可德蘭寡糖的制備及其組分分析

傅赟彬，劉啟順，李曙光，張建平，白雪芳，趙小明，杜昱光,

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物與糖工程1805組，遼寧省碳水化合物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049)

可德蘭寡糖的制備及其組分分析

傅赟彬1,2，劉啟順1，李曙光1，張建平1,2，白雪芳1，趙小明1，杜昱光1,*

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物與糖工程1805組，遼寧省碳水化合物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049)

目的：可德蘭多糖是目前發(fā)現(xiàn)的唯一不含分支的線性β-1,3-葡聚糖，由于難溶于水而限制其生物活性的研究，為此對可德蘭寡糖的制備及其組分進(jìn)行研究。方法：采用化學(xué)法酸解可德蘭多糖。結(jié)果：通過紅外光譜與基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)的檢測，結(jié)果表明：可德蘭多糖降解后結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，降解產(chǎn)物的聚合度為2～19，其中聚合度為5的成分含量最高；高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測法分析結(jié)果表明：反應(yīng)溫度105℃、反應(yīng)時(shí)間150～180min是降解可德蘭寡糖的合理反應(yīng)條件，降解效果最佳。結(jié)論：本研究建立的方法可簡單、高效的降解可德蘭多糖，制備其寡糖。

可德蘭多糖；可德蘭寡糖；紅外光譜；基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測法

可德蘭多糖是Alcaligenes faecalis var myxogenes 10c3發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖[1]，其結(jié)構(gòu)為β-(1→3)糖苷鍵連接而成的葡聚糖，如圖1所示。

該多糖是迄今為止自然界中唯一發(fā)現(xiàn)的一種不含分支的β-1,3-葡聚糖?？傻绿m多糖為白色粉末，不溶于水和醇類，可溶于堿性溶液和二甲基亞砜[2]。可德蘭多糖具有獨(dú)特的凝膠特性，其水溶液根據(jù)加熱溫度的高低，形成熱可逆凝膠和熱不可逆凝膠[3]，在制備需要增稠的食品時(shí)可作為膨脹劑或者天然植物膠的替代品，已被廣泛用在食品工業(yè)。然而，可德蘭多糖在水溶液中所具有的剛性三螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的不溶于水的特性限制了它的廣泛應(yīng)用[4]。

圖1 可德蘭多糖的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of curdlan

多糖通過酶降解或化學(xué)法降解為寡糖，增加了水溶性，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，并提高了生物活性?？傻绿m多糖降解為可德蘭寡糖(curdlan oligomers，CRDO)導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞和分子質(zhì)量的降低，其水溶性大大增強(qiáng)。隨著人們對寡糖的日益關(guān)注，CRDO及其衍生物的生物活性逐漸被揭示。Hida等[5]發(fā)現(xiàn)CRDO能夠刺激小鼠白細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而激活免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。有研究人員發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)可德蘭多糖后，小鼠盲腸內(nèi)的短鏈脂肪酸和雙歧桿菌的數(shù)量都有明顯增加，認(rèn)為小鼠大腸內(nèi)可德蘭多糖被降解得到的CRDO可能與已知的益生源——果寡糖和木寡糖一樣有調(diào)節(jié)腸道菌群的功效，具有開發(fā)為益生源產(chǎn)品的潛力[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，從海帶中提取的β-1,3-葡寡糖結(jié)構(gòu)的海帶五糖是誘導(dǎo)植物抗病性的最小基本結(jié)構(gòu)單元，該成分與聚合度(degree of polymerizaiton，DP) 5的CRDO具有相同的結(jié)構(gòu)[7-8]。香菇多糖(lentinan)也是β-1,3-葡聚糖家族成員之一，已經(jīng)作為輔助藥物用于臨床治療癌癥[9]。我國目前批準(zhǔn)的兩個(gè)香菇多糖藥物都是通過β-(1→3)糖苷鍵連接、含有β-(1→6)側(cè)鏈的葡寡糖，其中香菇六糖對實(shí)體瘤和腹水瘤的抑瘤率高達(dá)到50%[10]。大多數(shù)β-1,3-葡寡糖與CRDO的區(qū)別在于是否存在側(cè)鏈，CRDO的制備有助于從結(jié)構(gòu)上了解相關(guān)葡寡糖的特性，為揭示寡糖結(jié)構(gòu)和生物活性之間的關(guān)系提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可德蘭寡糖的制備，但都存在各種不足。Wang等[11]在非均相體系中對可德蘭多糖進(jìn)行醋酸水解時(shí)，制備得到的絕大部分為二糖，產(chǎn)率只有27%；Grandpierre等[12]使用硫酸和三氟乙酸分別水解可德蘭多糖90h后，發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)率只有25%，且兩者對于設(shè)備的腐蝕性嚴(yán)重；另外，使用木霉發(fā)酵液降解，存在反應(yīng)時(shí)間長，效率低的問題，且只能得到DP 2～6的聚合度較低的寡糖。因此，建立反應(yīng)快速、效率高，同時(shí)可根據(jù)要求制備不同DP的降解方法勢在必行。

本實(shí)驗(yàn)以可德蘭多糖為原料，在二甲基亞砜的均相體系中采用鹽酸降解多糖制備CRDO。通過紅外光譜比較降解前后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，MALDI-TOF MS檢測組分的相對分子質(zhì)量、相對分子質(zhì)量分布，更進(jìn)一步確定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及確定最佳反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可德蘭多糖(食品級(jí)) 日本武田-麒麟食品公司；NaOH、醋酸鈉(分析純) 美國Acros Organics公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC系統(tǒng)采用的脈沖安培檢測器系統(tǒng)(包括兩個(gè)582型泵、PEEK梯度混合器和脈沖阻尼器、542型自動(dòng)進(jìn)樣器、5600A型16通道脈沖安培檢測器及Coul Array for Windows數(shù)據(jù)處理軟件) 美國ESA公司；Vector 22 FTIR光譜儀 德國Bruker公司；Autoflex質(zhì)譜儀分析 德國Bruker Daltonics 公司。

1.3 方法

1.3.1 酸法降解可德蘭多糖制備CRDO的方法

稱取5g可德蘭多糖于60mL二甲基亞砜溶液中充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，分別在不同溫度下緩慢滴加入1mol/L鹽酸3mL，分別在反應(yīng)時(shí)間30、60、90、120、150、180、240min時(shí)取樣用于后續(xù)分析；調(diào)節(jié)pH值至中性，攪拌中用丙酮沉淀，得到乳白色粉末，抽濾后用丙酮洗3～5遍，于50℃條件下真空干燥得可德蘭多糖的降解產(chǎn)物。

1.3.2 紅外光譜表征CRDO的性質(zhì)

樣品用溴化鉀壓片，使用紅外光譜分析儀比較可德蘭多糖與寡糖圖譜，分析結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。

1.3.3 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF MS)測定寡糖含量

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法適當(dāng)修改。

質(zhì)譜條件：氮?dú)饧す獠ㄩL為337nm，加速電壓范圍在+20～－20kV，基質(zhì)為2,5-二羥基苯甲酸水溶液(DHBA，10mg/mL)和10mmol/L NaCl溶液，樣品靶是384孔點(diǎn)的拋光不銹鋼靶。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)都在正離子反射模式下進(jìn)行，延遲萃取時(shí)間為100ns，每張質(zhì)譜圖為50次激光信號(hào)累加所得，樣品分子質(zhì)量由標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法校正。

1.3.4 高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測法(HPAECPAD)

表1 溶劑梯度與洗脫流速Table1 Solvent gradient and flow rate

色譜柱：美國Dionex公司CarboPacTMPA-100柱(250mm×4mm)；梯度洗脫方式為：流動(dòng)相A：100mmol/L NaOH；流動(dòng)相B：100mmol/L NaOH和500mmol/LCH3COONa，洗脫梯度見表1。柱溫和脈沖安培檢測器的溫度維持在30℃；進(jìn)樣量10μL；脈沖電勢及電極持續(xù)時(shí)間如下：E1=+200mV(t1=300ms)；E2=+700mV(t2=100ms)；E3= － 900mV(t3=100ms)，Coul Array for Windows數(shù)據(jù)處理軟件分析結(jié)果。

1.3.5 CRDO相對含量的計(jì)算方法

本實(shí)驗(yàn)所述的CRDO聚合度為2～10，其相對含量可根據(jù)HPAEC-PAD檢測的色譜峰的積分面積進(jìn)行計(jì)算，具體計(jì)算方法見公式1。

式中：Si為各個(gè)組分色譜峰的積分面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

圖2 可德蘭多糖和CRDO的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of curdlan and C1RDO

如圖 2所示，可德蘭多糖及降解產(chǎn)物在890cm-1處都存在特征峰，這表明兩者的糖苷鍵均為β構(gòu)型；1370、2920cm-1處的特征峰說明兩者是具有β-(1→3)糖苷鍵的葡聚糖[14-16]。與可德蘭多糖相比，本方法制備得到的CRDO并沒有產(chǎn)生新的吸收峰。這表明酸法降解得到的CRDO的基本結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

2.2 MALDI-TOF MS 分析結(jié)果

用MALDI-TOF MS測定可德蘭多糖的降解產(chǎn)物可以便捷、直接、快速地同時(shí)提供樣品的相對分子質(zhì)量、相對分子質(zhì)量分布、重復(fù)單元結(jié)構(gòu)和端基結(jié)構(gòu)等多種信息[17-18]，已被廣泛用于糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。m/z值為寡糖分子質(zhì)量與Na+離子的加成峰。由圖3可知，降解產(chǎn)物中含有DP 2～19的成分，其中可德蘭五糖含量最多，四糖、六糖含量次之。從此數(shù)據(jù)可以看出，酸降解CRDO的方法是切實(shí)可行的，得到的產(chǎn)物純度高，降解副產(chǎn)物較少。

圖3 可德蘭多糖降解產(chǎn)物的MALDI-TOF圖譜Fig.3 MALDI-TOF MS spectrum of the degradation product of curdlan

2.3 HPAEC-PAD分析結(jié)果

圖4考察了反應(yīng)溫度為95～115℃時(shí)，不同降解時(shí)間CRDO的相對含量變化情況。

圖4 HPAEC-PAD法檢測不同反應(yīng)時(shí)間CRDO組分相對含量的變化圖Fig.4 Changes of the relative proportion of CRDO by HPAEC-PAD at different time during the degradation of curdlan

圖4 A可以看出95℃時(shí)多糖的降解效果較差，反應(yīng)4h后得到的白色粉末中仍有部分不溶于水的顆粒，色譜檢測發(fā)現(xiàn)CRDO含量為64.66%。

圖4B為105℃條件下可德蘭多糖的降解情況?？梢钥闯龇磻?yīng)初期多糖降解不充分，所得的CRDO的相對含量僅為40.39%，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，CRDO相對含量越來越多，180min時(shí)達(dá)到最大值，含量為79.95%。此時(shí)，CRDO的收率為62.08%。當(dāng)反應(yīng)240min時(shí)，相對含量開始呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖4C為115℃條件下，CRDO的相對含量變化情況。相對于95℃和105℃而言，溫度升高有利于多糖的降解。90min時(shí)，相對含量達(dá)到77.19%，在90～150min內(nèi)含量變化相對較小。180min時(shí)，含量開始明顯下降，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到240min時(shí)，DP2～10的含量僅為35.11%?？赡苁怯捎诜磻?yīng)時(shí)間過長可德蘭多糖降解成單糖或高溫導(dǎo)致某些副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖5 反應(yīng)溫度為105℃時(shí)HPAEC-PAD法檢測不同反應(yīng)時(shí)間降解產(chǎn)物的組分變化圖Fig.5 Multi-file analysis of the degradation of curdlan at 105℃ by HPAEC-PAD at different time

圖5 為反應(yīng)溫度為105℃時(shí)不同時(shí)間各個(gè)組分的比例情況。降解反應(yīng)30min時(shí)，得到的寡糖含量較少，且以高DP的寡糖為主。隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，多糖不斷被降解，低DP的寡糖含量逐漸增高，反應(yīng)150～180min時(shí)CRDO含量最高，為最佳反應(yīng)時(shí)間。

綜合圖4、5可以看出，反應(yīng)時(shí)間和溫度對于CRDO的DP比例和含量有很大的影響。在95℃條件下反應(yīng)4h后，仍然有部分可德蘭多糖未完全降解。115℃時(shí)降解速率最快。然而，高溫反應(yīng)對于設(shè)備要求更高，易導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生。所以反應(yīng)溫度為105℃，反應(yīng)時(shí)間為150～180min是比較合理的反應(yīng)條件。

3 結(jié) 論

本研究建立一種在二甲基亞砜的均相體系中，以稀鹽酸高效降解可德蘭多糖制備CRDO的方法。通過紅外光譜和MALDI-TOF MS檢測發(fā)現(xiàn)降解得到的寡糖結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，因此本方法在不影響產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上可用于制備寡糖的研究；從結(jié)果中可知，可德蘭多糖的降解產(chǎn)物DP2～19，其中DP5的成分含量最高，其次是四糖和六糖。HPAEC-PAD法檢測降解產(chǎn)物組成表明反應(yīng)溫度105℃，反應(yīng)150～180min的降解效果最佳。本方法較之前報(bào)導(dǎo)的酸解制備CRDO來說[12]，具有高效、快速的降解特點(diǎn)。同時(shí)，本方法能根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的改變得到DP相對較高的寡糖，克服了酶法制備的CRDO聚合度較低的缺點(diǎn)。

本方法制備的CRDO結(jié)構(gòu)清晰，為進(jìn)一步制備寡糖標(biāo)準(zhǔn)品、作為寡糖中間體合成其他藥物以及與其他種類葡寡糖進(jìn)行對比，從機(jī)理方面深層次地探討CRDO及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系提供參考。國內(nèi)尚無此項(xiàng)研究的相關(guān)報(bào)道，本研究建立的用均相體系制備CRDO的方法具有可靠、高效、快速的特點(diǎn)，對于今后大規(guī)模制備可德蘭寡糖具有理論和現(xiàn)實(shí)意義，并為我國CRDO的活性研究和開發(fā)利用提供了一定的參考。

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Preparation and Component Analysis of Curdlan Oligomers

FU Yun-bin1,2，LIU Qi-shun1，LI Shu-guang1，ZHANG Jian-ping1,2，BAI Xue-fang1，ZHAO Xiao-ming1，DU Yu-guang1,*
(1. Liaoning Provincial Key Laboratory of Carbohydrate, Natural Products and Glyco-Biotechnology Group 1805, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China)

Beta-1,3-glucan possesses extensive application and application values due to diverse biological activity. Curdlan,an extracellular bacterial polysaccharide, is a linear beta-1,3-glucan, and its water insolubility significantly limits its application.The aim of this study was to prepare the soluble curdlan oligomers (CRDO) for biological activities assay. In the homogeneous solution, CRDO structure change by acid hydrolysis and the influence of different factors on the degradation of curdlan measured by HPAEC-PAD was investigated. Compared with curdlan, the structure of CRDO was not changed measured by FTIR spectrometer and MALDI-TOF MS, and the degree of polymerization (DP) of CRDO obtained was 2－19 with the most abundance of DP 5. The reaction condition including the time and temperature of acid hydrolysis was optimized to 105 ℃ for 150－180 min. Therefore, the method described in this study is highly efficient for the rapid degradation of curdlan into CRDO.

curdlan；curdlan oligomers；fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR spectroscopy)；matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)；high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD)

TS201.2

A

1002-6630(2011)03-0006-04

2010-05-27

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10A213；2007AA091601；2006AA100313)；中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KSCX2-YW-G-041)；農(nóng)業(yè)部公益性(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903052)；科技部重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2009ZX09501-011)

傅赟彬(1983—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)楣烟枪δ芑钚?。E-mail：fuyunbin@dicp.ac.cn

*通信作者：杜昱光(1963—)，男，研究員，研究方向?yàn)樘巧飳W(xué)和糖工程。E-mail：articles1805@gmail.com