雞骨蛋白酶解過程中的產(chǎn)物性質(zhì)研究及電泳分析

張 恒，鄔應(yīng)龍*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

雞骨蛋白酶解過程中的產(chǎn)物性質(zhì)研究及電泳分析

張 恒，鄔應(yīng)龍*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

研究風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨過程中的氨基氮、可溶性氮、肽基氮的變化規(guī)律以及產(chǎn)物的呈味特性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明：氨基氮和可溶性氮在酶解過程中逐漸增加，肽基氮增加到最大值后下降；酶解產(chǎn)物鮮味隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，苦味值在酶解后期逐漸穩(wěn)定。游離氨基酸含量在24h達(dá)到最大值，呈味氨基酸的大量釋放對(duì)酶解液的風(fēng)味有重要影響。酶解液的Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在酶解過程中，多肽分子質(zhì)量逐漸降低，酶解24h，酶解液分子質(zhì)量約都集中在10.0kD以下。

雞骨蛋白；酶解；呈味；氨基酸；Tricine-SDS-PAGE

隨著我國(guó)肉雞生產(chǎn)和加工業(yè)的加速發(fā)展，雞骨架產(chǎn)量也逐年增加，但是由于我國(guó)新興生產(chǎn)技術(shù)還不夠成熟，對(duì)雞骨的綜合加工水平不高。近年來隨著酶解技術(shù)在骨蛋白中的應(yīng)用和發(fā)展，酶解產(chǎn)物作為營(yíng)養(yǎng)基料、功能性基料和調(diào)味基料能應(yīng)用在食品、化妝等許多領(lǐng)域。目前對(duì)雞骨的酶解研究主要集中在水解工藝的優(yōu)化[1-2]、酶解產(chǎn)物生理功能的研究[3]以及以酶解液作為肉味香精的前體經(jīng)過美拉德反應(yīng)制肉味香精調(diào)味基料等方面[4]。本實(shí)驗(yàn)在前期已優(yōu)化酶解工藝的基礎(chǔ)上，采用風(fēng)味蛋白酶水解雞骨蛋白，研究雞骨酶解過程中的氨基氮、可溶性氮、肽基氮的變化和游離氨基酸的釋放規(guī)律，以及酶解過程中產(chǎn)物的呈味變化趨勢(shì)，并通過Tricine-SDS-PAGE方法分析了雞骨蛋白在水解過程中多肽的降解情況，以期為雞骨蛋白深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨架購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

風(fēng)味蛋白酶 廣西龐博生物公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4～94.0kD)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、過硫酸銨、N,N,N＇N＇-四甲基乙二胺(TEMED) 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；A-88型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HHS-9S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠；Mini-protean 垂直電泳槽美國(guó)Bio-Rad公司；日立L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備

取雞骨架去除皮、油脂及肉，用粉碎機(jī)粉碎，將雞骨泥與水1:1比例用組織勻漿機(jī)勻漿1min，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的雞骨懸浮液，在溫度55℃、pH7.5、加酶量8000U/g pro的條件下酶解4、8、12、16、20、24h，酶解完畢后沸水滅酶10min，離心過濾，去除骨渣與懸浮物即為酶解液。

1.3.2 氮的3種存在形式的測(cè)定

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定：酶解產(chǎn)物上清液中游離氨基酸含氮量占原料總氮量百分比，采用甲醛電位滴定法[5]。

可溶性氮含量測(cè)定：酶解產(chǎn)物上清液中總氮量占原料總氮量百分比，采用半微量凱氏定氮法。

肽基氮含量測(cè)定：酶解產(chǎn)物上清液中肽基氮量占原料總氮量百分比，肽基氮=可溶性氮－氨基態(tài)氮。

1.3.3 酶解產(chǎn)物呈味評(píng)價(jià)

結(jié)合文獻(xiàn)[6-7]，將酶解液作為評(píng)嘗對(duì)象，以蒸餾水為對(duì)比，評(píng)價(jià)其鮮味、苦味。評(píng)定小組由10人組成，均受過相關(guān)培訓(xùn)，打分采用5分制。評(píng)定前用清水漱口，將酶解液放入口中15s吞下，每個(gè)樣品給兩次，評(píng)定時(shí)拒絕交流，且樣品需用帶中性的文字標(biāo)明，避免主觀評(píng)價(jià)。

1.3.4 酶解產(chǎn)物游離氨基酸分析

游離氨基酸的分析：酶解液中加入等體積的7%磺基水楊酸，混勻后靜置30min，去除蛋白質(zhì)和多肽，于10000r/min離心20min，取上清液供氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3.5 酶解產(chǎn)物電泳分析

SDS-PAGE電泳是測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量及亞基組成最常用的方法，該方法一般用于測(cè)定分子質(zhì)量范圍在10～200kD的蛋白質(zhì)，而對(duì)于分子質(zhì)量小于10kD的小分子多肽則不能有效地分離和測(cè)定，多采用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)[8-9]，目前，在梅魚、蛋清的酶解物分離上都有研究[10-11]。

凝膠的制備：經(jīng)過多次摸索，雞骨酶解液的電泳可采用兩層膠的凝膠結(jié)構(gòu)，在分離膠中加尿素和甘油，按表1灌膠。

表1 Tricine-SDS-PAGE電泳膠的組成Table 1 Composition of separating and stacking gels

電泳條件：采用恒壓電泳，起始電壓為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓上升到120V至電泳結(jié)束，40℃染色30min再脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞骨蛋白酶解過程中的氮存在形式變化

圖1 雞骨酶解過程中的氮存在形式Fig.1 Changes in amino nitrogen, soluble nitrogen and peptide nitrogen during the hydrolysis of chicken bone protein

由圖1可知，風(fēng)味酶酶解雞骨過程中，氨基態(tài)氮與可溶性氮均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，在初始的4h內(nèi)增速最快。盡管氨基態(tài)氮和可溶性氮的含量在酶解過程中都不斷增加，由于酶解過程中同時(shí)存在著蛋白降解成肽和氨基酸以及這些肽被進(jìn)一步降解成更小分子質(zhì)量的肽和氨基酸兩個(gè)過程，這兩個(gè)過程，優(yōu)勢(shì)過程對(duì)產(chǎn)物中肽的含量有直接的影響。風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨過程中，氨基態(tài)氮在整個(gè)水解過程中一直增加，水解24h后最大氨基態(tài)氮值為30.23%；可溶性氮在前4h快速增加，達(dá)到72.2%， 24h后可溶性氮值達(dá)到最大值82.74%；而肽基氮在水解開始時(shí)快速增加，在4～8h間達(dá)到最大值，然后出現(xiàn)下降，隨著水解的繼續(xù)進(jìn)行，肽基氮的含量逐漸減少。與肖如武等[12]研究馬氏珍珠貝肉、趙謀明等[13]研究海產(chǎn)低值魚的酶解規(guī)律類似。本實(shí)驗(yàn)選用的風(fēng)味蛋白酶是利用米曲霉發(fā)酵提取而得，經(jīng)過復(fù)配而成的復(fù)合酶，其包含了內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶的兩種活性，在水解初始的4h，風(fēng)味蛋白酶主要以雞骨蛋白為酶解底物，釋放多肽和氨基酸，隨后肽含量的增幅變緩，8h后，溶液中的肽也成為風(fēng)味酶的酶解底物，釋放出更多的小肽和氨基酸。

2.2 酶解雞骨蛋白過程中產(chǎn)物的呈味變化

酶解產(chǎn)物的呈味特性是蛋白酶解過程中不斷生成游離氨基酸，包括鮮、甜、苦、酸、咸味氨基酸，小分子肽包括苦味肽、鮮味肽(或風(fēng)味提升肽)和其他呈味肽，以及與水解液中的有機(jī)酸、糖類、鹽等共同作用的結(jié)果[14]。水解產(chǎn)物的風(fēng)味對(duì)其應(yīng)用有著重要的影響，其中苦味最為關(guān)鍵，而鮮味則是水解動(dòng)物蛋白應(yīng)用于調(diào)味基料的一個(gè)重要參考指標(biāo)。

圖2 雞骨酶解過程中的呈味評(píng)價(jià)Fig.2 Change in delicious taste and bitter taste values during the hydrolysis of chicken bone protein

由圖2可知，風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨蛋白的整個(gè)過程中，鮮味值都遠(yuǎn)大于苦味值，鮮味值隨著酶解進(jìn)行不斷增強(qiáng)，苦味值隨著酶解的深入逐漸達(dá)到穩(wěn)定，但整個(gè)酶解液苦味都不明顯。酶解產(chǎn)物中的鮮味主要來源于酶解過程中產(chǎn)生的鮮味、甜味氨基酸，而苦味則主要是酶解過程中產(chǎn)生的苦味肽。因?yàn)轱L(fēng)味酶中含有大量的肽酶，能從肽的N-端或C-端裂解出疏水性氨基酸而使苦味肽的苦味減弱。之外作者還曾對(duì)比過不同蛋白酶酶解雞骨過程中的呈味評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)鮮味值都隨著酶解進(jìn)行而增強(qiáng)，而苦味值的規(guī)律則因酶不同而有不同變化。

2.3 雞骨蛋白酶解過程中游離氨基酸含量的變化

由表2可知，多數(shù)游離氨基酸的含量都隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，酶解24h產(chǎn)物的游離氨基酸為401.45mg/100mL，是酶解4h產(chǎn)物游離氨基酸含量的2倍。酶解16h后，Ile、Phe、Arg、Pro等出現(xiàn)下降，這可能是由于酶解后期疏水氨基酸大量釋放，多肽通過轉(zhuǎn)肽作用將疏水性氨基酸生成不溶于水的疏水性肽類，濃縮成小顆粒形成不溶于水的類蛋白[15]，酶解雞肉[14]、酶解花生粕[16]的過程中也發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象。酶解4h，疏水氨基酸Phe、Lys、Leu、Arg 和親水氨基酸Glu、 Gly、Ala含量較多，隨著酶解進(jìn)行，4～8h時(shí)Val、Met、Ile、Leu和Tyr的增長(zhǎng)率加快，8～16h間各種氨基酸平穩(wěn)增加，其中Asp與Ile增速較快，說明酶解后期，肽鏈上末端含Asp與Ile殘基為風(fēng)味酶水解位點(diǎn)之一。

表2 風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨蛋白過程中游離氨基酸組成Table 2 Change in free amino acid composition during the hydrolysis of chicken bone protein mg/100mL

圖3 酶解液中鮮、苦味氨基酸的含量變化Fig.3 Changes in the contents of umami and bitter amino acids during he hydrolysis of chicken bone protein

在風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨蛋白過程中呈味氨基酸大量釋放，由圖3可知，鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸)和苦味氨基酸(苯丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸)的總量隨著酶解進(jìn)行不斷增大，其中鮮味氨基酸的總量24h時(shí)為156.62mg/100mL，是4h時(shí)72.93mg/100mL的2.15倍，鮮味氨基酸占總氨基酸的含量在酶解4h時(shí)為35.82%，在24h時(shí)上升到39.01%；苦味氨基酸的總量在24h時(shí)為203.56mg/100mL，是4h時(shí)的105.16mg/100mL 的1.94倍，苦味氨基酸占總氨基酸的含量在8h時(shí)達(dá)到最大值54.13%，之后隨著酶解進(jìn)行逐漸降低。雖然鮮味氨基酸的含量一直比苦味氨基酸含量低，但從圖2的呈味評(píng)價(jià)來看，風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物的鮮味評(píng)價(jià)遠(yuǎn)高于苦味評(píng)價(jià)，鮮味評(píng)價(jià)同鮮味氨基酸含量以及其占總氨基酸的比例基本一致，都隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而苦味的評(píng)價(jià)同苦味氨基酸占總氨基酸的變化規(guī)律不完全一致，可能的原因是酶解產(chǎn)物的鮮味主要受酶解過程中鮮味氨基酸的影響，而苦味受苦味氨基酸影響較小，主要由蛋白酶解過程中苦味肽造成的。

2.4 雞骨蛋白酶解過程中多肽分子質(zhì)量分布

圖4 雞骨酶解過程中的多肽分子質(zhì)量分布情況Fig.4 Tricine-SDS-PAGE electropherograms of chicken bone hydrolysates at different time points of hydrolysis

由圖4可知，雞骨酶解過程中，原料蛋白大量降解，生成大量多肽和氨基酸，分子質(zhì)量在前4h迅速降低，酶解4h時(shí)，分子質(zhì)量分布連續(xù)，在30.0～26.0kD之間有明顯的多肽條帶；酶解8h時(shí)，分子質(zhì)量快速降低，多肽集中在20.0kD以下；酶解24h，雞骨酶解產(chǎn)物的多肽幾乎都在10.0kD以下。

3 結(jié) 論

3.1 風(fēng)味蛋白酶酶解雞骨蛋白過程中，氨基態(tài)氮和可溶性氮均隨著酶解的深入逐漸增加，在前4h增速最快，肽基氮上升到最大值后出現(xiàn)下降。

3.2 酶解物的游離氨基酸含量隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，在24h達(dá)到最大值，呈味氨基酸的含量和比例對(duì)產(chǎn)物的呈味評(píng)價(jià)有重要影響。3.3 酶解物的鮮味在酶解過程中逐漸增強(qiáng)，苦味逐漸達(dá)到穩(wěn)定，由于所選酶為風(fēng)味蛋白酶，苦味在整個(gè)酶解過程都不明顯。3.4 通過對(duì)酶解液的電泳分析，顯示雞骨酶解過程中，肽的含量和分子質(zhì)量都逐漸降低，酶解24h，雞骨酶解產(chǎn)物的多肽幾乎都在10.0kD以下。

[1] 徐德峰, 張衛(wèi)明, 孫曉明, 等. 響應(yīng)曲面法在雞骨架蛋白酶解工藝中的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(4): 82-86.

[2] 丁小燕, 張?chǎng)? 陳延峰, 等. 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解雞骨泥工藝條件的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(1): 88-92.

[3] CHENG Fuyuan, LIU Yutse, WAN Tienchun, et al. The development of angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from chicken bone protein[J]. Animal Science Journal, 2008, 79: 122-128.

[4] 尹禮國(guó), 徐洲, 于穎, 等. 雞骨酶解物的制備與應(yīng)用[J]. 中國(guó)調(diào)味品,2008(5): 88-92.

[5] 吳謀成. 食品分析與感官評(píng)定[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2004: 78-79.

[6] ZHAO Mouming, ZHOU Xuesong, LIN Weifeng. Changes of taste composition during the enzymatic hydrolysis of chicken meat[J]. Food Science, 2006, 27(5): 68-71.

[7] KIJIMA K, SUZUKI H. Improving the umami taste of soy sauce by the addition of bacterial γ-glutamyltranspeptidase as a glutaminase to the fermentation mixture[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41:80-84.

[8] SCHAGGER H, JAGOW G V. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD[J]. Anal Biochem, 1987, 166: 368-379.

[9] 曹佐武. 小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分離方法[J]. 生物學(xué)通報(bào),2003, 38(3): 55-56.

[10] 戴志遠(yuǎn), 任明, 張燕平. 電泳和層析方法對(duì)梅魚蛋白酶解產(chǎn)物的分離分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2007, 7(4): 101-105.

[11] 孫波, 遲玉杰, 徐寧, 等. Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋清肽分子量的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(5): 385-388.

[12] 肖如武, 崔春, 趙謀明, 等. Pancreatin酶解馬氏珍珠貝肉蛋白過程中產(chǎn)物性質(zhì)研究[J]. 食品發(fā)酵與工業(yè), 2008, 34(7): 41-46.

[13] 趙謀明, 崔春, 王金水. 海產(chǎn)低值魚酶解過程中呈味物質(zhì)變化趨勢(shì)的研究[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2007(G00): 281-285.

[14] 周雪松. 雞肉蛋白酶解及其產(chǎn)物抗氧化活性研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2006.

[15] YAMASHITA M, ARAI S, TANIMOTO S, et al. Condensation reaction occurring during plastein formation by α-chymotrypsin[J]. Agric Biol Chem, 1973, 37: 953-954.

[16] 蓋云霞. 花生粕脫毒、酶解及酶解過程中氨基酸釋放規(guī)律的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2007.

Nitrogen and Taste Changes in Chicken Bone Protein during Enzymatic Hydrolysis with Flavourzyme and Tricine-SDS-PAGE Analysis of Polypeptide Degradation

ZHANG Heng，WU Ying-long*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this work, changes in nitrogen existing form, taste, free amino acid composition and the contents of delicious and bitter amino acids in chicken bone protein were investigated during enzymatic hydrolysis with Flavourzyme. The results indicated that both amino nitrogen and soluble nitrogen gradually increased with the extension of Flavourzyme-catalyzed hydrolysis, while peptide nitrogen first increased up to its maximum and then decreased. As the hydrolysis time was prolonged,the umami taste of chicken bone protein hydrolysate presented an increase, and the bitter taste gradually tended to be stale during later stages of the hydrolysis. The content of free amino acids reached its maximum level after 24 hours. Therefore, a large number of released tasty amino acids seem to be responsible for the flavor of chicken bone protein hydrolysate. Tricine-SDS-PAGE analysis showed that polypeptides were gradually degraded during the hydrolysis of chicken bone protein and that all peptide molecules in the 24 h hydrolysate had a molecular weight of less than 10.0 kD.

chicken bone protein；enzymatic hydrolysis；taste characteristics；amino acid；Tricine-SDS-PAGE

TS201.21

A

1002-6630(2011)05-0111-04

2010-05-26

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2008GA810026)

張恒(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：57296494@qq.com

*通信作者：鄔應(yīng)龍(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：wuyinglong99@163.com