,減壓濃縮,真空干燥,即得瑣瑣葡萄總黃酮。按參考文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定其總黃酮含量為35.28%。

    1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,分別加入含不同質(zhì)量濃度樣品培養(yǎng)基培養(yǎng),第4天換含同樣樣品的培養(yǎng)基,8d后加入5mg/mL的MTT溶液,每孔10μL,37℃孵育4h后,加入DMSO,每孔150μL,混勻,使甲臢完全溶解,用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A給藥組)。以相同條件、相同體積不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照,測(cè)定其吸光度(A細(xì)胞對(duì)照組),按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率,求出半數(shù)中毒劑量(TC50)。空白組為測(cè)定時(shí)平行操作的空白對(duì)照組,測(cè)定吸光度(A空白組)。

    1.5 藥物活性實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組、不同質(zhì)量濃度藥物組及陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。HepG 2.2.15細(xì)胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,各質(zhì)量濃度藥物組分別加入含瑣瑣葡萄總黃酮(100、50、25、12.5μg/mL)的培養(yǎng)基、各質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照組分別加入含3-TC(100、10、1μg/mL)的培養(yǎng)基,每孔200μL,每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)每板各設(shè)6個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔加入同體積無(wú)藥物培養(yǎng)基作為細(xì)胞對(duì)照組,置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每4d換含同樣樣品的培養(yǎng)基,第8天分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,置-20℃保存?zhèn)溆?,待測(cè)HBsAg、HBeAg和HBV DNA。

    1.6 HBsAg和HBeAg的檢測(cè)

    采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的濃度,以P/N(即樣品的吸光度與空白對(duì)照吸光度的比值)表示。根據(jù)公式(2)計(jì)算各濃度藥物對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率,計(jì)算半數(shù)有效濃度IC50。

    式中:A給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的吸光度;A空白組為試劑盒測(cè)定時(shí)不加酶結(jié)合底物而平行操作的空白對(duì)照組;A細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組。

    結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所得TC50計(jì)算各樣品的治療指數(shù)(TI),綜合判斷藥物效果。TI= TC50/IC50,TI>2為有效低毒;1<TI≤2為低效有毒;TI≤1為受試物毒性大,不宜于用于抗HBV治療。

    1.7 HBV DNA的測(cè)定

    按照HBV DNA熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書操作,測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)公式(3)計(jì)算各受試物對(duì)HBV DNA的抑制率。

    式中:C給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的HBV DNA拷貝數(shù);C細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組的HBV DNA拷貝數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用

    MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率,結(jié)果顯示瑣瑣葡萄總黃酮及3-TC對(duì)Hep G 2.2.15細(xì)胞的毒性較小,其TC50分別為284.91μg/mL 和244.77μg/mL(表1、2)。

    表1 瑣瑣葡萄總黃酮體外抗HBV效果Table 1 Inhibition effects of total flavones from Vitis vinifer L. on HBV in vitro

    表2 瑣瑣葡萄總黃酮的治療指數(shù)Table 2 Therapeutic indexes of total flavones from Vitis vinifer L. for HBsAg and HbeAg

    2.2 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的影響

    在瑣瑣葡萄總黃酮和3-TC對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的IC50分別為327.56μg/mL和315.37μg/mL,其TI為0.87和0.78;對(duì)HBeAg的IC50分別為215.34μg/mL和9051.01μg/mL,其TI分別為1.32和0.03,提示在此實(shí)驗(yàn)條件下,瑣瑣葡萄總黃酮抑制HepG 2.2.15分泌HBsAg和HBeAg的效果均優(yōu)于3-TC(表1、2)。

    2.3 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA的影響

    瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng),而3-TC可顯著抑制HBV DNA的分泌,各質(zhì)量濃度組DNA拷貝數(shù)<103,超出試劑盒檢測(cè)下限(表1)。

    3 討 論

    瑣瑣葡萄為葡萄科小無(wú)核紅葡萄品系藥食兼用植物,藥用果實(shí),主產(chǎn)于我國(guó)新疆吐魯番、和田、鄯善等地[13];在維吾爾醫(yī)臨床主要應(yīng)用于脾胃不和、頭暈腰酸、神志不安以及小兒麻疹和肝炎等病癥的治療[14-15],為探討瑣瑣葡萄的抗病毒藥效,本研究應(yīng)用Hep G 2.2.15細(xì)胞株對(duì)瑣瑣葡萄總黃酮進(jìn)行了抗HBV活性篩選,結(jié)果顯示:瑣瑣葡萄總黃酮用藥8d后,對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg具有顯著抑制作用,半數(shù)有效劑量(IC50)HBsAg為327.56μg/mL、HBeAg為215.34μg/mL,治療指數(shù)(TI)分別為HBsAg 0.87、HBeAg 1.32,抑制效果均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米呋啶,且藥物細(xì)胞毒性較小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL;而瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA也表現(xiàn)出一定的抑制作用,在100μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到47.63%。細(xì)胞培養(yǎng)具有易于控制實(shí)驗(yàn)條件和均衡性好的特點(diǎn),但體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不能反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)及代謝對(duì)藥物效果的影響。因此,本研究結(jié)果雖然顯示瑣瑣葡萄總黃酮在體外具有一定的抗HBV生物學(xué)活性,與維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用效果相一致,但進(jìn)一步證實(shí)其抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定,其作用機(jī)制也有待于深入研究。

    [1] 王靈臺(tái). 中西醫(yī)治療慢性乙型肝炎的問(wèn)題和對(duì)策[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 29(7): 583-584.

    [2] SELLS M A, CHEN M L, ACS G, et al. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(4): 1005-l009.

    [3] 成軍, 斯崇文. HBV DNA轉(zhuǎn)然細(xì)胞系的建立及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 流行病與傳染病分冊(cè), 1994, 21(2): 60-64.

    [4] 馬龍, 劉濤, 向陽(yáng), 等. 新疆葡萄中3種生物活性物質(zhì)的含量分析[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(1): 28-31.

    [5] 汪敏, 王維民, 諶素華. 芒果皮黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(8): 23-25.

    [6] 王海敏, 虞海霞, 董蕊, 等. 苕子蜜總酚酸和總黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 54-57.

    [7] 王嵐, 康琛, 楊偉鵬, 等. 藤梨根正丁醇提取物和總黃酮苷抗腫瘤作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(16): 2184-2186.

    [8] 何忠梅, 白冰, 王慧, 等. 千里光總黃酮體外抗腫瘤和抗病毒活性研究[J]. 中成藥, 2010, 32(12): 2045-2047.

    [9] 雷筱芬, 陳木森. 黃酮類化合物抗輻射研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 29(6): 1039-1042.

    [10] 劉濤, 馬龍, 趙軍, 等. 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)小鼠免疫性肝損傷保護(hù)作用的研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 30(11): 1226-1229.

    [11] 張琳, 馬龍, 劉濤, 等. 瑣瑣葡萄提取物多糖、黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(5): 529-532.

    [12] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中國(guó)藥典: 一部[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 247.

    [13] 劉勇民. 維吾爾藥志[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999: 496.

    [14] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳. 維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn):上冊(cè)[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1993: 41.

    [15] 劉濤, 馬龍, 堵年生. 葡萄的生物學(xué)作用研究進(jìn)展[J]. 自然雜志, 2002,249(2): 84-85.

    Inhibitory Effects of Total Flavones from Vitis vinifer L. on Hepatitis B Virus in vitro

    LIU Tao1,MA Long1,*,ZHAO Jun2,LI Hai-bo3
    (1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,830011, China;2. Institute of Materia Medica of Xinjiang,830004, China;3. Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong 226006, China)

    Objective: To investigate the inhibitory effects of total flavones from Vitis vinifer L. on hepatitis B virus (HBV)replication and their toxicity in cultured human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG 2.2.15 transfected with HBV DNA.Methods: After 8 days of treatment with total flavones from Vitis vinifer L., the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 were measured by ELISA to calculate the inhibitory rates against the secretion of HBsAg and HBeAg, the change in HBV DNA was monitored by real-time PCR, and cytotoxicity test was performed using MTT assay.Results: Addition of total flavones from Vitis vinifer L. in a dosage range of 12.5 to 100μg/mL could reduce the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 to different extents. Little cytotoxic effect was observed with a median toxic concentration (TC50) of 284.91 μg/mL. The median effective doses (IC50) on HBsAg and HBeAg were 327.56 μg/mL and 215.34 μg/mL, and the therapeutic index for HBsAg and HbeAg were 0.87 and 1.32, respectively. Total flavones from Vitis vinifer L. at 100 μg/mL could inhibit HBV DNA by 47.63%. Conclusion: Total flavones from Vitis vinifer L. have inhibitory effects on HBV in vitro.

    Vitis vinifer L;flavones;hepatitis B virus;cell culture

    R965

    A

    1002-6630(2011)05-0270-03

    2010-06-17

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30660157)

    劉濤(1974—),女,副教授,博士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@sina.com

    *通信作者:馬龍(1957—),男,教授,碩士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@163.com

    猜你喜歡
    細(xì)胞培養(yǎng)抑制率黃酮
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    HPLC法同時(shí)測(cè)定固本補(bǔ)腎口服液中3種黃酮
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:40
    MIPs-HPLC法同時(shí)測(cè)定覆盆子中4種黃酮
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:13
    DAD-HPLC法同時(shí)測(cè)定龍須藤總黃酮中5種多甲氧基黃酮
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:50
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    瓜馥木中一種黃酮的NMR表征
    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
    国产精品 欧美亚洲| 69精品国产乱码久久久| 美女视频免费永久观看网站| 99热全是精品| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 热99国产精品久久久久久7| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品乱久久久久久| 黄色一级大片看看| av视频免费观看在线观看| 人妻 亚洲 视频| 国产免费又黄又爽又色| av天堂在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 宅男免费午夜| 天天影视国产精品| 丝袜在线中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 色视频在线一区二区三区| 9色porny在线观看| 视频区图区小说| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜两性在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 欧美精品高潮呻吟av久久| 又紧又爽又黄一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 首页视频小说图片口味搜索 | 婷婷成人精品国产| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜福利免费观看在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中文欧美无线码| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品国产一区二区久久| 国产高清国产精品国产三级| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 伊人亚洲综合成人网| 婷婷色综合www| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一本大道久久a久久精品| 精品少妇内射三级| 精品久久久精品久久久| 搡老乐熟女国产| 亚洲伊人久久精品综合| 777米奇影视久久| 桃花免费在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产av影院在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 天天添夜夜摸| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人av教育| 久久综合国产亚洲精品| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲av综合色区一区| av天堂在线播放| 少妇精品久久久久久久| 少妇 在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产男人的电影天堂91| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲 欧美一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 黄色片一级片一级黄色片| 国产日韩欧美在线精品| 青春草亚洲视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品第二区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产免费又黄又爽又色| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲中文av在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 看免费成人av毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 十八禁人妻一区二区| 日本色播在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩福利视频一区二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 热re99久久精品国产66热6| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 热re99久久国产66热| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费看十八禁软件| 久久99一区二区三区| 电影成人av| 制服诱惑二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产精品999| a级毛片黄视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品国产综合久久久| 视频区欧美日本亚洲| 欧美中文综合在线视频| 一本色道久久久久久精品综合| 美女主播在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美国产精品一级二级三级| 爱豆传媒免费全集在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 久久热在线av| 亚洲国产欧美网| 中文字幕精品免费在线观看视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 午夜精品国产一区二区电影| 日韩制服骚丝袜av| 嫩草影视91久久| 丝袜在线中文字幕| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 看十八女毛片水多多多| av视频免费观看在线观看| 色播在线永久视频| 99久久综合免费| 好男人视频免费观看在线| 国产精品一区二区在线不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久国产欧美日韩av| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产精品 欧美亚洲| 一本久久精品| 久久久久久人人人人人| 熟女av电影| 精品免费久久久久久久清纯 | kizo精华| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久久久久精品精品| 国产高清国产精品国产三级| 国产一区二区 视频在线| 欧美日韩精品网址| 丁香六月天网| 精品一区二区三卡| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费日韩欧美在线观看| 韩国精品一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人精品无人区| 日韩大码丰满熟妇| 香蕉国产在线看| 少妇人妻 视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄频高清免费视频| 久久青草综合色| 久久影院123| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 色94色欧美一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 免费看不卡的av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一级片'在线观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av电影中文网址| 欧美成人午夜精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 91成人精品电影| 中文字幕制服av| 亚洲天堂av无毛| a级毛片在线看网站| 一级片'在线观看视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品久久久av美女十八| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产高清不卡午夜福利| 成人黄色视频免费在线看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产成人影院久久av| 久久99一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产激情久久老熟女| 国产成人啪精品午夜网站| 国产成人a∨麻豆精品| 超碰97精品在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| videos熟女内射| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一级毛片电影观看| 国产精品免费大片| 亚洲,一卡二卡三卡| 无限看片的www在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 91成人精品电影| 国产精品久久久久久精品古装| 深夜精品福利| 人妻 亚洲 视频| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲久久久国产精品| 国产欧美亚洲国产| 欧美精品一区二区免费开放| 777米奇影视久久| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品熟女久久久久浪| 国产又色又爽无遮挡免| 国产免费又黄又爽又色| 天堂中文最新版在线下载| 久久99精品国语久久久| 少妇人妻久久综合中文| 看免费av毛片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 我要看黄色一级片免费的| 91九色精品人成在线观看| 久久精品久久久久久久性| 国产日韩欧美在线精品| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美成狂野欧美在线观看| 免费不卡黄色视频| 精品少妇久久久久久888优播| 一本久久精品| 999久久久国产精品视频| 久热这里只有精品99| 成在线人永久免费视频| e午夜精品久久久久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产又爽黄色视频| 免费看十八禁软件| 国产人伦9x9x在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品人妻在线不人妻| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲三区欧美一区| www.999成人在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产精品熟女久久久久浪| videosex国产| 日本午夜av视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜免费观看性视频| 男女边摸边吃奶| 日韩大片免费观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产黄频视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 午夜免费成人在线视频| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日本中文国产一区发布| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久 成人 亚洲| 日本欧美视频一区| 一区在线观看完整版| 一本久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜日韩欧美国产| 极品少妇高潮喷水抽搐| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产麻豆69| 美女扒开内裤让男人捅视频| 电影成人av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 又黄又粗又硬又大视频| 国产野战对白在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一本综合久久免费| 久久久久久久国产电影| 午夜福利,免费看| 日本欧美视频一区| 国产精品一区二区精品视频观看| 乱人伦中国视频| av有码第一页| 国产一区二区在线观看av| 欧美久久黑人一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 国产熟女午夜一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 五月天丁香电影| 亚洲图色成人| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美日韩一级在线毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产爽快片一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜免费鲁丝| 精品人妻一区二区三区麻豆| 色网站视频免费| av一本久久久久| 久久久久久久国产电影| 国产成人精品久久二区二区91| 精品少妇久久久久久888优播| 天天影视国产精品| 美女高潮到喷水免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品一区二区在线不卡| 婷婷色av中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产免费现黄频在线看| 亚洲人成电影免费在线| 下体分泌物呈黄色| 国产欧美亚洲国产| www.熟女人妻精品国产| 国产精品免费视频内射| 欧美激情高清一区二区三区| 91老司机精品| 国产又爽黄色视频| 中国美女看黄片| 中文字幕av电影在线播放| 免费黄频网站在线观看国产| 日本色播在线视频| 国产在视频线精品| 国产午夜精品一二区理论片| 免费看十八禁软件| 久久 成人 亚洲| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本午夜av视频| 丝袜脚勾引网站| 看免费成人av毛片| 国产熟女午夜一区二区三区| 黄片播放在线免费| 国产在线一区二区三区精| 国产精品九九99| 国产国语露脸激情在线看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产1区2区3区精品| 热re99久久精品国产66热6| 欧美激情极品国产一区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 自线自在国产av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 两人在一起打扑克的视频| 搡老乐熟女国产| 久久久久久人人人人人| videosex国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 美女视频免费永久观看网站| 国产免费福利视频在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 青春草视频在线免费观看| 69精品国产乱码久久久| 午夜av观看不卡| 国产精品久久久久成人av| 久久久久精品人妻al黑| 久久精品久久精品一区二区三区| videosex国产| 亚洲精品国产av成人精品| 黄频高清免费视频| 精品福利观看| 大香蕉久久成人网| 美女视频免费永久观看网站| 嫁个100分男人电影在线观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 99久久精品国产亚洲精品| 精品久久久精品久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 满18在线观看网站| 多毛熟女@视频| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲成色77777| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产精品国产精品| 丝袜人妻中文字幕| a 毛片基地| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av国产精品久久久久影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久人人97超碰香蕉20202| 香蕉国产在线看| 国产日韩欧美视频二区| 国产熟女欧美一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久天堂一区二区三区四区| 国产男女内射视频| 亚洲成人免费av在线播放| 99香蕉大伊视频| 久久久精品区二区三区| 大型av网站在线播放| 咕卡用的链子| 亚洲成色77777| 国产1区2区3区精品| 黄色一级大片看看| 一区二区三区四区激情视频| 日韩视频在线欧美| 首页视频小说图片口味搜索 | 国产午夜精品一二区理论片| 2018国产大陆天天弄谢| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久女婷五月综合色啪小说| 一区二区三区四区激情视频| 在线观看免费视频网站a站| 日韩大片免费观看网站| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜av观看不卡| 一级黄色大片毛片| 高清黄色对白视频在线免费看| 我要看黄色一级片免费的| 日本av免费视频播放| 高清不卡的av网站| 国产成人一区二区在线| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美精品亚洲一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 日日夜夜操网爽| a级片在线免费高清观看视频| 各种免费的搞黄视频| 中文字幕制服av| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 五月开心婷婷网| 国产成人av激情在线播放| 国产xxxxx性猛交| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 热99国产精品久久久久久7| 一二三四社区在线视频社区8| 成人国产av品久久久| 欧美人与善性xxx| 国产激情久久老熟女| tube8黄色片| 久久这里只有精品19| 悠悠久久av| 亚洲精品自拍成人| 美国免费a级毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 精品福利观看| 日本a在线网址| 热99国产精品久久久久久7| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产男女超爽视频在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产精品.久久久| 国产1区2区3区精品| 99国产精品免费福利视频| 天堂8中文在线网| 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 99re6热这里在线精品视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久久久国产电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一级毛片我不卡| 九草在线视频观看| av在线播放精品| 亚洲国产精品999| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产国语露脸激情在线看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本一区二区免费在线视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄色片一级片一级黄色片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| av片东京热男人的天堂| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 又大又爽又粗| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 最新的欧美精品一区二区| 精品福利观看| 国产精品 国内视频| 下体分泌物呈黄色| 美女大奶头黄色视频| 在现免费观看毛片| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品 国内视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产真人三级小视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 韩国精品一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲中文字幕日韩| 中国美女看黄片| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲人成电影观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩制服骚丝袜av| 国产成人欧美| 国产极品粉嫩免费观看在线| av天堂在线播放| 国产成人91sexporn| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 最新的欧美精品一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 永久免费av网站大全| a 毛片基地| 日韩av在线免费看完整版不卡| 手机成人av网站| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品 国内视频| 少妇 在线观看| 久久性视频一级片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人av教育| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产免费现黄频在线看| 在线观看免费日韩欧美大片| 一级黄色大片毛片| 日韩大码丰满熟妇| 在线观看www视频免费| 日本午夜av视频| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产成人欧美在线观看 | 人体艺术视频欧美日本| 又黄又粗又硬又大视频| cao死你这个sao货| 免费在线观看日本一区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| av一本久久久久| 嫩草影视91久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 91国产中文字幕| 久久久久久人人人人人| 少妇人妻 视频| 精品亚洲成国产av| 国产男女内射视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产一区二区 视频在线| 亚洲,欧美精品.| 国产av国产精品国产| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 免费观看a级毛片全部| 久久久久久人人人人人| 亚洲人成电影免费在线| 老熟女久久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 午夜福利一区二区在线看| 午夜免费鲁丝| 国产三级黄色录像| 我要看黄色一级片免费的| 欧美在线一区亚洲| 一级黄色大片毛片| 男人操女人黄网站| 亚洲精品一区蜜桃| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| a级片在线免费高清观看视频| 精品少妇久久久久久888优播| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品久久久久成人av| 久久久亚洲精品成人影院| 免费看av在线观看网站| 日韩大码丰满熟妇| 中文字幕人妻熟女乱码| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 老司机影院成人| 久久九九热精品免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产激情久久老熟女| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一本综合久久免费| 视频在线观看一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区 | 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产av一区二区精品久久| 久久久久久久久免费视频了| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产野战对白在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久毛片免费看一区二区三区|