微波處理對小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)的影響

張海華，朱科學(xué)，陳 曄，周惠明,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣西糧油科學(xué)研究所，廣西 南寧 530001)

微波處理對小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)的影響

張海華1，朱科學(xué)1，陳 曄2，周惠明1,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣西糧油科學(xué)研究所，廣西 南寧 530001)

采用傅里葉紅外光譜(FTIR)對小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明：微波處理后面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)隨微波功率不同而發(fā)生不同變化；通過測定FTIR光譜的羥基振動、表面疏水度以及游離巰基和二硫鍵(—SH/S—S)含量的變化間接反映微波對面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果得出經(jīng)微波處理后面筋蛋白的羥基振動峰強度減弱、疏水性顯著提高、S—S發(fā)生斷裂并轉(zhuǎn)化為—SH，這表明面筋蛋白的空間結(jié)構(gòu)賴以支撐的次級鍵受到微波的影響；借助粒徑儀、流變儀對微波處理面筋蛋白的粒徑分布以及表觀黏度進行測定，得出面筋蛋白體積粒徑減小、靜態(tài)流變表觀黏度降低，表明面筋蛋白鏈間緊密的微結(jié)構(gòu)經(jīng)微波處理后變得松散。

面筋蛋白；微波；傅里葉紅外光譜(FTIR)；疏水性；粒徑；流變特性

微波是指頻率為300MHz～300GHz的電磁波，能夠引起物料分子振動從而在分子級對物料產(chǎn)生影響。微波使食品物料中的水在高頻電磁場作用下發(fā)生隨著外電場的變化而變化的極性取向，引起分子的運動與相互摩擦，此時微波場能轉(zhuǎn)化為介質(zhì)內(nèi)的熱能，使物料溫度升高，產(chǎn)生熱化和膨化等一系列物化過程[1-2]。微波在食品工業(yè)的應(yīng)用主要是微波殺菌[3]、微波干燥[4]、微波烘焙[5]三方面。除此而外，還有微波輔助酶解[6]、微波輔助檢測[7]、微波萃取[8]、微波改性[9]等。據(jù)報道，在這些應(yīng)用中微波對物料的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，例如Byaruhanga等[10]采用FTIR對微波加熱的高粱醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)進行研究時發(fā)現(xiàn)微波加熱后高粱醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加。

面筋蛋白是小麥的主要貯藏蛋白，是由麥膠蛋白和麥谷蛋白組成的聚合體。面筋蛋白是大分子鏈蛋白，具有不同于其他蛋白的獨特的黏彈性及特殊的理化性質(zhì)，例如溶解度低、乳化性差等。因此，Yalcin等[11]采用微波法對面筋蛋白的乳化性、起泡性等理化性質(zhì)進行了改善。歸根結(jié)底，微波處理后面筋蛋白物理化學(xué)性質(zhì)的變化是由于微波引起了面筋蛋白結(jié)構(gòu)的變化。因此，本實驗以此為切入點，對微波處理面筋蛋白的結(jié)構(gòu)進行研究，以彌補微波處理面筋蛋白結(jié)構(gòu)方面信息的不足，同時期望研究結(jié)果能夠為微波對食品物料結(jié)構(gòu)影響提供參考，特別是微波烘焙食品，從而更好的控制微波食品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

小麥面筋蛋白(蛋白質(zhì)干基含量78%) 河南蓮花有限公司。

1-苯氨基萘-8-磺酸(ANS)、5,5'-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB) 美國Sigma公司；其他所用化學(xué)試劑均為分析純，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

MZG1500S型微波實驗儀 中國南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司；Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；Hitachi 650-60型熒光分光光度計日本日立公司；Mastersizer 2000激光散射粒徑儀 英國Malvern公司；AR-G2型流變儀 美國TA公司。

1.2 方法

1.2.1 微波處理小麥面筋蛋白

在室溫條件下，量取100mL去離子水置于500mL的高腳燒杯中，調(diào)整磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為300r/min。然后準確稱量6.0g小麥面筋蛋白，邊攪拌邊緩慢加入燒杯中，待小麥面筋蛋白完全加完后繼續(xù)攪拌5min使小麥面筋蛋白充分水合。調(diào)整微波爐的功率輸出分別為600、800、1000W，設(shè)置加熱時間為1min、磁力攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，此時將充分水合的小麥面筋蛋白懸浮液置于微波爐物料倉中，啟動微波按鈕。微波處理結(jié)束后，立即測量小麥面筋蛋白懸液的溫度并記錄。此后，將微波處理小麥面筋蛋白懸液冷卻、凍干，留樣待測。對應(yīng)于微波功率600、800、1000W，將微波處理小麥面筋蛋白樣品分別記為MW600、MW800、MW1000；未經(jīng)微波處理的小麥面筋蛋白作為對照樣品，記為RG。

1.2.2 微波處理小麥面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)測定

采用傅里葉變換紅外光譜測定微波處理小麥面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)。具體步驟如下：將1g小麥面筋蛋白凍干樣品與1mL重水(D2O)混合均勻，于25℃、相對濕度80%的條件下平衡48h，形成面筋糊。參照Mejri等[12]的方法，在分辨率為2cm-1、掃描次數(shù)128次/s的條件下，采用衰減全反射附件進行蛋白結(jié)構(gòu)測定。在同樣處理和掃描條件下，采用普通蒸餾水分散樣品，在2800～3800cm-1采集面筋蛋白樣品中羥基(—OH)紅外吸收信息。

1.2.3 微波處理小麥面筋蛋白的表面疏水性測定

表面疏水性(H0)是用1-苯氨基萘-8-磺酸(ANS)作為熒光探針進行測定的。稱取0.05g超聲波處理小麥面筋蛋白，溶于0.01mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液中，配成1mg/mL的分散體系。在高速均質(zhì)機上均質(zhì)1min，然后在3000r/min條件下離心15min，用Folin-酚法測定上清液中的蛋白濃度。用0.01mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液稀釋蛋白質(zhì)量濃度在0.02～0.30mg/mL之間。取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品4mL，加入20μL的ANS溶液(采用0.01mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液配制成8mmol/L的溶液)。立即采用熒光分光光度計在405nm的激發(fā)波長(狹縫5nm)和480nm的發(fā)射波長(狹縫5nm)下測定樣品的熒光強度，以熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作曲線，外推至蛋白質(zhì)濃度為0，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.2.4 —SH/S—S含量測定

蛋白質(zhì)的巰基(包括游離的和埋藏在疏水基團內(nèi)部的—SH)和總巰基基團(包括—SH和還原的S—S)含量，利用游離巰基、總巰基和二硫鍵的關(guān)系計算二硫鍵含量。

游離巰基含量的測定：取3mL約5mg/mL的蛋白質(zhì)懸液，加入3mL 0.1mol/L含有l(wèi)mmol/L EDTA和1g/100mL SDS的磷酸鹽緩沖液，再加入0.1mL 10mmol/L的DTNB，劇烈振蕩后25℃水浴1h，10000r/min離心30min。以不加DTNB的溶液為對照，取上清液于412nm波長處測定吸光度，以13600L/(mol·cm)消光系數(shù)計算巰基含量。

總巰基含量的測定：取1mL約5mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，加入0.05mL的β-巰基乙醇和4mL的尿素-鹽酸胍溶液，25℃放置1h后加入10mL 12g/100mL的三氯乙酸(TCA)，25℃再水浴1h。然后5000r/min離心10min。沉淀分散在5mL TCA中5000r/min離心10min，如此重復(fù)兩次除去β-巰基乙醇。沉淀溶解在10mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，加入0.08mL DTNB，劇烈振蕩后25℃水浴1h，并于10000r/min離心30min，取上清液于412nm波長處測定吸光度。

1.2.5 粒徑分布

將超聲處理后的樣品馬上采用馬爾文激光散射粒徑儀Mastersizer2000進行粒徑分布測定。測定參數(shù)為：進樣器Hydro2000MU(A)，光束長度2.35mm，樣品折射率1.5，設(shè)置遮光率為10%～20%，測定時遮光率為10%～15%。每個樣品平行采集6次，取平均圖譜。

1.2.6 微波處理小麥面筋蛋白的靜態(tài)流變特性測定

采用TA-G2型流變儀對微波處理小麥面筋蛋白的靜態(tài)流變特性進行測定，選用直徑20mm不銹鋼平行板，設(shè)置間隙為2mm，剪切速率為0.1～100s-1，25℃條件下測定微波處理對面筋蛋白黏度、剪切應(yīng)力隨剪切速率變化的關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。數(shù)據(jù)在P＜0.05水平上的顯著性采用SPSS 13.0 軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖1 微波處理小麥面筋蛋白的去卷積紅外酰胺I'帶圖譜Fig.1 Deconvoluted amide I' bands in FTIR spectra of microwave treated WGP

對未經(jīng)微波處理的小麥面筋蛋白的紅外光譜酰胺I'帶(1600～1700cm-1)進行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理得到7個二級結(jié)構(gòu)子峰，如圖1所示。參照Mejri等[12]在前人用FTIR研究小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對小麥面筋蛋白的7個結(jié)構(gòu)子峰進行歸屬，結(jié)果見表1。對比微波處理小麥面筋蛋白與未經(jīng)微波處理的二級結(jié)構(gòu)峰位，發(fā)現(xiàn)微波處理使得小麥面筋蛋白的各子峰發(fā)生了不同程度的藍移，其中MW800樣品藍移程度最大。根據(jù)各子峰面積占總峰面積的比等于對應(yīng)結(jié)構(gòu)含量的原則，對面筋蛋白樣品中各結(jié)構(gòu)的含量進行了計算，結(jié)果如表1所示。經(jīng)微波處理后，除面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)中1609cm-1處β-折疊含量無顯著變化和1675cm-1處β-折疊含量顯著下降外，其他峰位的結(jié)構(gòu)含量均發(fā)生了與微波功率非線性相關(guān)的變化。從表1可以看出，MW800處理顯著促進分子間β-折疊結(jié)構(gòu)(1618cm-1處)和擴展結(jié)構(gòu)(1627cm-1處)的形成，而其他兩個功率的處理更利于擴展β-折疊結(jié)構(gòu)(1638cm-1處)和α-螺旋(1650cm-1處)的形成；此外，MW600處理還促進了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(1661cm-1處)的形成。

微波對蛋白結(jié)構(gòu)的影響主要有兩方面：一是微波熱效應(yīng)，Barak等[13]認為綠熒光蛋白熒光光譜500～540nm段的變化主要是由微波熱效應(yīng)引起的，而540～560nm段的變化與傳統(tǒng)熱效應(yīng)不同；二是微波的非熱效應(yīng)，微波非熱效應(yīng)使得牛血清清蛋白形成類淀粉質(zhì)結(jié)構(gòu)[14]。微波熱效應(yīng)使得面筋蛋白懸液溫度升高(MW600：74℃；MW800：84℃；MW1000：90℃)，從而引起蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。另外，又與傳統(tǒng)加熱不同，微波引起面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的無規(guī)律變化很可能是由于微波非熱效應(yīng)作用的結(jié)果。在本研究中，由于設(shè)備限制未能直接檢測到非熱效應(yīng)，只能從實驗結(jié)果推測出非熱效應(yīng)的存在，這一點希望在以后設(shè)備滿足的條件下繼續(xù)深入研究。

表1 微波處理小麥面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)及各結(jié)構(gòu)含量Table 1 Determined frequencies of amide I' component bands, relative assigned structures and their distributions for microwave treated WGP

2.2 微波對小麥面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)主要由氫鍵、疏水作用、范德華力等非共價作用和二硫鍵支撐形成的。由于小麥面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，現(xiàn)在還無法直接進行測定，只能通過測定這些非共價作用來間接表征，因此本實驗通過測定小麥面筋蛋白的水合作用、疏水性和－SH/S－S含量來表征微波處理對小麥面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響。

2.2.1 微波對小麥面筋蛋白的水合作用的影響

紅外光譜2800～3800cm-1主要表征水的羥基鍵合，還是蛋白質(zhì)的羥基伸縮振動吸收峰。譜帶的強度表征蛋白質(zhì)水合作用的強弱，吸收越強表示水合作用越強，則樣品水合的水分子量就越多[15]。微波對小麥面筋蛋白羥基伸縮振動的影響如圖2所示。

圖2 微波處理小麥面筋蛋白的紅外羥基伸縮振動吸收帶Fig.2 Infrared spectrum in OH stretching region of microwave treated WGP

從圖2可以看出，經(jīng)微波處理后，小麥面筋蛋白的羥基伸縮振動吸收峰強度下降，且降低程度隨著微波功率增加而降低。這表明微波處理后小麥面筋蛋白的水合作用下降，即樣品水合的水分子數(shù)量下降。水合作用的降低表明微波使得面筋蛋白中與水的羥基可能形成氫鍵的鍵合位點數(shù)量的減少，從而影響了面筋蛋白的空間構(gòu)象。Banik等[1]認為微波對蛋白質(zhì)的作用有兩種可能：一種可能是微波使得蛋白質(zhì)中產(chǎn)生隨電場方向變化而變化的極化分子或離子，從而加速與其他分子間的碰撞；另一種可能是微波引起偶極子旋轉(zhuǎn)并隨著交互電場(2.450×109次/秒)的變化迅速排成一行，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的變化。當?shù)鞍踪|(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)在微波場中展開時，蛋白質(zhì)的親水基團之間發(fā)生相互作用從而水合作用下降。這也是當在28～98℃條件下采用微波提取小麥籽粒中水溶性蛋白時提取率降低的一個原因[16]。

2.2.2 微波處理對小麥面筋蛋白表面疏水度的影響

表2 微波處理小麥面筋蛋白的表面疏水度、游離—SH、S—S含量以及粒徑分布Table 2 Surface hydrophobicity (H0) and free sulfhydryl group and disulphide bond contents of microwave treated WGP

表面疏水度是表征蛋白質(zhì)表面非共價作用的一個定量指標，與蛋白質(zhì)微結(jié)構(gòu)中長波長區(qū)變化相關(guān)。從表2可以看出，小麥面筋蛋白經(jīng)微波處理后，其表面疏水度提高，而且從所得數(shù)據(jù)來看這種提高與微波的功率變化很明顯呈非線性相關(guān)的關(guān)系。表面疏水度的提高與水合作用下降一致，也和微波加熱后小麥淀粉-小麥面筋蛋白-水復(fù)配體系中水的擴散常數(shù)降低相吻合[17]。表面疏水度的提高還與小麥面筋蛋白經(jīng)微波輻照后溶解度降低有關(guān)[11]。蛋白質(zhì)的溶解度與蛋白質(zhì)表面疏水作用(蛋白與蛋白間)與親水作用(蛋白與水之間)相關(guān)，因此Qasem[18]推測經(jīng)微波處理后小麥面筋蛋白鏈間可能發(fā)生了交聯(lián)，而且這種交聯(lián)作用只限于親水基團間，而疏水基團間并沒有發(fā)生交聯(lián)作用，以至于非極性體系中的面筋蛋白相鄰分子間不能發(fā)生聚合，以至于采用微波輻照法制備的胃復(fù)安(metoclopramide)面筋蛋白緩釋載體并未能達到緩釋的目的。

Weegels等[19]采用傳統(tǒng)加熱法在面筋蛋白相對濕度13%或以上加熱面筋蛋白時，發(fā)現(xiàn)面筋蛋白的疏水度呈下降趨勢。傳統(tǒng)加熱法與微波加熱所得結(jié)果的不同是由于兩種加熱方式的熱量傳遞方式不同。傳統(tǒng)加熱時，熱量是通過熱梯度的形式傳遞的；而微波加熱時，熱量是由電磁能轉(zhuǎn)化而來，是熱能轉(zhuǎn)化而不是傳遞[2]。

2.2.3 微波處理對面筋蛋白中游離巰基(—SH)和二硫鍵(S—S)含量的影響

面筋蛋白中的半胱氨酸通過巰基的氧化作用形成二硫鍵，這些二硫鍵對面筋蛋白緊密的結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定支撐作用。面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)中的二硫鍵可以是鏈間的或者鏈內(nèi)的。經(jīng)微波處理后，面筋蛋白鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵含量在顯著降低(P＜0.05)，而游離巰基含量顯著提高(表2)。結(jié)果還表明，二硫鍵的斷裂與微波功率成正相關(guān)關(guān)系。微波通過電磁場能引起物料內(nèi)部分子間發(fā)生摩擦，物料原子間的摩擦引起分子間共價鍵或非共價鍵的斷裂[2]。因此，認為二硫鍵的斷裂也是面筋蛋白分子間摩擦的結(jié)果。在二硫鍵含量的變化上，微波處理與傳統(tǒng)熱處理[20]所得結(jié)果不同。

2.3 微波處理對小麥面筋蛋白微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 微波處理對小麥面筋蛋白懸液粒徑分布的影響

面筋蛋白主要有麥醇蛋白和麥谷蛋白組成，其中麥谷蛋白對小麥粉的烘焙品質(zhì)非常重要。麥谷蛋白在小麥面團中以大分子聚合體形式存在，其中包裹/交聯(lián)著麥醇蛋白，因此測量面筋蛋白的粒徑分布對于研究麥谷蛋白-麥醇蛋白形成的大分子聚合體的形態(tài)非常重要。Don等[21]認為麥谷蛋白聚合體粒徑在10-1～102μm之間，這一點與本研究所測結(jié)果一致(見表2的D[3,2])。經(jīng)微波處理后，面筋蛋白的表面積平均粒徑D[3,2]顯著增大，而體積平均粒徑D[4,3]除MW600外都顯著減小。根據(jù)Dona等[22]對熱處理麥谷蛋白大分子聚合體粒徑的影響研究結(jié)果，當降低麥谷蛋白中高分子質(zhì)量(high molecular weight，HMW)亞基和低分子質(zhì)量(low molecular weight，LMW)亞基的比例時，麥谷蛋白大分子聚合體的D[3,2]顯著增加。因此推論微波處理后面筋蛋白D[3,2]的顯著增大可能是由于麥谷蛋白大分子聚合體中HMW/LMW降低的原因。然而，F(xiàn)arag等[23]在研究微波輻照牛肝蛋白時認為微波輻照使得牛肝蛋白的LMW含量降低，相應(yīng)的聚合成HMW從而導(dǎo)致HMW含量提高。不一致的結(jié)論可能是由于蛋白質(zhì)本身差異引起的。

2.3.2 微波處理對小麥面筋蛋白靜態(tài)流變特性的影響

雖然分子質(zhì)量與面筋蛋白之間的確切關(guān)系還不清楚，但是黏度被認為與面筋蛋白的各亞基的結(jié)構(gòu)及其相互作用有關(guān)[24]。因此測定了不同剪切速率下微波處理面筋蛋白的表觀黏度及應(yīng)變的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 微波處理小麥面筋蛋白的黏度、應(yīng)變與剪切速率關(guān)系圖Fig.3 Viscosity and strain of microwave treated WGP as a function of shear rate

如圖3所示，經(jīng)微波處理后面筋蛋白的表觀黏度降低，應(yīng)變增大。表觀黏度的降低表明微波引起了面筋蛋白亞基結(jié)構(gòu)的變化，且削弱了亞基間的相互作用。這一點與D[4,3]的降低一致。應(yīng)變表示物料在力的作用下形變的大小，面筋蛋白經(jīng)微波處理后應(yīng)變增大，說明面筋蛋白的形變增大，這也間接說明面筋蛋白聚合體組分間結(jié)合程度的減弱，進而面筋蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)變得松散。

3 結(jié) 論

采用FTIR法測定的微波處理面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)，和由2800～3800cm-1處紅外羥基伸縮振動峰的強度、疏水結(jié)合位點的數(shù)量以及二硫鍵含量表征的三級結(jié)構(gòu)，以及由粒徑分布、流變表觀黏度反映的微結(jié)構(gòu)的分析，得出微波通過削弱面筋蛋白分子間或分子內(nèi)的非共價作用以及二硫鍵的斷裂作用，使得面筋蛋白緊密的結(jié)構(gòu)變得松散、原來聚合結(jié)構(gòu)變得伸展。

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Effect of Microwave Treatment on Structure of Wheat Gluten Protein

ZHANG Hai-hua1，ZHU Ke-xue1，CHEN Ye2，ZHOU Hui-ming1,*
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Guangxi Scientific Research Institute of Cereal and Oil, Nanning 530001, China)

Analysis of the effect of microwave treatment at different levels of power on the secondary structure of wheat gluten protein(WGP) was carried out using FTIR. The results showed that the secondary structure of WGP varied with different levels of microwave power. To indirectly figure out the effect of microwave on the spatial structure of WGP, changes in the hydroxyl stretching intensity,surface hydrophobicity, and free sulfhydryl group and disulphide bond contents of WGP were measured before and after microwave treatment. A decrease in hydroxyl stretching intensity, an increase in surface hydrophobicity, the breaking of disulphide bond and its conversion into sulfhydryl group were observed for WGP after microwave treatment. From these results, it could be concluded that microwave has an impact on the secondary bonds deciding the spatial structure of WGP. Furthermore, the particle distribution and apparent viscosity of microwave treated WGP were determined, and the results of decreases in volume particle size and in apparent viscosity demonstrated that the compact structure of WGPwere disrupted and became incompact.

wheat gluten protein (WGP)；microwave；fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)；surface hydrophobicity；particle distribution；rheological properties

TS201.7

A

1002-6630(2011)05-0065-05

2010-06-19

國家“863”計劃項目(2008AA10Z312)；江南大學(xué)博士基金項目

張海華(1982—)，女，博士，研究方向為方便食品及品質(zhì)改良。E-mail：zhanghaihua2008@yahoo.com.cn

*通信作者：周惠明(1957—)，男，教授，博士，研究方向為方便食品及品質(zhì)改良。E-mail：hmzhou@jiangnan.edu.cn