• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

    2011-10-18 04:17:12李海波
    食品科學(xué) 2011年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)抑制率黃酮

    劉 濤,馬 龍,*,趙 軍,李海波

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

    瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

    劉 濤1,馬 龍1,*,趙 軍2,李海波3

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

    目的:考察瑣瑣葡萄總黃酮體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果。方法:用HBV DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞所得的HepG 2.2.15細(xì)胞株為模型,ELISA法測(cè)定用藥后8d細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量,計(jì)算瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的抑制率,熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA的變化,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果:瑣瑣葡萄總黃酮在12.5~100μg/mL范圍內(nèi),均能不同程度地減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量,且細(xì)胞毒性小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL,對(duì)HBsAg半數(shù)有效劑量(IC50)為327.56μg/mL、對(duì)HBeAg為215.34μg/mL,對(duì)HBsAg治療指數(shù)(TI)為0.87、對(duì)HBeAg治療指數(shù)為1.32;總黃酮質(zhì)量濃度100μg/mL時(shí)對(duì)HBV DNA的抑制率為47.63%。結(jié)論:瑣瑣葡萄總黃酮具有一定的體外抗HBV作用。

    瑣瑣葡萄;總黃酮;乙型肝炎病毒;細(xì)胞培養(yǎng)

    乙型肝炎病毒(HBV)感染不僅會(huì)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生,而且與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)天然藥物的抗病毒研究日益重視,抗乙肝病毒藥物研究雖然取得了一些進(jìn)展,但目前仍缺乏比較理想的治療藥物[1]。因此,從豐富的中草藥植物資源中尋找新的有效抗HBV藥物,已成為我國(guó)抗病毒中藥發(fā)展的必然趨勢(shì)。1987年,美國(guó)Sells等[2]將帶有HBV DNA全基因組及抗G418的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Hep G建立了2.2.15細(xì)胞株,它能長(zhǎng)期穩(wěn)定地向細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane’s顆粒,是目前體外篩選和評(píng)價(jià)抗乙肝病毒藥物較理想的細(xì)胞模型[3]。黃酮是維吾爾藥瑣瑣葡萄(Vitis vinifer L.)的主要組成成分之一[4],具有調(diào)節(jié)免疫[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗輻射[9]等多種生物活性。課題組前期研究顯示瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)免疫性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[10],且對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用[11]。為探討瑣瑣葡萄總黃酮的抗HBV效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)以Hep G 2.2.15細(xì)胞株為模型,研究瑣瑣葡萄總黃酮在體外抗HBV的生物活性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HepG 2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)物種保藏中心,傳代于高糖DMEM培養(yǎng)基(每1000mL含100萬(wàn)單位青霉素、1.0g鏈霉素、100mg G418和10%滅活胎牛血清)中培養(yǎng)。

    DMEM培養(yǎng)基、G418(Geneticin)、青霉素-鏈霉素美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物制品公司;HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒 上海華美生物工程公司;HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒 上海申友生物技術(shù)有限公司;噻唑藍(lán)(MTT) 美國(guó)Amresco公司;二甲基亞砜(DMSO)、0.025%胰蛋白酶-EDTA美國(guó)Sigma公司;拉米夫定(3-TC,批號(hào)06120028) 葛蘭素史克制藥蘇州有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Napco公司;XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司;生物安全柜 美國(guó)Labconco公司;XD 711型酶標(biāo)儀 上海迅達(dá)醫(yī)療器械有限公司;Thermo IEC冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)熱電公司;Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)MJ Research公司;AB104-N型分析天平 Mettler-Toledo上海有限公司。

    1.3 瑣瑣葡萄總黃酮的制備

    瑣瑣葡萄藥材粉碎后以去離子水回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至一定量,加入5倍體積95%乙醇,充分混勻,靜置12h,過(guò)濾得濾液A。藥渣以8倍量95%乙醇回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至浸膏,浸膏以水混懸后,石油醚萃取脫脂,再經(jīng)乙酸乙酯萃取,其中乙酸乙酯部分減壓濃縮后,以95%乙醇溶解,放置12h,析出沉淀,過(guò)濾得濾液B;濾液A、濾液B及乙酸乙酯萃取后液體合并,減壓濃縮,上AB-8 型大孔吸附樹脂,依次以水、50%和95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,收集50%乙醇洗脫餾分,減壓濃縮,真空干燥,即得瑣瑣葡萄總黃酮。按參考文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定其總黃酮含量為35.28%。

    1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,分別加入含不同質(zhì)量濃度樣品培養(yǎng)基培養(yǎng),第4天換含同樣樣品的培養(yǎng)基,8d后加入5mg/mL的MTT溶液,每孔10μL,37℃孵育4h后,加入DMSO,每孔150μL,混勻,使甲臢完全溶解,用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A給藥組)。以相同條件、相同體積不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照,測(cè)定其吸光度(A細(xì)胞對(duì)照組),按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率,求出半數(shù)中毒劑量(TC50)。空白組為測(cè)定時(shí)平行操作的空白對(duì)照組,測(cè)定吸光度(A空白組)。

    1.5 藥物活性實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組、不同質(zhì)量濃度藥物組及陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。HepG 2.2.15細(xì)胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,各質(zhì)量濃度藥物組分別加入含瑣瑣葡萄總黃酮(100、50、25、12.5μg/mL)的培養(yǎng)基、各質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照組分別加入含3-TC(100、10、1μg/mL)的培養(yǎng)基,每孔200μL,每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)每板各設(shè)6個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔加入同體積無(wú)藥物培養(yǎng)基作為細(xì)胞對(duì)照組,置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每4d換含同樣樣品的培養(yǎng)基,第8天分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,置-20℃保存?zhèn)溆?,待測(cè)HBsAg、HBeAg和HBV DNA。

    1.6 HBsAg和HBeAg的檢測(cè)

    采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的濃度,以P/N(即樣品的吸光度與空白對(duì)照吸光度的比值)表示。根據(jù)公式(2)計(jì)算各濃度藥物對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率,計(jì)算半數(shù)有效濃度IC50。

    式中:A給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的吸光度;A空白組為試劑盒測(cè)定時(shí)不加酶結(jié)合底物而平行操作的空白對(duì)照組;A細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組。

    結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所得TC50計(jì)算各樣品的治療指數(shù)(TI),綜合判斷藥物效果。TI= TC50/IC50,TI>2為有效低毒;1<TI≤2為低效有毒;TI≤1為受試物毒性大,不宜于用于抗HBV治療。

    1.7 HBV DNA的測(cè)定

    按照HBV DNA熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書操作,測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)公式(3)計(jì)算各受試物對(duì)HBV DNA的抑制率。

    式中:C給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的HBV DNA拷貝數(shù);C細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組的HBV DNA拷貝數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用

    MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率,結(jié)果顯示瑣瑣葡萄總黃酮及3-TC對(duì)Hep G 2.2.15細(xì)胞的毒性較小,其TC50分別為284.91μg/mL 和244.77μg/mL(表1、2)。

    表1 瑣瑣葡萄總黃酮體外抗HBV效果Table 1 Inhibition effects of total flavones from Vitis vinifer L. on HBV in vitro

    表2 瑣瑣葡萄總黃酮的治療指數(shù)Table 2 Therapeutic indexes of total flavones from Vitis vinifer L. for HBsAg and HbeAg

    2.2 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的影響

    在瑣瑣葡萄總黃酮和3-TC對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的IC50分別為327.56μg/mL和315.37μg/mL,其TI為0.87和0.78;對(duì)HBeAg的IC50分別為215.34μg/mL和9051.01μg/mL,其TI分別為1.32和0.03,提示在此實(shí)驗(yàn)條件下,瑣瑣葡萄總黃酮抑制HepG 2.2.15分泌HBsAg和HBeAg的效果均優(yōu)于3-TC(表1、2)。

    2.3 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA的影響

    瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng),而3-TC可顯著抑制HBV DNA的分泌,各質(zhì)量濃度組DNA拷貝數(shù)<103,超出試劑盒檢測(cè)下限(表1)。

    3 討 論

    瑣瑣葡萄為葡萄科小無(wú)核紅葡萄品系藥食兼用植物,藥用果實(shí),主產(chǎn)于我國(guó)新疆吐魯番、和田、鄯善等地[13];在維吾爾醫(yī)臨床主要應(yīng)用于脾胃不和、頭暈腰酸、神志不安以及小兒麻疹和肝炎等病癥的治療[14-15],為探討瑣瑣葡萄的抗病毒藥效,本研究應(yīng)用Hep G 2.2.15細(xì)胞株對(duì)瑣瑣葡萄總黃酮進(jìn)行了抗HBV活性篩選,結(jié)果顯示:瑣瑣葡萄總黃酮用藥8d后,對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg具有顯著抑制作用,半數(shù)有效劑量(IC50)HBsAg為327.56μg/mL、HBeAg為215.34μg/mL,治療指數(shù)(TI)分別為HBsAg 0.87、HBeAg 1.32,抑制效果均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米呋啶,且藥物細(xì)胞毒性較小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL;而瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA也表現(xiàn)出一定的抑制作用,在100μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到47.63%。細(xì)胞培養(yǎng)具有易于控制實(shí)驗(yàn)條件和均衡性好的特點(diǎn),但體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不能反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)及代謝對(duì)藥物效果的影響。因此,本研究結(jié)果雖然顯示瑣瑣葡萄總黃酮在體外具有一定的抗HBV生物學(xué)活性,與維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用效果相一致,但進(jìn)一步證實(shí)其抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定,其作用機(jī)制也有待于深入研究。

    [1] 王靈臺(tái). 中西醫(yī)治療慢性乙型肝炎的問(wèn)題和對(duì)策[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 29(7): 583-584.

    [2] SELLS M A, CHEN M L, ACS G, et al. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(4): 1005-l009.

    [3] 成軍, 斯崇文. HBV DNA轉(zhuǎn)然細(xì)胞系的建立及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 流行病與傳染病分冊(cè), 1994, 21(2): 60-64.

    [4] 馬龍, 劉濤, 向陽(yáng), 等. 新疆葡萄中3種生物活性物質(zhì)的含量分析[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(1): 28-31.

    [5] 汪敏, 王維民, 諶素華. 芒果皮黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(8): 23-25.

    [6] 王海敏, 虞海霞, 董蕊, 等. 苕子蜜總酚酸和總黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 54-57.

    [7] 王嵐, 康琛, 楊偉鵬, 等. 藤梨根正丁醇提取物和總黃酮苷抗腫瘤作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(16): 2184-2186.

    [8] 何忠梅, 白冰, 王慧, 等. 千里光總黃酮體外抗腫瘤和抗病毒活性研究[J]. 中成藥, 2010, 32(12): 2045-2047.

    [9] 雷筱芬, 陳木森. 黃酮類化合物抗輻射研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 29(6): 1039-1042.

    [10] 劉濤, 馬龍, 趙軍, 等. 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)小鼠免疫性肝損傷保護(hù)作用的研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 30(11): 1226-1229.

    [11] 張琳, 馬龍, 劉濤, 等. 瑣瑣葡萄提取物多糖、黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(5): 529-532.

    [12] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中國(guó)藥典: 一部[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 247.

    [13] 劉勇民. 維吾爾藥志[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999: 496.

    [14] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳. 維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn):上冊(cè)[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1993: 41.

    [15] 劉濤, 馬龍, 堵年生. 葡萄的生物學(xué)作用研究進(jìn)展[J]. 自然雜志, 2002,249(2): 84-85.

    Inhibitory Effects of Total Flavones from Vitis vinifer L. on Hepatitis B Virus in vitro

    LIU Tao1,MA Long1,*,ZHAO Jun2,LI Hai-bo3
    (1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,830011, China;2. Institute of Materia Medica of Xinjiang,830004, China;3. Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong 226006, China)

    Objective: To investigate the inhibitory effects of total flavones from Vitis vinifer L. on hepatitis B virus (HBV)replication and their toxicity in cultured human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG 2.2.15 transfected with HBV DNA.Methods: After 8 days of treatment with total flavones from Vitis vinifer L., the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 were measured by ELISA to calculate the inhibitory rates against the secretion of HBsAg and HBeAg, the change in HBV DNA was monitored by real-time PCR, and cytotoxicity test was performed using MTT assay.Results: Addition of total flavones from Vitis vinifer L. in a dosage range of 12.5 to 100μg/mL could reduce the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 to different extents. Little cytotoxic effect was observed with a median toxic concentration (TC50) of 284.91 μg/mL. The median effective doses (IC50) on HBsAg and HBeAg were 327.56 μg/mL and 215.34 μg/mL, and the therapeutic index for HBsAg and HbeAg were 0.87 and 1.32, respectively. Total flavones from Vitis vinifer L. at 100 μg/mL could inhibit HBV DNA by 47.63%. Conclusion: Total flavones from Vitis vinifer L. have inhibitory effects on HBV in vitro.

    Vitis vinifer L;flavones;hepatitis B virus;cell culture

    R965

    A

    1002-6630(2011)05-0270-03

    2010-06-17

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30660157)

    劉濤(1974—),女,副教授,博士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@sina.com

    *通信作者:馬龍(1957—),男,教授,碩士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@163.com

    猜你喜歡
    細(xì)胞培養(yǎng)抑制率黃酮
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    HPLC法同時(shí)測(cè)定固本補(bǔ)腎口服液中3種黃酮
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:40
    MIPs-HPLC法同時(shí)測(cè)定覆盆子中4種黃酮
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:13
    DAD-HPLC法同時(shí)測(cè)定龍須藤總黃酮中5種多甲氧基黃酮
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:50
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    瓜馥木中一種黃酮的NMR表征
    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
    一级a爱视频在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲四区av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 操美女的视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩视频在线欧美| 热99久久久久精品小说推荐| 国产高清不卡午夜福利| 91国产中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲第一青青草原| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美黄色片欧美黄色片| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av中文av极速乱| 免费在线观看黄色视频的| 成人国产av品久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费不卡黄色视频| 国产一区二区 视频在线| 咕卡用的链子| 国产一级毛片在线| 丁香六月天网| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99久久精品国产亚洲精品| 一级毛片电影观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 我的亚洲天堂| 97人妻天天添夜夜摸| 美女视频免费永久观看网站| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品国产av在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 制服人妻中文乱码| 丁香六月欧美| 激情视频va一区二区三区| videos熟女内射| kizo精华| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产男人的电影天堂91| 看免费av毛片| 在线免费观看不下载黄p国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久久久精品人妻al黑| 电影成人av| 日本vs欧美在线观看视频| 国产视频首页在线观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产成人欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 这个男人来自地球电影免费观看 | 9191精品国产免费久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲图色成人| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 不卡av一区二区三区| 亚洲av综合色区一区| 新久久久久国产一级毛片| kizo精华| www.av在线官网国产| 欧美日韩综合久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| xxx大片免费视频| 国产av国产精品国产| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产成人一区二区在线| 欧美精品一区二区大全| 最黄视频免费看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久影院123| 精品久久久精品久久久| 国产爽快片一区二区三区| 国产午夜精品一二区理论片| 男女下面插进去视频免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女高潮啪啪啪动态图| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产精品成人久久小说| 日本91视频免费播放| 国产伦理片在线播放av一区| 在线看a的网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品三级大全| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 一级爰片在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| av片东京热男人的天堂| 超色免费av| av片东京热男人的天堂| 久久热在线av| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品国产av成人精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产亚洲一区二区精品| 91成人精品电影| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧洲日产国产| 蜜桃国产av成人99| 国产熟女欧美一区二区| av网站在线播放免费| 午夜激情av网站| 另类亚洲欧美激情| 十八禁人妻一区二区| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人精品在线电影| 亚洲精品国产一区二区精华液| 九色亚洲精品在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品国产一区二区久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线观看免费视频网站a站| a级毛片在线看网站| 久久综合国产亚洲精品| www.自偷自拍.com| 久久99一区二区三区| 男女国产视频网站| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 99久久综合免费| 午夜福利视频在线观看免费| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品一区二区在线不卡| 免费黄网站久久成人精品| 国产成人精品福利久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产在线视频一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 天天影视国产精品| 日本色播在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产午夜精品一二区理论片| 精品一区二区免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲,欧美精品.| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av卡一久久| 精品一区二区三卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 男男h啪啪无遮挡| 丝袜喷水一区| 国产一区二区三区av在线| 大片免费播放器 马上看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91国产中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久99一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久av网站| 视频区图区小说| 老司机亚洲免费影院| 秋霞伦理黄片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本欧美国产在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日本色播在线视频| 不卡av一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品 | 国产精品国产三级国产专区5o| 看免费成人av毛片| 丰满乱子伦码专区| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 丰满少妇做爰视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| av有码第一页| 搡老乐熟女国产| 18禁动态无遮挡网站| 国产av精品麻豆| 国产精品嫩草影院av在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 叶爱在线成人免费视频播放| 波多野结衣一区麻豆| www.熟女人妻精品国产| 老司机深夜福利视频在线观看 | svipshipincom国产片| 精品久久久精品久久久| 国产在线一区二区三区精| 亚洲国产日韩一区二区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人精品福利久久| 搡老乐熟女国产| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 午夜日本视频在线| 午夜福利影视在线免费观看| 久久av网站| 成人国语在线视频| 国产成人欧美| 午夜日本视频在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 捣出白浆h1v1| 各种免费的搞黄视频| 日韩一区二区三区影片| 国产av码专区亚洲av| 久久热在线av| 精品人妻在线不人妻| 观看av在线不卡| 色婷婷久久久亚洲欧美| 波野结衣二区三区在线| 久久久久久久久免费视频了| 丁香六月天网| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜影院在线不卡| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲av福利一区| 一本大道久久a久久精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产av精品麻豆| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 搡老岳熟女国产| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美久久黑人一区二区| 妹子高潮喷水视频| 成年人免费黄色播放视频| 又大又黄又爽视频免费| av卡一久久| 久久久精品免费免费高清| 成人国产麻豆网| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| av卡一久久| 亚洲第一青青草原| 男女边吃奶边做爰视频| 少妇精品久久久久久久| 又大又黄又爽视频免费| 晚上一个人看的免费电影| 色精品久久人妻99蜜桃| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲视频免费观看视频| 中文字幕色久视频| 男人舔女人的私密视频| 国产 一区精品| av女优亚洲男人天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产99久久九九免费精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av又黄又爽大尺度在线免费看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| a 毛片基地| 最近中文字幕2019免费版| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久婷婷青草| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 狂野欧美激情性xxxx| 18禁观看日本| 午夜av观看不卡| 久久久久精品性色| 免费观看av网站的网址| 9191精品国产免费久久| 精品酒店卫生间| 国产一区二区 视频在线| 精品视频人人做人人爽| 成人三级做爰电影| 国产在线一区二区三区精| 一区在线观看完整版| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产精品免费大片| 婷婷成人精品国产| av在线观看视频网站免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人手机av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 色网站视频免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 蜜桃在线观看..| 大码成人一级视频| 丝袜喷水一区| 国产成人欧美在线观看 | 欧美激情高清一区二区三区 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲四区av| 国产av精品麻豆| 久久韩国三级中文字幕| 在线天堂中文资源库| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产麻豆69| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲人成电影观看| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美黑人欧美精品刺激| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女边吃奶边做爰视频| 国产xxxxx性猛交| 少妇人妻久久综合中文| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日日撸夜夜添| 伊人久久国产一区二区| 日日撸夜夜添| 秋霞伦理黄片| www.熟女人妻精品国产| 久久天堂一区二区三区四区| 国产片内射在线| 人妻 亚洲 视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲美女黄色视频免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 美女大奶头黄色视频| 精品国产国语对白av| 黄色一级大片看看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| www.精华液| 亚洲第一av免费看| 中国三级夫妇交换| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 97精品久久久久久久久久精品| 国产福利在线免费观看视频| www日本在线高清视频| 欧美xxⅹ黑人| 免费日韩欧美在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 免费日韩欧美在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线天堂最新版资源| 99九九在线精品视频| 成年人免费黄色播放视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产激情久久老熟女| 日韩精品免费视频一区二区三区| 多毛熟女@视频| 国产av一区二区精品久久| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 黄色视频不卡| 精品少妇内射三级| 亚洲成人av在线免费| 丝袜美足系列| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日韩欧美精品免费久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品日本国产第一区| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美日韩av久久| 人成视频在线观看免费观看| a 毛片基地| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品无人区| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品,欧美精品| 看免费av毛片| 秋霞伦理黄片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产色婷婷99| www.精华液| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲,欧美,日韩| 天堂8中文在线网| 男女床上黄色一级片免费看| 国产1区2区3区精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲四区av| 中文天堂在线官网| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 看免费av毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| a级毛片在线看网站| 国产乱来视频区| 日本av免费视频播放| 蜜桃国产av成人99| 精品一区二区三区四区五区乱码 | a级片在线免费高清观看视频| 国产成人啪精品午夜网站| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 大码成人一级视频| 亚洲av综合色区一区| 日韩一本色道免费dvd| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久热这里只有精品99| 日韩大片免费观看网站| 十八禁高潮呻吟视频| 一区二区av电影网| 婷婷色av中文字幕| 91国产中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 成人影院久久| 国产免费又黄又爽又色| 日韩制服骚丝袜av| 欧美成人午夜精品| 免费少妇av软件| 国产av精品麻豆| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲国产欧美在线一区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区在线观看完整版| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜老司机福利片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 成人手机av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日本wwww免费看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产免费现黄频在线看| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 各种免费的搞黄视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品国产一区二区久久| 在线观看免费视频网站a站| 观看美女的网站| 亚洲人成77777在线视频| 曰老女人黄片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 国产片内射在线| 大香蕉久久网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 中文欧美无线码| 中文字幕亚洲精品专区| 成人三级做爰电影| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黄片播放在线免费| 最近中文字幕2019免费版| 久热爱精品视频在线9| 精品国产乱码久久久久久小说| 伦理电影免费视频| 在线天堂中文资源库| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av中文av极速乱| 久久人人97超碰香蕉20202| 大码成人一级视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 毛片一级片免费看久久久久| 老鸭窝网址在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人国产av品久久久| 欧美另类一区| 看十八女毛片水多多多| 五月天丁香电影| 两性夫妻黄色片| 中文字幕制服av| 狂野欧美激情性xxxx| 国产毛片在线视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费高清在线观看日韩| 一级黄片播放器| 精品久久久久久电影网| 欧美变态另类bdsm刘玥| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品在线美女| 桃花免费在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 日本欧美视频一区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产爽快片一区二区三区| www.精华液| videosex国产| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲国产av新网站| 18禁国产床啪视频网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品 国内视频| 国产深夜福利视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产在线免费精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日本vs欧美在线观看视频| 精品人妻在线不人妻| 色播在线永久视频| 超色免费av| av在线老鸭窝| 久久青草综合色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 90打野战视频偷拍视频| 国产精品免费视频内射| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久亚洲国产成人精品v| 毛片一级片免费看久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 91成人精品电影| 午夜免费鲁丝| 亚洲七黄色美女视频| 国产一级毛片在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费高清在线观看日韩| 在线观看www视频免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产精品999| 午夜91福利影院| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲伊人色综图| av又黄又爽大尺度在线免费看| 考比视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 观看美女的网站| 另类亚洲欧美激情| 天堂8中文在线网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久 成人 亚洲| 母亲3免费完整高清在线观看| 老熟女久久久| 91老司机精品| 久久久久久久久久久久大奶| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 99久久人妻综合| 久久综合国产亚洲精品| 欧美在线一区亚洲| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄色怎么调成土黄色| 久久免费观看电影| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产1区2区3区精品| 超色免费av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲成人手机| 两性夫妻黄色片| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品国产综合久久久| 青草久久国产| 午夜免费观看性视频| 9191精品国产免费久久| 午夜av观看不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一本久久精品| 美女主播在线视频| 亚洲精品一二三| 99久国产av精品国产电影|