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    2010年北京市延慶縣首批流感病例樣的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)

    2011-10-16 12:36:40北京市延慶縣疾病預(yù)防控制中心102100崔玉娟任淑敏蘇東霞
    首都食品與醫(yī)藥 2011年18期
    關(guān)鍵詞:探針核酸標(biāo)本

    北京市延慶縣疾病預(yù)防控制中心(102100)崔玉娟 任淑敏 蘇東霞

    2010年11月2日,北京市延慶縣某小學(xué)出現(xiàn)了15例不明原因發(fā)熱癥狀兒童病患,主要臨床癥狀為發(fā)熱(體溫37.5℃以上)、咳嗽等。為查明疫情原因、制定有效的防治措施,及時(shí)控制、撲滅疫情并提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù),本縣疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、甲型H1N1流感病毒等亞型檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 樣本采集 用帶有無(wú)菌聚丙烯纖維頭及聚丙烯桿的拭子采集發(fā)病3天內(nèi)的病例咽拭子12份,于4℃保存下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2 主要試劑與儀器 QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit、AgPath-IDTm onestep RT-PCR Kit(美國(guó)ABI公司)、引物(fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1、RNP由北京市CDC 提供)、QIAGENQIAvac 24 Plus(德國(guó)QIAGEN公司)、離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)、生物安全柜(上海東聯(lián))、AB 7500 fast PCR System(美國(guó)ABI公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 樣本預(yù)處理 將12份咽拭子在渦旋振蕩器上充分震蕩混勻,室溫靜置10min。

    1.3.2 核酸提取 分別取200μl預(yù)處理好的標(biāo)本依照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取,最后分別得到60μl樣本核酸作為擴(kuò)增模板。

    1.3.3 核酸擴(kuò)增 按照ABI公司的AgPath-IDTm one-step RTPCR Kit試劑盒說(shuō)明書對(duì)12份核酸樣本進(jìn)行real-time RT-PCR擴(kuò)增。選擇FAM熒光檢測(cè)模式。

    1.3.4 結(jié)果判斷 陰性對(duì)照:無(wú)擴(kuò)增曲線,無(wú)CT值或0。陽(yáng)性對(duì)照:有擴(kuò)增曲線,CT值<30。檢測(cè)樣本:樣本有典型的擴(kuò)增曲線且CT值≤37,報(bào)告樣本陽(yáng)性。見附表1。

    2 結(jié)果

    12份病例樣本完成PCR擴(kuò)增后,其擴(kuò)增曲線顯示:8份樣本為fluA、RNP及H3同時(shí)陽(yáng)性,1份樣本七種引物探針核酸擴(kuò)增均陰性,3份樣本僅RNP引物探針核酸擴(kuò)增陽(yáng)性。見附表2、附圖。

    3 討論

    Real-time RT-PCR是將熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET) 應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中,通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極與偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán),受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA或RNA產(chǎn)量成正比,檢測(cè)PCR過(guò)程的熒光訊號(hào)便可得知靶序列初始濃度,從而達(dá)到定量目的[1][2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1995年由美國(guó)PE公司推出后,Heid[3]等首先就其原理方法進(jìn)行了報(bào)道。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、PCR污染少、快速簡(jiǎn)潔、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[4],可在3~4h內(nèi)得到擴(kuò)增結(jié)果。目前已在動(dòng)植物基因工程、微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[5],已經(jīng)成為基層實(shí)驗(yàn)室快速檢驗(yàn)的重要手段。

    附表1 結(jié)果判斷原則

    附表2 12份病例樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果

    附圖 12份樣本的real time RT-RCR擴(kuò)增曲線

    在流感樣的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)中,本研究利用fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1等6種引物探針來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)流感的分型分析。研究中還引入RNP引物探針作為內(nèi)標(biāo),檢測(cè)人細(xì)胞中的RnaseP基因,從而判斷樣本采集及核酸提取是否合格。只有在采集的樣本合格的前提下,才能進(jìn)一步分析得知。12份病例樣本的核酸擴(kuò)增結(jié)果顯示,1號(hào)樣本RNP擴(kuò)增結(jié)果為陰性,說(shuō)明這份樣本并未采集到患者的咽部上皮細(xì)胞,為無(wú)意標(biāo)本。因此,不能說(shuō)明1號(hào)病例是否為流感病例。

    同一起聚集性疫情中,病例的臨床癥狀相似,理論上其樣本的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該一致,但實(shí)際上有時(shí)會(huì)有差異。跟樣本采集的質(zhì)量有關(guān),若沒有采集到病例的咽部上皮細(xì)胞,則會(huì)得到陰性檢測(cè)結(jié)果;跟采樣的時(shí)間也有密切的關(guān)系,應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集,一般采集發(fā)病3日內(nèi)的標(biāo)本。此外,由于RNA不穩(wěn)定,極易降解,采集到的標(biāo)本應(yīng)在4℃下立即送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),如不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)在-20℃或-80℃下冷凍保存。臨床標(biāo)本運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)避免反復(fù)凍融,若標(biāo)本運(yùn)輸保存不當(dāng),則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增試劑的靈敏度也是影響檢測(cè)結(jié)果的一個(gè)重要因素,不同的檢測(cè)試劑盒其引物探針的靈敏度不同,最后所得到的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有一定差別。

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